CN101245331B

CN101245331B - 产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a

Info

Publication number: CN101245331B
Application number: CN2008100579697A
Authority: CN
Inventors: 孙谧; 郝建华; 王伟; 袁翠
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: CN101245331A

Abstract

本发明涉及一种南极海水分离筛选得到的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a，是芽孢杆菌属的Bacillus的新菌种，该菌株保藏于CCTCC，保藏号为CCTCCNo：M207079，过氧化氢酶活性达0200U/mg，将在工业和医疗等领域有着广泛应用。

Description

产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及从南极海水中分离筛选出高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a及其产生的低温过氧化氢酶。

背景技术

南极海域由于气候特别寒冷，环境极其恶劣，所以动植物种类较少，但却有大量的原核生物，低温微生物资源丰富。低温酶是维持低温条件下细胞生命活动合适的生化反应速率的关键，筛选低温酶高产菌株是低温微生物理论与应用研究的基础。

过氧化氢酶是好氧微生物生命活动中的重要持家蛋白。它迅速清除在生物代谢过程的氧化还原反应中产生的强氧化剂H₂O₂，防止其穿过细胞内结构、氧化蛋白质或断裂核酸单链伤害细胞。近年来它又以高效催化的能力在工业和医疗等领域展现出广阔的应用前景。所以低温过氧化氢酶作为生物抗氧化保护剂对好氧低温微生物生命活动有重要意义，也是有潜在工业应用价值的低温酶。

Hernandez曾报道南极海水细菌在50μmol/L H₂O₂的条件下仍能正常生长，说明有可能南极海水中存在高过氧化氢酶活性的菌种。

Yumoto等人和Lorentzen等人分别报道了来自Vibrio rumoiensis和Vibriosalmonicida的高活性低温过氧化氢酶，但来自天然环境自由生活的高活性低温过氧化氢酶的微生物尚无报道，高过氧化氢酶活性的海洋革兰氏阳性菌也无报道。

发明内容

本发明的目的在于寻找生存在自然环境中特别是在极端低温条件下高产高活性低温过氧化氢酶的微生物，经发明人广泛深入开发研究，在对南极海水中低温微生物进行分离筛选基础上，获得一株具有高效催化能力的生物抗氧化保护剂的高产高活性低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a(简称菌株n2a)。

本发明提供的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a是从南极海水中分离筛选获得的高产高活性低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a，根据南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a和相关菌株的16SrDNA***发育树(图1)以及菌株n2a的16SrDNA序列相似性最高的菌株分别为：

Bacillus barbaricus DSM 14730^T(98.8％)，

Bacillus arsenicus DSM 15822^T(97.5％)，

Bacillus macauensis DSM 17262^T(96.4％)，

Bacillus gelatini LMG 21880^T(95.1％)。

经16SrDNA基因测序(GenBanK accession number DQ508485)鉴定确定为芽孢杆菌属的细菌，是Bacillus的新菌种。该高产低温过氧化氢酶南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a于2007年6月9日保藏在地址位于：中国武汉“武汉大学”，邮编：430072的中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No：M207079。

本发明提供的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a的形态与生理生化特征为：

形态特征：

菌株n2a为芽孢杆菌，长2.5-5μm，宽0.5-1μm，卵圆形芽孢端生。

培养特征：

在基础海水培养基中(所述基础海水培养基为5克蛋白胨和1克酵母膏溶于1升海水，pH7.5，121℃灭菌20分钟)于4℃～40℃的温度下生长，其最适生长温度范围为20℃～30℃，生长pH范围为pH6～11，最适生长的NaCl浓度为0％～6％，当NaCl浓度大于8％时生长被抑制。30℃基础海水培养基培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径0.9至1.2mm，光滑有光泽，粘液状外观，质地似奶油，白色半透明。

生理生化特征

菌株n2a的生理生化特征列表1。

表1

	特征
		氧化酶	-
甲基红	-
		V-P	-
吲哚	-
		H₂S产生	-
纤维素酶	-
		Tween20水解 (聚环氧乙烷失水山梨糖醇单月桂酸酯)	-
Tween80水解	-

(聚环氧乙烷失水山梨糖醇单油酸酯)	-
		亚硝酸盐还原	-
乙醇氧化	-
		L-苯丙氨酸脱氨酶	-
精氨酸双水解酶	-
		水解马尿酸	-
利用酒石酸盐	-
		利用糖或醇产气	-
RNA酶	+
		碱性磷酸酯酶	+
明胶液化	+
		酪素分解	+
利用葡萄糖	产酸
		淀粉	产酸
甘油	产酸
		麦芽糖	产酸
蔗糖	产酸
		海藻糖	产酸
甘露糖	产酸
		木糖	不产酸
乳糖	不产酸
		甘露醇	不产酸
山梨醇	不产酸
		乙二醇	不产酸
甲醇	不产酸

菌株n2a具有杆菌形态和产芽孢能力这两种芽孢杆菌属的重要特征。

菌株表型特征

菌株n2a与***发育相关菌种的表型特征的差异列于表2

表2

特征	1	2	3	4	5
						革兰氏染色长链形态学logy 生长 4℃ 47℃ pH 9.5 5％NaCl 厌氧生长活动性硝酸盐还原	v - + - + + - + +	+ - - - + - + - -	+ - - - - - - + -	+ + - - + - + ND ND	v + ND + + + - w -

注：1，菌株n2a；2，Bacillus barbaricus；3，Bacillus arsenicus；4，Bacillusmacauensis；5，Bacillus gelatini。+；正：负：ND：未测定v：可变；w：弱。

从表2可见菌株n2a在低温生长、耐盐性等方面明显有别于16SrDNA***发育学相关菌株，菌株n2a的表型5℃生长，7％NaCl生长。

菌株n2a与***发育相关菌种的脂肪酸含量(％)列于表3。

表3

脂肪酸	1	2	3	4	5
						C13:0 iso-C13:0 iso-C14:0 C14:0 iso-C14:1 iso-C15:0 反一异-C15:0 C15:0 iso-C15:1 iso-C16:1 C16:1ω7cis C16:1ω11cis iso-C16:0 反一异-C16:0 C16:0 iso-C17:0 反一异-C17:0 反一异-C18:1 C18:1ω11cis	0 4.7 13.3 0 17.6 14.2 14.2 0 2.4 11.2 6 1 2 1 0 0 0 2 5.7	0 0 9.4 0.9 0 19 42.8 0.9 0.7 0 4.9 2.8 6 0 2 0 2.6 0 0	5.8 0 3.4 1.1 0 10.6 10.5 1.6 4.2 0 25.3 4.2 19 0 9.6 1.1 0 0 0	0 0 4.6 2.2 0 21.7 67.2 0 0 0 0 0 1.6 0 0 2.7 0 0 0	0 0 0 0 0 60.7 9 0 0 0 0 0 4.6 0 2.2 12.8 9.7 0 0

注：1，n2a；2，Bacillus barbaricus；3，Bacillus arsenicus；4，Bacillus macauensis；5，Bacillus gelatini。

由表3可见菌株n2a的支链脂肪酸占优势，即不饱和脂肪酸占40％以上，体现出低温海洋菌的特征，这完全符合芽孢杆菌属细菌的特征。但菌株n2a的C14、C15和C16三类主要脂肪酸含量相差不大(20％至30％)，这明显不同于***发育学相关菌株(其C15或C16一种脂肪酸占优势)。

菌株n2a的不饱和脂肪酸含量超过40％，明显高于16SrDNA***发育学相关菌株，这也是低温菌的重要特征。

菌株n2a的培养

初筛：含1.5％(w/v)琼脂的基础海水培养基灭菌后冷却至50℃加入H₂O₂，使终浓度达1mmol/L，倒平板。以200μL海水样品(例如南极中山站附近海水)涂布，15℃培养10天，长出的单菌落划斜面保藏。

复筛：初筛获得的菌株从斜面接入250mL摇瓶(含20mL基础海水培养基)，200rpm，20℃培养24h，离心收菌体，以pH7.5，50mmol/LTris-Cl重悬菌体并在冰浴中超声破碎，离心后取上清液测活性和蛋白。过氧化氢酶活性以H₂O₂在24Onm处分解速率计算。H₂O₂ 摩尔吸光系数为43.6(mol/L)^-1cm^-1，1个活力单位定义为5℃每分钟分解1μmolH₂O₂的酶量。蛋白含量测定采用Bradford法。以M.lentus和Escherichia coli为对照筛选高活性菌株。

初筛平板细菌生长缓慢，7天后出现肉眼可见的菌落。所有单菌落复筛后获得一株高活性菌株n2a，其菌体超声破碎液过氧化氢酶活性达1200U/mg，而M.lentus和E.coli的菌体超声破碎液中酶活性分别为900U/mg和70U/mg。

菌株n2a与其它微生物的细胞破碎液中过氧化氢酶活性比较列于表4

表4

由表4可见菌株n2a的过氧化氢酶活性极高达1200U/mg。用含高浓度过氧化氢的平板初筛能获得高活性菌株。

本发明提供的从南极海水分离获得高产低温过氧化氢酶为小亚基单功能过氧化氢酶(BNC)，是分子量为230kD的同源四聚体，亚基分子量56kD，pI＝4.2。其最适温度25℃，最适pH6-11，活性受叠氮钠、盐酸羟胺和巯基乙醇的抑制。BNC的活化能13kJ，在4℃和25℃的催化效率分别为3.6×10⁶和4×10⁶M^-1s^-1。BNC低温下高催化效率保证代谢产生的过氧化氢被迅速清除。作为低温小亚基单功能过氧化氢酶的代表，BNC和同源中温酶的活化能、催化效率和热稳定性之间差别不大，成为低温酶中的特例。将在工业和医疗等领域得到广泛应用。

附图说明：

图1为菌株n2a和相关菌株的16SrDNA***发育树

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

初筛：含1.5％(w/v)琼脂的基础海水培养基(5克蛋白胨和1克酵母膏溶于1L海水，调PH7.5，121℃灭菌20分)灭菌后冷却至50℃加入H₂O₂，使终浓度达1mmol/L，倒平板。以200μL海水样品(南极中山站附近海水样品)涂布，15℃培养10天。长出的单菌落划斜面保藏。

复筛：初筛获得的菌株从斜面接入250mL摇瓶(含20mL基础海水培养基)，200rpm，20℃培养24h。离心收菌体，以pH7.5，50mmol/LT ris-Cl(三羟甲基氨基甲烷-Cl)重悬菌体并在冰浴中超声破碎，离心后取上清液测活性和蛋白。测得过氧化氢酶活性达1200 U/mg，得菌株n2a。

菌株n2a为芽孢杆菌，长2.5-5μm，宽0.5-1μm，卵圆形芽孢端生。基础海水培养基中在4℃～40℃的温度下生长，其最适生长温度范围为20℃～30℃，其生长pH范围为pH6～11。最适生长的NaCl浓度为0％～6％，当NaCl浓度大于8％时生长被抑制。30℃基础海水培养基培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径0.9至1.2mm，光滑有光泽，粘液状外观，质地似奶油，白色半透明；氧化酶、甲基红、V-P、吲哚、H₂S产生、纤维素酶、Tween20水解、Tween80水解、亚硝酸盐还原、乙醇氧化、L-苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶、水解马尿酸、利用酒石酸盐、利用糖或醇产气实验均属阴性。RNA酶、碱性磷酸酯酶、明胶液化、酪素分解、利用葡萄糖、淀粉、甘油、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖产酸实验均属阳性；不能从木糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、乙二醇、甲醇产酸。

菌株n2a的表型特征

革兰氏染色 v

长链形态学 -

生长

4℃ +

47℃ -

pH 9.5 +

5％NaCl +

厌氧生长 -

活动性 +

硝酸盐还原 +

菌株n2a脂肪酸含量

C13:0 0

iso-C13:0 4.7

iso-C14:0 13.3

C14:0 0

iso-C14:1 17.6

iso-C15:0 14.2

anteiso-C15:0 14.2

C15:0 0

iso-C15:1 2.4

iso-C16:1 11.2

C16:1ω7cis 6

C16:1ω11cis 1

iso-C16:0 2

反一异-C16:0 1

C16:0 0

iso-C17:0 0

反一异-C17:0 0

反一异-C18:1 2

C18:1ω11cis 5.7

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a

<160>1

<210>1

<211>1434

<212>DNA

<213>南极海洋微生物菌株n2a(Bacillus sp.n2a)

<400>1

gcctaataca tgcaagtcga gcgaatgatg aggagcttgc tcctctgatt tagcggcgga 60

cgggtgagta acacgtgggt aatctgcctg taagacgggg ataactccgg gaaaccgggg 120

ctaataccgg ataacaagag aagaagcatt tcttcttttt gaaagtcggt ttcggctgac 180

acttacagat gagcccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240

cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc ggcaatgggc gaaagcctga ccgagcaacg 360

ccgcgtgagc gatgaaggcc ttcgggtcgt aaagctctgt tgttagagaa gaacaagtac 420

gagagtaact gctcgtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg 540

cgcaggcggt ctcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg 600

aaactgggag acttgagtgc aggagagaaa agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt tggcctgtaa ctgacgctga 720

ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgagtgctag gtgttggggg gttccaccct cagtgctgaa gttaacacat taagcactcc 840

gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900

agtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960

ctgaccactc tagagataga gctttcccct tcgggggaca gagtgacagg tggtgcatgg 1020

ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga 1080

ccttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga 1140

aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggatggtac aaagggttgc gaagccgcga ggccaagcca atcccaaaaa gccattctca 1260

gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagccgga attgctagta atcgcggatc 1320

agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag 1380

tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc cttttgggag ccagccgccg aagg 1434

Claims

1.一种产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a，其特征在于是从南极海水中分离获得的产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp.n2a，是芽孢杆菌属的Bacillus的菌种，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M207079。

2.一种权利要求1南极海洋微生物菌株n2a产生的低温过氧化氢酶。