CN102533818A - 一种蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌普鲁兰酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，该基因编码一种普鲁兰酶，该酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，该普鲁兰酶能水解淀粉中的α-1，6-糖苷键，不水解α-1，4-糖苷键，是一种I型普鲁兰酶，利用该基因生产的重组普鲁兰酶可以应用于淀粉加工中水解淀粉或者糊精中的α-1，6-糖苷键以提高淀粉的利用率，该普鲁兰酶是一种中性的普鲁兰酶适合用于配合α-淀粉酶和β-淀粉酶生产麦芽糖，提高麦芽糖和含量淀粉的水解率。

Description

一种蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及一种来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的普鲁兰酶基因，该基因表达的海藻糖合成酶可以用于淀粉制糖中提高淀粉原料的利用率，从而提高生产效率。

背景技术

淀粉是一种天然高分子化合物，也是一种重要的工业原料，广泛存在于植物的根、茎或种子中。天然的淀粉主要由直链淀粉与支链淀粉组成，直链淀粉所占比例较少，约为20％，大部分为支链淀粉，约为80％。从结构上来讲，支链淀粉是一个具有树枝形分支结构的葡聚糖，一般由1000-300,000个葡萄糖单位连接而成，分子量约为100万，有些可达600万。支链淀粉的结构为高支化聚合物，葡萄糖单位通过α-1，4-糖苷键连接成一直链，在直链上又可通过α-1，6-糖苷键形成侧链，在侧链上又会出现另一个分支侧链。主链中每隔6-9个葡萄糖单位就有一个分支，每一个支链平均含有约15-18个葡萄糖残基，平均每24-30个葡萄糖残基中就有一个非还原尾基。工业上应用的大部分淀粉质原料中支链淀粉占总淀粉质量约为70以上，最常用的玉米淀粉中占74％，马铃薯淀粉中占76％，木薯淀粉83％，而糯米淀粉的支链淀粉含量最高达100％。支链淀粉中约含有4～5％的α-1，6-糖苷键，淀粉加工领域的α-淀粉酶和β-淀粉酶和糖化酶等葡萄糖淀粉酶对α-1，4糖苷键的分解非常容易，但对于α-1，6糖苷键的分解很慢，所以α-1，6-糖苷键的存在阻碍淀粉的分解，影响到淀粉的利用率和产品的质量，因此在淀粉加工过程都需要添加脱支酶来加快的淀粉的水解速度和提高淀粉的利用率。

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一种脱支酶，它能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6-糖苷键，形成α-1，4糖苷键的直链淀粉，在以淀粉为原料的制糖加工业中，可以显著提高淀粉原料的利用率，降低生产成本和提高产品质量。在淀粉水解过程中，利用普鲁兰酶与α-淀粉酶、糖化酶配合使用，将淀粉彻底降解为葡萄糖对生产高质量的葡萄糖特别是医用葡萄糖时特别重要。在生产麦芽糖生产中用普鲁兰酶将支链淀粉脱支而形成短的直链淀粉片段，有利于β-淀粉酶的作用，减少β-极限糊精的形成，从而提高麦芽糖的含量，所以普鲁兰酶在生产含量在70％的以上的超高麦芽糖浆中极为重要。

1961年Bender和Wallenfels通过产气气杆菌(Aerobacter.aerogenes)发酵获得普鲁兰酶以后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。近年来，国内对普鲁兰酶的研究主要集中在耐酸耐热高产菌株的筛选及基因的克隆与表达。国内食品工业上所用的普鲁兰酶均是从丹麦NOVO进口

普鲁兰酶的来源有很多种，包括产气气杆菌、放线菌、酸假孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、栖热水生菌等。但是这些来源的普鲁兰酶其酶学性质与淀粉工业耐酸(pH4.6)、耐热(75℃)的要求相差较大，因此，目前国内外大多数普鲁兰酶研究工作主要集中在通过各种方法获得优良普鲁兰酶产生菌种上，而短小芽孢杆菌正是研究的热点之一。其中来源于Brevibacillus brevis和Bacillusderamificans的普鲁兰酶已经实现商业化生产。B.brevis普鲁兰酶由经过遗传改良的B.brevis直接发酵生产；B.deramificans的普鲁兰酶则使用地衣芽胞杆菌重组菌进行生产，生产水平在100单位/mL发酵液～400单位/mL发酵液不等。目前国际上普鲁兰酶的工业化生产被丹麦垄断，我国仅局限于实验室研究，且酶活较低，所以开发普鲁兰酶对食品加工领域具有重要的工业价值。

通过检索，还查到有关普鲁兰酶的一些科技文献：中国专利申请201010256287.6公开了一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用，筛选到一株具有普鲁兰分解能力的芽孢杆菌Bacillus sp.042，利用反向PCR技术克隆了普鲁兰酶编码基因pulA042编码区完整序列，序列分析显示该基因编码区全长2571碱基，编码一856个氨基酸残基的多肽链，多肽链N端32个氨基酸残基组成一典型的信号肽，因此基因pulA042编码一种胞外普鲁兰酶。Bacillus sp.042普鲁兰酶基因pulA042的表达产物具有分解普鲁兰和红色普鲁兰的活性，能降解淀粉中α-1，6糖苷键，不降解α-1，4糖苷键，是一种I型普鲁兰酶。利用基因pulA042生产的重组酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷键。

中国专利申请200510048613.3公开了一种普鲁兰酶产生菌及制备方法。菌种分类命名为脂环酸芽孢杆菌Alieycloeacillus，其保藏登记号为：CGMCCNo.1504。分离得到的菌株D-1，经鉴定为脂环酸芽孢杆菌属的一个新种，其所产普鲁兰酶在pH3.5-4.5之间，极为稳定，当pH高于5.0和低于3.0，酶活开始迅速失活。当pH4.0时，酶液在60℃放置24hr后，残余酶活力为88％，最适温度为60℃，在温度55℃-65℃的范围内，酶活性变化不大，酶反应不需要金属离子的参与，说明此酶适合应用于淀粉加工的糖化阶段。相比较而言，比已报道的酸性普鲁兰酶有更好的耐热特性和pH稳定性。

中国专利申请201010101281.1公开了一种普鲁兰酶及其生产方法。属于作用在α-1，6-糖苷键上的淀粉水解酶。a.酶学特性：最适pH 3.8～4.4，稳定pH 3.5～4.5；最适作用温度为50℃-65℃；b.选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为产酶菌种，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC编号10185)，采用底料与补料复合加料方式，液态发酵工艺制备，达到如下工艺技术指标：①产品酶活力：≥1100u/ml，②发酵周期72-80小时，③液体酶回收率≥86.5％。提供了一种耐热、耐酸性能好，酶活力高、性能稳定而且价格较低的普鲁兰酶产品，及其发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的液态生物发酵生产方法。适用于以淀粉为原料的发酵工业以及改性淀粉产品、直链淀粉、高直链淀粉制造。

这些专利公主要是产普鲁兰酶微生物的筛选和鉴定，虽然也给出了一些通过微生物分离及克隆普鲁兰酶基因的方法，但这普鲁兰酶基因的菌种来源不同，DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量不同，酶学特性和活力都有很大的差异，且都没有得到绝对优势的基因和相关专利，也没有应用于工业的报道，酶学特性不同最适合的应用的领域也不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶基因及其应用，它能够提高淀粉糖化中的麦芽糖含量，提高淀粉的水解率，从而提高淀粉的利用率。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明从蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌属克隆到一个新的普鲁兰酶基因，不仅来源不同，基因DNA序列不同，表达的普鲁兰酶氨基酸序列不同，酶学特性也不同。

本发明人利用生物信息手段对GenBank中庞大的DNA序列和氨基酸序列资源进行同源性检索分析，对已经完成序列分析的上千种微生物的DNA序列进行大量核酸序列进行分析和对比，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是某功能蛋白质”的极为有用基因，推测该序列的功能，然后找到候选基因序列进行实验的功能鉴定，最终确定基因的功能和性质，其中包括至今为止人们并未发现的鲁兰酶，并用这种鲁兰酶基因经过克隆和进行重组表达，重组表达的鲁兰酶可用于淀粉生产。

本发明人在分析不同来源普鲁兰酶基因的同源性过程中，对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌属基因组序列进行同源检索分析时，发现ID号为GI：225785631这一段DNA序列尚未有文献报道其功能的，这段DNA序列在Genbank中被注释为“假定的普鲁兰酶基因”(putative pullulanase)。经过分析这段DNA序列与已经有文献报道的糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有较高的同源性，同源性达到70％以上，所以很难通过序列同源性分析来确定这段序列是哪一种酶，必须要经过具体实验来鉴定这段基因的功能，确认其是什么酶，目前也还没有该基因功能的实验鉴定相关报道。

本发明所述的普鲁兰酶基因克隆自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌，菌种可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，菌种编号为10184，也可以通过野外采集和其他途径获得。

普鲁兰酶的分子量和酶学特点具有多样性，本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势：

1、与目前已经商品化的普鲁兰酶是属于酸性普鲁兰酶(最适反应pH在4.0～5.0)相比，本发明的普鲁兰酶是一种中性的普鲁兰酶，其最适反应pH在6.0～7.5，这与目前主要商品化的α-淀粉酶和β-淀粉酶的最适反应pH的6.0～7和很相近，所以特别适合用于配合α-淀粉酶和β-淀粉酶生产麦芽糖，提高麦芽糖和含量淀粉的水解率，在生产工艺中可以是三种酶同时保持最适的反应pH条件，可以减少pH的调节，减少酸碱的使用，从而有利于简化工艺和降低生产成本。

2、与中国专利申请号201010256287.6的856个氨基酸相比，本发明只有822个氨基酸，分子量更小更有利重组表达生产重组的普鲁兰酶。

附图说明

图1是不同温度对本发明所述蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶活力的影响曲线图。

图2是不同pH对本发明所述蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶活力的影响曲线图。

图3是Ca²⁺对本发明所述蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶热稳定性的影响曲线图。

图4是本发明所述蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶对不同底物的活力分析曲线图。

图5是的金属离子对本发明所述蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶活性的影响曲线图。

图6是本发明所述蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶对淀粉的水解糖化影响曲线图。

具体实施方式

以下是本发明的实验和实例，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在本发明说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。

实施例1

1.蜡样芽孢杆菌的培养

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)接种于以下培养基(克/升)：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，然后在30℃恒温摇床上振荡培养过夜小时，用于总DNA的提取。

2.蜡样芽孢杆菌基因的克隆和序列分析

根据Genbank中ID号为GI：225785631为假定普鲁兰酶基因的DNA序列，命名Pulbc，设计相应的引物，扩增其成熟肽序列并连接到表达载体上导入大肠杆菌进行表达，设计引物如下：

上游引物：

5-CTACCATGGATGTTTCAAATTCGAAAACAAC-3

下游引物：

5-CTACAATTGTTATTTAATCGGTTTCTCTG-3

上下游引物分别设计了Nco 1和Mun 1位点用于连接到表达载体上，扩增产物利用Nco 1和Mun 1进行双酶切，然后与同样利用Nco 1和Mun 1进行双酶切的表达载体pSE380进行连接，然后经过筛选验证得到重组质粒pSE380-Pulbc。把重组载体重组质粒pSE380-Pulbc转化到大肠杆菌BL21菌株感受态中，选取阳性转化子接种到LB培养基，37℃，180r/min摇床培养过夜，再以2％的接种量转接到装有100mL LB培养基的500mL的三角瓶中，摇床培养至OD600为0.4-0.6，加入适量的IPTG诱导目的基因表达，20℃培养18小时后，离心收集菌体，经缓冲液洗涤，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000r/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清即为粗酶液，可用于酶学性质分析的实验。

3.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶活力的测定

取1％(w/v)普鲁兰糖500μL加入1.5mL离心管管中，加入50μL稀释适当倍数的酶液；而空白对照管中加入50μL已失活的酶，最适温度反应30min，加入450μL DNS以终止酶反应，然后沸水浴5min，置冰上冷却后，在540nm处测OD值。

酶活力单位定义：在最适温度、最适pH条件下，每分钟分解普鲁兰糖所释放的还原糖，其还原力相当于1μmol葡萄糖所需的酶量，以1U表示。

4.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶的最适反应温度

以普鲁兰为底物，pH7.0的条件下，在30℃到70℃之间每隔5℃测定酶活，结果如图1所示，结果表明重组的普鲁兰酶对普鲁兰糖的最适温度为50℃，在45-55℃能保持80％的活力。

5.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶的最适反应pH

以不同pH缓冲液配制的普鲁兰为底物，在50℃条件下测定普酶活力。不同pH对酶活力的影响结果如图2所示，表明酶的最适反应pH在6.0～7.5。

6.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶热稳定性及Ca²⁺对酶热稳定性的影响

把酶液和添加2mM Ca²⁺的酶液分别在45℃，50℃，55℃和60℃水浴处理20分钟后再分别测酶活力。Ca²⁺对酶活力的影响结果如图3所示，结果表明添加Ca²⁺的酶热稳定性明显比不添加Ca²⁺的高，在50℃保温20分钟的条件下，不添加Ca²⁺的酶活力只剩余12％，而添加Ca²⁺的酶剩余活力达到83％。

7.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶最适底物的分析

通过以不同底物在相同的条件下反应，然后测定还原糖的量，从而测定该酶水解不同底物的相对速度。测定结果如图4所示，发现该酶不能水解糊化可溶性淀粉，而且也不能水解a-环糊精和β-环糊精，表明该酶属于I型普鲁兰酶。水解普鲁兰糖，糊精，糊化玉米淀粉，马铃薯淀粉和糯米淀粉的相对速度为100∶2.7∶11.4∶9.6∶14，表明该酶和上述底物的亲和力大小依次是普鲁兰糖＞糯米淀粉＞玉米淀粉＞马铃薯淀粉和糊精。

8.金属离子对蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶活性的影响

在反应缓冲液中添加金属终浓度为2.0mM/L，4℃保温0.5h后，测残余酶相对活力，以添加金属离子的酶活力为对照，对照活力为100，结果如图5所示，表明金属离子Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对酶活有显著抑制作用，其中Fe³⁺的抑制作用最大，4℃保温0.5h后剩余酶活力几乎为零。Ba²⁺、SDS、EDTA对酶活有微弱的抑制作用，而其他K⁺、Ni⁺对酶活有微弱的激活作用，而其他一些离子如Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺则对酶活有显著的激活作用，可以提高酶的活力约40％。

8.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶对淀粉糖化的作用

液化：将淀粉加水调成30％的淀粉乳，调节pH值到7.0，加入α-淀粉酶保持温度90℃，液化至达到碘色后，再保温0.5小时至DE值为15～20％，然后立即冷却并加入盐酸降低pH到6.0。

糖化：分别取上面液化好的淀粉1L加到两个反应瓶中，分别加入适量的糖化酶，其中一个反应瓶加入适量的制备好的普鲁兰酶，另外一个反应不加普鲁兰酶用于作对照比较加普鲁兰酶对淀粉的水解糖化的影响。在50℃保温72个小时，糖化过程每隔10个小时取样，用HPLC分析酶水解淀粉产物葡萄糖的含量。HPLC分析条件，色谱柱：Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mm×250mm)；检测器：Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器；流动相：75％乙腈25％H2O；流速：1mL/min，柱温：35℃。

鲁兰酶对淀粉的水解糖化的影响结果如图6所示，结果表明添加了普鲁兰酶的淀粉的水解的葡萄糖得率为97.2％，明显高于不加普鲁兰酶的95.3％，而且水解速度也较快，添加普鲁兰酶淀粉水解50个小时，葡萄糖的含量就达到了最大值，而不加普鲁兰酶需要在70个小时后，葡萄糖的含量才达到了最大值。可见蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶可以提高淀粉糖化的葡萄糖得率，同时也可以提高糖化的速度。

8.蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶对提高淀粉糖化中麦芽糖含量的作用

液化：将淀粉加水调成30％的淀粉乳，调节pH值到7.0，加入α-淀粉酶保持温度90℃，液化至达到碘色后，再保温0.5～1小时至DE值为10～12％，然后立即冷却并加入盐酸降低pH到6.0。

糖化：分别取上面液化好的淀粉1L加到两个反应瓶中，再分别加入适量的β-淀粉酶，其中一个反应瓶再加入适量的制备好的普鲁兰酶，另外一个反应不加普鲁兰酶用于作对照比较加普鲁兰酶对淀粉的水解糖化的影响。在50℃保温36个小时后测定糖化产物的麦芽糖含量，结果见表1，结果表明添加普鲁兰酶可以提高淀粉糖化中的麦芽糖含量，适合配合β-淀粉酶用于生产麦芽糖，而且添加普鲁兰酶也可以提高淀粉的水解率，从而提高淀粉的利用率。

表1.鲁兰酶对提高淀粉糖化中麦芽糖含量的作用

	麦芽糖含量％	还原糖总量％
			添加普鲁兰酶	69.3	89.6
不加普鲁兰酶	51.7	77.2

Claims (3)

1.一种蜡样芽孢杆菌的普鲁兰酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1的基因所编码的普鲁兰酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求2所述的普鲁兰酶在水解淀粉中生产葡萄糖的应用。

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