CN102503647A - 松乳菇菌丝体固体发酵方法及其固体发酵提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及固体发酵技术领域，具体提供了松乳菇菌丝体固体发酵方法及其固体发酵提取物的应用。松乳菇菌丝体固体发酵方法为：用本发明的培养基，在一定的培养条件下对松乳菇菌丝体进行固体发酵，所述一定的培养条件为：培养基氮碳比为1∶5-18，温度18℃-37℃、PH值5-8、菌种日龄24h-120h、接种量10％-30％、发酵周期2d-7d。该固体发酵方法进行固体发酵后得到的产物，经超微粉碎，加酶处理，微波或超声波等方法提取，得到含有多糖多肽的提取物。该提取物可以作为食用添加剂应用于保健品领域，也可以作为饲料添加剂应用于动物饲料领域。本发明还可以在培养基中添加适当的植物类中草药添加剂以提高菌丝体及其胞内胞外多糖多肽的产量，增强提取物的药理活性。

Description

松乳菇菌丝体固体发酵方法及其固体发酵提取物的应用

技术领域

本发明涉及固体发酵技术领域，具体涉及一种野生真菌菌丝体的固体发酵及其固体发酵提取物在动物和人保健上的应用，特别是松乳菇菌丝体固体培养及其培养物提取制备多糖多肽添加剂在动物与人保健上的应用。

背景技术

据报道，许多药用与食(药)用真菌的多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤的功能，是当今开发动物和人保健品的重要方向，现有灵芝多糖、香菇多糖等一批产品上市。其原料来源，一是野外采取或人工栽培的子实体，二是人工发酵的菌丝体。液体深层发酵是生产真菌菌丝体的重要方法，但设备要求高，投资大，生产成本高，作为动物保健品一饲料添加剂开发成本太高，难以推广。固体发酵是我国特有的一种微生物发酵工艺，食(药)用真菌固体发酵始于20世纪60年代，应用科技的手段在人工严格控制条件下，研究以富含碳、氮及矿物质等各种营养成分的农副产品作为发酵基质，用特定的纯种食(药)用真菌作为发酵菌种，双方构成发酵组合，在特定的条件下进行发酵。在固体培养中，菌丝细胞能在培养室内处于最适的温度、氧气、二氧化碳等环境中生长，因此菌丝生长快速，能在短时间内产生大量的菌丝体。

松乳菇又名美味松乳菇、雁鹅菌、松杉菌、松菌、茶花菌、寒菌；系红乳菇科(Russnlaceae)，乳菇属(Lactarius)真菌；其肉质细嫩，味道鲜美独特，营养丰富，是稀有的食用菌，在湖南等地被视为山中珍品，市场上十分走俏；同时松乳菇也可药用，研究报道从松乳菇子实体、菌丝体或发酵液中提取出来的胞内或胞外多糖，具有抑制肿瘤、抗菌、提高机体免疫力等多种生理活性。松乳菇与松口磨、美味牛肝菌等菌一样，都属于菌根菌，与松、杉、柏等树种形成菌根菌。这类菌与植物共生，有特殊的生态条件、营养方式和子实体分化发育条件，对它驯化培养有很大的难度。因此，目前尚不能人工栽培，市场供应全依赖于野生采集。目前国内对松乳菇的培养研究主要采用菌丝体液体深层发酵法，以制备菌丝多糖。多数研究表明，松乳菇菌丝体液体发酵，在以葡萄糖、蔗糖、糊精、甘露醇等为碳源，以玉米浆、牛肉膏、硝酸铵等为氮源的培养基上生长良好，矿物质七水硫酸镁、氯化钠能使菌丝体启动加快，磷酸氢二甲使菌丝体产量提高，VB1、VB6、烟酸对菌丝体生长有促进作用，适宜培养温度为：25-27℃，pH值6-7.5。液体深层发酵具有发酵周期短、产量大等优点，是一种大量获取松乳菇多糖的有效途径；但存在着设备投资大，耗能高等问题。根据相关的研究，菌丝体固体发酵可以克服以上问题，但对松乳菇菌丝体的固体发酵研究鲜为报道；另外，关于真菌活性成分的研究多限于多糖，而多肽研究未见报道。因此，研究松乳菇菌丝体的固体发酵及其活性成分对该菌产品的开发均具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的提供了一种松乳菇菌丝体的固体发酵方法，以及通过该固体发酵方法得到的产物粉碎和提取物的应用。该固体发酵方法所用的培养基是本发明筛选出来的一种用于松乳菇菌丝体的固体发酵培养基，使得多糖多肽含量均显著提高，另外可以在该培养基中添加植物类中草药，提高提取物中多糖多肽的含量，使得其在可以应用于食品或者饲料添加剂中，增加人畜免疫力。

本发明的技术方案之一是：

一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基，包括碳源、氮源、微量元素和水，水占培养基总质量的百分含量为40％-70％，微量元素占培养基总质量的百分含量为0.08％-0.1％，其余为碳源和氮源，其中氮元素与碳元素之比(N∶C)为1∶5-18；

其中，碳源选自麸皮、面粉、米糠、秸秆粉、大米粉、玉米粉和膨化玉米等中的一种或几种；氮源选自玉米酒渣蛋白、玉米皮、植物蛋白、豆粕、棉粕和菜粕等中的一种或几种；微量元素选自硫酸镁或磷酸氢二钾等。

本发明的一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基的优先配方如下：

培养基中水占培养基总质量的百分含量为55％-65％；微量元素占培养基总质量的百分含量为0.09％，其余为碳源和氮源，其中氮元素与碳元素之比为1∶8-15；所述碳源为麸皮和膨化玉米，其中麸皮与膨化玉米的质量比例为4∶1；所述氮源为豆粕和玉米皮，其中豆粕和玉米皮的质量比例为1∶3。

本发明的一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基还包括在培养基中添加植物类中草药提高和改善发酵产物，植物类中草药添加量为培养基总质量的5％-30％。

所述植物类中草药添加剂选自牛膝、淮山、大枣、甘草、首乌、百合、当归、麦冬、白术、党参、粉葛、黄精、枸杞、天花粉、玉竹、薏米、黄芪和绞股蓝等中的一种或几种。

所述植物类中草药添加剂优选选自牛膝、淮山、麦冬和绞股蓝等中的一种或几种。

本发明的技术方案之二是：

一种松乳菇菌丝体的固体发酵方法，使用上述培养基，在一定的培养条件下对松乳菇菌丝体进行固体发酵，所述一定的培养条件为：温度18℃-37℃、PH值5-8、菌种日龄24-120h、接种量10-30％、发酵周期2-7d。

所述一定的培养条件优选为：温度26℃-32℃、PH值6.0-6.8、菌种日龄24-48h、接种量20％、发酵周期3-4d。

本发明的技术方案之三是：

一种松乳菇菌丝体的固体发酵加工物，用上述固体发酵方法进行固体发酵后得到的产物，经超微粉碎直接应用，或加酶处理，微波或超声波提取，得到含有多糖多肽的提取物。

从松乳菇菌丝体中提取多糖和多肽的方法是现有技术中已知的。

本发明的松乳菇菌丝体的固体发酵提取物作为食用添加剂方面的应用。

本发明的松乳菇菌丝体的固体发酵粉碎物和提取物作为饲料添加剂方面的应用。

下面对本发明的方法做进一步的解释和说明：

本发明对松乳菇菌丝体进行固体发酵，生产多糖多肽活性保健产品，用于动物保健。即根据药食真菌的营养特点和固体发酵的要求，选用适合的价廉的农副产品作碳氮源进行筛选与配比优化培养基，同时优化培养的温度、pH值、种龄、接种量、发酵周期等培养条件，提高松乳菇菌丝体的生长速度和多糖多肽的生物产量。经试验挑选出麸皮、膨化玉米作为碳源，豆粕、玉米皮作为氮源制作培养基效果好，经重复实验证明其菌丝生长量、生长速度和多糖多肽含量均显著高于其他物料配种培养基的产量。

本发明提供的松乳菇菌培养基是选育来源广、产量丰富、价格低廉的农副产品为氮源和碳源，经适当的配比，筛选出适宜的基础培养基。

本发明添加植物类中草药改善松乳菌菌丝体发酵的多糖多肽成分，增强药理活性：经对发酵物组份分析发现添加植物类中草药的发酵培养基菌丝多肽组份明显改变，经动物试验(实施例4)证明药理作用增强。

本发明培养基的固体料粗细与含水量适中，物料不要太细也不要太粗，含水量不能过多或过少(料含水量最好是拌好后用手抓紧能从指缝间看见有水分渗出但不流走)，约60％左右(55％-65％)为最优。这样可以使培养基之间有一定的空隙，通气容氧好，松乳菇菌丝体生长旺盛，松乳菇菌丝生长情况与多糖多肽的含量成正比。培养基料太细和含水分过大容易使培养基成团，直接影响通气量，从而影响菌丝体的生长；培养基料过粗糙则松乳菇菌丝的接触面减小，使菌丝体的生长速度减慢；培养基水分含量过少则不能满足松乳菇菌丝体大量生长繁殖的水分要求，从而降低发酵料中菌丝体的量及生长速度，这也直接减少了松乳菇多糖的含量及多糖成分。

与现有技术相比，本发明的优势和积极效果如下：

1、本发明改变一般松乳菇菌丝体液体发酵为固体发酵，提高了一种简单的松乳菇菌丝体固体发酵方法，培养效果好，功能物质不易流失。

2、本发明优化了松乳菇菌丝体固体发酵的培养基和培养条件，能大幅度提高产品产量和质量，筛选出的培养基其中的原料为农副产品，来源广、数量大、价格低、生产效益好。

3、本发明研究了松乳菇菌丝体固体发酵多糖多肽蛋白的生产情况及其生物活性，可以作为饲料添加剂和动物保健食品，开发简单，易于推广。

4、本发明筛选出松乳菇菌丝体固体发酵的植物类中草药添加剂能提高菌丝体及其多糖多肽的产量，提高功能物的活性，为植物类中草药的生物发酵开发新的菌种和新的方法。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的解释和说明，实施例中所述百分含量均指质量百分含量，所述比例为质量比例。

实施例1：

培养基不同配比对松乳菇菌丝体胞内多糖多肽产量的影响

1.材料

松乳菇菌种：由湖南民康生物技术研究所保存。关于松乳菇菌种的获得有多种方法，现有技术中有介绍。本发明与松乳菇菌种本身无关。

松乳菇一般选用的固体培养基基质有：油糠粉、麸皮、米糠、秸秆粉、DDGS、大米粉、玉米皮、玉米粉、膨化玉米、豆粕、菜粕、棉粕等，按照不同比例配制。

PDA营养液：玉米浆1％、硝酸铵0.15％、七水硫酸镁0.01％、羧甲基纤维素钠0.4％、葡萄糖1.5％，蒸馏水定容到100ml，pH6.5。

2.方法

将斜面培养基上的菌种接种于PDA固体培养基的平板上活化一次，然后挑选2cm大小长势好的菌丝体接入装有PDA液体培养基的三角瓶中，于恒温摇床上(转速150rpm)26℃培养24h得到菌悬液，再将菌悬液按15％的接种量接种到不同配比的固体培养基中(每一个配比接三瓶)，于恒温培养箱中28℃培养3d，每隔10h摇动三角瓶一次，每天观察菌丝体生长情。3d后将培养基质倒出于65℃烘箱中烘干，粉碎过60目筛，水提取后测多糖多肽含量，比较不同培养基配方配比对松乳菇产多糖多肽的影响。

松乳菇多糖多肽提取：松乳菇发酵基质干燥粉碎过60目，料液比1∶50，90℃水浴4h，取提取液2000rpm离心10min，取离心液稀释一定倍数后测多糖多肽含量。

3.结果

表1比较不同培养基配方对松乳菇产多糖多肽的影响

由表1可知，第4组和第7组效果最好，即显示松乳菇固体发酵基质选用麸皮、玉米皮、膨化玉米更有利于多糖的生产，多糖可达到7.06-7.32g/100g，而选用其它作为松乳菇固体发酵基质其产多糖量都少于7.0g/100g。发酵基质中加有豆粕，降低氮碳比的多肽含量可达8％以上，而不添加则在7％以下。

通过选用麸皮、玉米皮、豆粕、膨化玉米作为松乳菇固体发酵菌丝体产多糖多肽的培养基质，通过正交实验对麸皮、玉米皮、豆粕、膨化玉米的不同比例进行了发酵优化，最后结果显示，麸皮∶玉米皮∶豆粕∶膨化玉米＝4∶3∶1∶1(质量比例)。

实施例2：

松乳菇菌丝体固体发酵的不同条件对产多糖多肽的影响

1.材料

松乳菇菌种：由湖南民康生物技术研究所保存。

松乳菇菌丝体固体发酵培养基：按麸皮∶玉米皮∶豆粕∶膨化玉米＝4∶3∶1∶1(质量比例)

PDA营养液：玉米浆1％、硝酸铵0.15％、七水硫酸镁0.01％、羧甲基纤维素钠0.4％、葡萄糖1.5％蒸馏水定容到100ml，pH6.5。

培养基的不同配比。

2.方法

将斜面培养基上的菌种接种于PDA固体培养基的平板上活化一次，然后挑选2cm大小长势好的菌丝体接入装有PDA液体培养基的三角瓶中，于恒温摇床上(转速150rpm)26℃培养24h得到菌悬液，再将菌悬液按15％的接种量接种到松乳菇不同配比的固体培养基中(每一个条件接三瓶)，每隔10h摇动三角瓶一次，每天观察菌丝体生长情。3d后将培养基质倒出于65℃烘箱中烘干，粉碎过60目，水提取后测多糖多肽含量，比较不同培养基配方配比对松乳菇产多糖多肽的影响。

松乳菇多糖多肽提取：松乳菇发酵基质干燥粉碎过60目，料液比1∶50，90℃水浴4h，取提取液2000rpm离心10min，取离心液稀释一定倍数后测多糖多肽含量。

不同条件如下：

①按上述条件将发酵培养基配好接种，分别于20℃、23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、37℃的恒温培养箱中培养。其它与实例1的方法相同。

②在上述①最优的条件下，改变营养液的pH值，分别为：5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7、6.8、7.0、7.2，其它条件不变，方法与实例1相同。

③在上述②最优的条件下改变种龄，分别接入15％培养24h、48h、72h、96h、120h的液体种子，其它方法与实例1相同。

④在上述③最优的条件下改变接种量，分别接入10％、15％、20％、25％、30％松乳菇种子液，其它方法与实例1相同。

⑤在上述④最优的条件下改变发酵周期，分别培养：3d、4d、5d、6d、7d d后测多糖多肽的含量，方法与实例1相同。

3.结果

表2发酵温度对松乳菇固体发酵菌丝体产多糖多肽的影响

温度(℃)	20	23	26	29	32	35	37
								多糖含量(g/100g)	8.98	9.33	10.96	11.01	10.99	9.21	8.51
多肽含量(g/100g)	7.54	8.03	8.92	9.41	9.74	8.95	8.03

表3营养液的不同pH值对松乳菇发酵产多糖多肽的影响

表4种龄对松乳菇固体发酵产多糖多肽的影响

表5接种量对松乳菇固体发酵产多糖的影响

表6发酵周期对松乳菇固体发酵产多糖多肽的影响(d：培养天数)

根据表2-6结果显示，松乳菇菌丝体固体发酵产多糖多肽含量的最佳条件为：最佳发酵温度范围26-32℃，最佳pH值范围6.0-6.8，最佳发酵种龄24-48h，最佳接种量20％，最佳发酵周期3d-4d，松乳菇多糖多肽之和可达24.0％以上。

通过对松乳菇固体发酵产多糖多肽条件的优化，综合各方面因素得出了最佳发酵条件用以进行以下实验。

实施例3

添加11种植物类中草药对松乳菇菌丝体固体发酵产多糖多肽的影响

在实施例1得出的最佳培养基在实施例2得出的最佳培养条件下发酵，并在发酵过程中分别添加11种植物类中草药，植物类中草药添加量为培养基总质量的10％。通过每天的观察，松乳菇菌丝体生长速度均有所减慢，且多糖产量无明显变化，而多肽产量有较大的增加，特别是添加淮山、麦冬、白勺、绞股蓝发酵多肽含量明显增加。其多糖多肽的测定结果如表7。

表7植物类中草药对松乳菇菌丝体固体发酵产多糖多肽的影响

实施例4：

松乳菇菌丝体固体发酵产多糖多肽的动物饲养试验

1.试验内容

①仔猪增重和饲料利用率

②仔猪抗腹泻与疾病

2.试验动物与分组

健康断奶仔猪(10kg左右)90头，随机分6组，每组15头，每组分3栏(三个重复)。

3.试验方法

组1-组3是以没有添加植物类中草药的松乳菇菌丝体固体发酵后的产物经超微粉碎，干燥后得到含有多糖多肽的提取物作为添加剂，加入饲料来进行动物饲养试验，由组1-组3可知，组2的效果较好，即添加剂的量为800g/吨效果较好。

组4是以实施例3中的发酵效果好的几种发酵产物之一，即添加白勺的固体发酵产物，经超微粉碎，干燥后得到含有多糖多肽的提取物作为添加剂，将上述添加剂按照表8所述添加量拌入饲料中喂养，并以抗生素对照组(组5)和空白对照组作为对照(组6)饲养期为一个月，试验前后两次称重，并记录各组耗料，观察临床表现，是否发病，做好记录，进行统计分析。见表8：

表8饲喂早期断奶仔猪生长性能与防病情况测定(头、kg)

由表8的数据可知，添加植物类中草药后发酵得到的提取物，其药理活性增强，添加在动物饲料中明显增强了动物的免疫力，减少患病的机率。实施例3的其它几种植物类中草药或者其混合物均可以达到增强药理活性，增强动物的免疫力和减少动物患病的机率的效果。

Claims (10)

1.一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基，包括碳源、氮源、微量元素和水，其特征在于，水占培养基总质量的百分含量为40％-70％，微量元素占培养基总质量的百分含量为0.08％-0.1％，其余为碳源和氮源，其中氮元素与碳元素之比为1∶5-18；

其中，碳源选自麸皮、面粉、米糠、秸秆粉、大米粉、玉米粉和膨化玉米中的一种或几种；氮源选自玉米酒渣蛋白、玉米皮、植物蛋白、豆粕、棉粕和菜粕中的一种或几种；微量元素选自硫酸镁或磷酸氢二钾。

2.根据权利要求1所述一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基，其特征在于，所述水占培养基总质量的百分含量为55％-65％；微量元素占培养基总质量的百分含量为0.09％，其余为碳源和氮源，其中氮元素与碳元素之比为1∶8-15；所述碳源为麸皮和膨化玉米，其中麸皮与膨化玉米的质量比例为4∶1；所述氮源为豆粕和玉米皮，其中豆粕和玉米皮的质量比例为1∶3。

3.根据权利要求1或2所述一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基，其特征在于，在培养基中添加植物类中草药，植物类中草药添加量为培养基总质量的5％-30％。

4.根据权利要求3所述一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基，其特征在于，所述植物类中草药添加剂选自牛膝、淮山、大枣、甘草、首乌、百合、当归、麦冬、党参、粉葛、黄精、枸杞、天花粉、薏米、黄芪和绞股蓝等中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述一种用于松乳菇菌丝体固体培养的培养基，其特征在于，所述植物类中草药添加剂选自牛膝、淮山、麦冬和绞股蓝中的一种或几种。

6.一种松乳菇菌丝体的固体发酵方法，其特征在于，使用权利要求1-5之一所述的培养基，在一定的培养条件下对松乳菇菌丝体进行固体发酵，所述一定的培养条件为：温度18℃-37℃、PH值5.0-8.0、菌种日龄12h-120h、接种量10％-30％、发酵周期2d-7d。

7.根据权利要求6所述的一种松乳菇菌丝体的固体发酵方法，其特征在于，所述一定的培养条件为：温度26℃-32℃、PH值6.0-6.8、菌种日龄24h-48h、接种量20％、发酵周期3d-4d。

8.一种松乳菇菌丝体的固体发酵提取物，其特征在于，用权利要求6-7之一所述固体发酵方法进行固体发酵后得到的产物，经超微粉碎直接应用；或加酶处理，微波或超声波提取，得到含有多糖多肽的提取物。

9.权利要求8所述松乳菇菌丝体的固体发酵提取物作为食用添加剂在保健品方面的应用。

10.权利要求8所述松乳菇菌丝体的固体发酵粉碎物和提取物作为饲料添加剂在动物饲料方面的应用。