CN1024886C - 大量生产人工种用马铃薯(马铃薯微块茎)的方法 - Google Patents

大量生产人工种用马铃薯(马铃薯微块茎)的方法 Download PDF

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Abstract

应用植物组织培养技术大量生产无病原菌人工种用马铃薯(马铃薯微块茎)的改进方法，其中使用特殊的形成微块茎苗、微块茎生产培养基的特殊配方，独特的培养条件，以及结合使用平底培养皿。大田试验证明，人工种用马铃薯(马铃薯微块茎)确能成功地用来代替天然种用马铃薯。

Description

本发明涉及利用植物组织培养技术大量生产无病原菌（尤其是病毒）的人工种用马铃薯（马铃薯微块茎）的新的改进方法。
马铃薯是一种茄科（Solanaceae）植物，其特征在于通过块茎进行繁殖。在大量繁殖中，普遍存在的一个极其严重的问题是病毒感染造成减产，这种危害在马铃薯中显得特别严重（Manzer，F.E.，Merriam，D.C.and    Helper，P.R.，1978，Am.Potato    Jour.，55∶601-609;Schultz，E.S.and    Bonde，R.，1944，Am.Potato    J.，21∶278-283;Wright，N.S.，1977，Am.Potato    J.，54∶147-149;Korea′s    seed    potato    program：organization，impact    and    issues，1987，International    Potato    Center，pp    19-24）。因此，保证供应无病毒种用马铃薯在决定每年块茎作物的产量方面起着极其重要的作用。
业已知道，大多数病毒感染是由蚜虫引起的，蚜虫通过其口很容易传播病毒。因此，为了生产无病毒种用马铃薯，种用马铃薯生产区必须位于带病毒的蚜虫群集很少的高山区。然而采用这种传统方法，生产无病毒种用马铃薯的效率很低，很难满足每年所需要的大量优质种用马铃薯。
近来由于植物组织培养技术的迅速发展，已能采用试管技术大量繁殖许多种植物。用马铃薯苗尖组织培养技术迅速繁殖无病毒幼苗的体系已经建立（Goodwin，P.B.，Kim，Y.C.and    Adisarwanto，T.，1980，Potato    Res.，23∶9-23;Hussey，G.and    Stacey，N.J.，1981，Ann. Bot.，48∶787-796;Roset，S.and    Bokelmann，G.S.，1976，Potato    Res.，19∶173-178），并已有一定量的产品见诸于市。但就生产效率而言，上述体系还存在若干严重的缺陷，其中之一则是从试管移植到土壤的过程是一个耗时费力的过程，在该过程中需要十分小心，许多在试管中培养的娇嫩的马铃薯幼苗经不住生长环境的突然变化。
自1970年以来，有关试管生长马铃薯微块茎的若干报告已经发表，但其生产效率极低，致使研究人员只能利用这种微块茎形成现象作为研究马铃薯块茎形成生理的试验手段（Garcia-Torres，L.and    Gomez-Campo.C.，1973，Potato    Res.，16∶73-79;Abbott，A.J.and    Belcher，A.R.，1986，In    Plant    Tissue    Culture    and    its    Agricultural    applications，Butterworths，pp.113-122，Hussey，G.and    Stacey，N.J.，1984，Ann.Bot.53∶565-578）。
近来也有人试图采用液体培养方法种植试管生产的马铃薯微块茎，以生产大量无病毒优质种用马铃薯（Wang，P.J.and    Hu，C.Y.1982，Amer.Potato    Jour.，59∶33-39，International    patent    application    Number：PCT/HU86/00053，1986）。但是，采用上述方法生产微块茎的效率仍然很低，不足以取代天然种用马铃薯。何况采用上述液体培养方法生产的微块茎还存在某些严重的缺陷，例如贮藏期间易于脱水，微块茎经常发生玻璃化，不能用作人工种用马铃薯。尽管存在这许多问题，通过马铃薯苗的组织培养产生的马铃薯微块茎似乎仍可用来代替马铃薯苗尖，因为马铃薯微块茎不太娇嫩，移栽时给组织培养产生的幼苗更易于处理。由于马铃薯繁殖的特点，毕竟每年所需要的种用马铃薯的量很大，即使证明微块茎可以应用，但其意义几乎被认为等于零，除非研究一些其他方法，能在很小的空间内大量生产微块茎，从而能以足够低的价格将它们供应给农民，以代替天然的种用马铃薯。
因此，本发明的目的在于研究大量生产廉价马铃薯微块茎的改进方 法，以将它们直接供给农民，以便真正取代天然种用马铃薯。
本发明提供一种大量生产无病毒马铃薯微块茎的方法，其特征在于：
（1）.在以下组份（Ⅰ）的培养基上由优良品种的无病毒马铃薯诱导形成微块茎的苗。
组份（Ⅰ）：硝酸铵2000mg/l，硝酸钾2500mg/l，氯化钙2H2O440mg/l，硫酸镁7H2O370mg/l，磷酸钾170mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，硫酸亚铁7H2O27.85mg/l，硫酸锰H2O16.90mg/l，硼酸6.20mg/l，硫酸锌7H2O8.60mg/l，碘化钾0.83mg/l，钼酸钠2H2O0.25mg/l，硫酸铜5H2O0.025mg/l，氯化钴6H2O0.025mg/l，肌醇100mg/l，抗坏血酸50mg/l，赤霉酸（GA）0.10mg/l，核苷玉米素0.10mg/l，蔗糖20000mg/l，琼脂10000mg/l，维生素B121.5mg/l，维生素Bc0.5mg/l，维生素B20.5mg/l，生物素1.0mg/l，胆碱盐酸盐1.0mg/l，泛酸钙1.0mg/l，维生素B11.0mg/l，维生素PP2.0mg/l，维生素B6盐酸盐2.0mg/l，对氨基苯甲酸0.5mg/l）;
（2）.在黑暗中先后在高温和低温下处理所述形成微块茎的苗，和
（3）.在可堆积的容器中在以下组分（Ⅱ）的固体微块茎诱导培养上培养步骤（2）得到的所述形成微块茎的苗，
组份（Ⅱ）硝酸铵1000mg/l，硝酸钾1500mg/l，氯化钙2H2O440mg/l，硫酸镁7H2O370mg/l，磷酸钾500mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，硫酸亚铁7H2O27.85mg/l，硫酸锰H2O16.90mg/l，硼酸6.20mg/l，硫酸锌7H2O8.60mg/l，碘化钾0.83mg/l，钼酸钠2H2O0.25mg/l，硫酸铜5H2O0.025mg/l，氯化钴6H2O0.025mg/l，维生素B121.5mg/l，维生素Bc0.5mg/l，维生素B20.5mg/l，生物素1.0mg/l，胆碱盐酸盐1.0mg/l，泛酸钙1.0mg/l，维生素B11.0mg/l，维生素PP2.0mg/l，维生素B6盐酸盐2.0mg/l，对氨基苯甲酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，抗坏血酸50mg/l，氯化氯胆碱（CCC）、氯化磷（2，4-二氯苄三丁基氯化磷）、Amo-1618（（5-羟基 香芹基）三氯化甲基哌啶羧酸铵）或B-905（N-二甲基-氨基琥珀酸）100mg/l，核苷玉米素0.1mg/l，蔗糖90，000mg/l，琼脂10，000mg/l。
在本发明中，优选的形成微块茎的苗得自细胞系KCTC8445P（ATTC40769）。
在本发明的步骤（2）中，高温和低温的优选温度分别为30℃和10℃。
在本发明的步骤（3）中，优选的培养方法是交替地在光下20℃和暗中12℃进行培养。
根据本发明的任务及其优点，研究用于大量生产无病原菌的人工种用马铃薯（马铃薯微块茎）的植物组织培养的改进方法，这种马铃薯微块茎在生产天然种用马铃薯前能代替天然种用马铃薯或用作种用马铃薯代用品。现在本发明的结果已能大量生产人工种用马铃薯，与已知微块茎生产方法相比，效率至少为已知方法的30倍。因此，由于本发明的结果，已有可能生产廉价人工种用马铃薯，足能供给农民以取代天然种用马铃薯。从本发明的附图及详尽说明中，将清楚地了解本发明的其他目的及其优点。
附图说明：
图1：在培养皿快速繁殖人工培养基上的优良品种的形成微块茎苗。
图2：优良品种的马铃薯微块茎在培养皿中的人工培养基上快速形成。
图3：优良品种的马铃薯微块茎长期无菌保藏在低温条件下的培养皿中。
图4：即将收获由微块茎长成的马铃薯。
图5：由优良品种的微块茎产生的植株中收获到的马铃薯的平均产量。
本发明大量生产人工种用马铃薯的整个方法包括若干步骤。下述试验将更详尽地说明本发明的实施，但并不限制本发明。
实施例1：诱导、保持和大量繁殖形成微块茎的无病毒马铃薯苗的方法的建立
从农业开发局园艺试验站获得的优良品种的无病毒马铃薯作为试验材料。将该马铃薯用自来水洗净后，浸在70%乙醇中3分钟，再用20% Clolox（商品）表面消毒10分钟，最后种在装有经过消毒的土壤（蛭石∶珍珠岩＝1∶1）的方钵中。约一周后，在25℃恒温培养和16小时光照周期的培养室中块茎开始萌芽。
两周后，苗平均长到大约5-10cm高时，切下1-2cm长的苗尖，用作苗尖培养的基本材料。将切下的苗尖在无菌蒸馏水中洗涤3次，浸在70%乙醇中30秒钟，用10%Clorox表面消毒10分钟，最后接种到特殊配制的液体或固体培养基（见表2）上诱导和繁殖形成微块茎的苗尖。
培养室的环境条件与母体块茎发芽的条件相同。在这样的培养环境中，接种后一周，开始出现腋生枝，在大多数情况下，3-4周后生长迅速，需要进行次代培养。此时需采用离体压条技术，以最大限度地刺激诱导腋生枝的生长，但在烧瓶或试管中，该项技术需要丰富的经验，使在该试验中腋生枝能在平底培养皿（直径10cm，高1.5cm）中生长，从而自动诱导离体压条，大量增加腋生枝（见表3）。一般说来，液体培养的生长速度比固体培养快。但是，当液体培养经过长时间的次代培养后，由于吸收过量的水分导致生长衰退或玻璃化，经常发生抑制马铃薯试管苗的正常生长。因此，最好在开始阶段仅用液体培养基，以后则主要用固体培养基。
值得注意的是所有在人工培养基上繁殖的苗，在转入到产生微块茎条件的下一阶段时，并不都形成微块茎，仅具有特殊性状的苗才能形成微块茎，换言之，只有那些带无柄叶的节间略长的、根部生长健壮，尤其是带钩状苗尖的那些苗（见图1）才能大量产生微块茎（见表5）。本文中将这些具有特殊性状的苗称为“形成微块茎苗”，并作为专利植物细胞系登记保藏在南朝鲜典型培养物保藏中心（KCTC）（良种专利细胞系№8445P）。这些产生马铃薯微块茎的苗仅仅在含有特殊组份的诱导形成微块茎的培养基上才能形成，并且一旦形成后，至少在每年连续次代培养24次后仍能保持其形成微块茎的特征。
实施例2：大量生产马铃薯微块茎的方法
将实施例1所述在迅速繁殖阶段中的形成微块茎苗首先转移到高温（30℃）培养室（其他培养条件与上述形成微块茎苗的繁殖培养基相同）培养一周，然后移到完全黑暗的低温（10℃）培养室再培养一周。经低温处理过的形成微块茎苗在微块茎诱导培养基（见表2和4）上温育，用石蜡密封置于培养室内培养，培养室内的温度白天保持20℃，夜间保持12℃，光照周期为6小时光照，18小时黑暗，光强度约为500勒克司。为了充分利用培养室的空间，尽可能将培养皿挤放在一起。在大多数情况下，大约在将它们转移到所述微块茎诱导条件后10天，开始形成马铃薯微块茎，培养40至50天后，每个培养皿上形成的微块茎平均10个以上，长得黄豆般大小（见图2）。
将浓度为50ppm的氯化磷、Amo-1618、B-905（N-二甲基-氨基琥珀酰胺酸）和氯化氯胆碱（CCC）等生长抑制剂加到培养基中，则微块茎的产率可显著提高。
在优良品种的情况下，以一个人的培养空间单位的生产效率进行对比研究，说明在用不形成微块茎苗并按烧瓶液体培养的传统方法和用本发明的形成微块茎苗（包括用于提高微块茎诱导效率的所有其他处理）并按培养皿固体培养方法之间不同的结果。结果示于表6和表7。
实施例3：马铃薯微块茎的长期保藏方法和保藏期间抑制和刺激发芽的方法
在培养皿大量生产的优良品种微块茎经无菌收获后，用无菌蒸馏水冲洗3-4次，洗去留在表面上的培养基。将它们平置于干净的种植台中干燥至表面水分完全去除。把干微块茎放置在空的无菌培养皿中，用3层石蜡密封后放入4℃低温冰箱中（见图3）。在冰箱中大约放置2个月后，打破了休眠状态，然后如果需要可在室温条件下大约2周就很容 易发芽（见表8）。需要将它们保藏很长时间而不需要发芽时，可先用5mg/l脱落酸溶液处理3小时，然后低温保藏。采用这种方法就能在安全条件下，将微块茎保藏一年以上，而且已经证明发芽率并未丧失或被抑制（见表9）。如果在收获后需要立即诱导发芽，则用赤霉酸处理或先用38℃温浴处理后再用赤霉酸处理打破休眠的方法，可使其早发芽（见表8）。这种赤霉素和高温处理也可用于缩短休眠已经打破的微块茎发芽所需要的时间（见表10）。
实施例4：优良品种的马铃薯微块茎的产量试验
为了将天然种用马铃薯和马铃薯微块茎进行产量对比，进行了验证试验。当按实施例3所述进行发芽处理后，发芽微块茎的节长达到2-3cm时，将微块茎直播在土壤中。与天然种用马铃薯相比，在早期，微块茎生长相当差，但在中期后，生长非常迅速。在播种后三个月收获时，土壤上的微块茎长得比天然种用马铃薯高2/3。单株的最终产量与土壤上的生长速度几乎成相同比例。由马铃薯长出的植株，其马铃薯的单株产量约507克，而天然种用马铃薯的单株产量约812克（见表11和图4、5）。换句话说，如果它们按与天然种用马铃薯同样的方法进行播种，则马铃薯微块茎的平均产量约为天然种用马铃薯产量的60-70%。然而由于微块茎长出的植株比天然种用马铃薯长出的植株小，所以密植有可能增加前者的单位面积产量。
表1：用于诱导和大量繁殖优良马铃薯品种的形成微块茎苗的培养基组合物的组份
组份    含量（mg/l）
硝酸铵    2，000.000
硝酸钾    2，500.000
氯化钙2H2O 440.000
硫酸镁7H2O 370.000
磷酸钾    170.000
乙二胺四乙酸二钠    37.250
硫酸亚铁7H2O 27.850
硫酸锰H2O 16.900
硼酸    6.200
硫酸锌7H2O 8.600
碘化钾    0.830
钼酸钠2H2O 0.250
硫酸铜5H2O 0.025
氯化钴6H2O 0.025
Staba复合维生素    组分见表2
肌醇    100.000
抗坏血酸    50.000
赤霉酸（GA）    0.100
核苷玉米素    0.100
蔗糖    20，000.000
琼脂    10，000.000
培养基pH＝5.7
表2：产生和大量快速繁殖优良马铃薯品种的形成微块茎苗的培养基中所加Staba复合维生素组合物的组份
组份    含量/升
维生素B121.5mg
维生素Bc    0.5mg
维生素B20.5mg
生物素    1.0mg
胆碱盐酸盐    1.0mg
泛酸钙    1.0mg
维生素B11.0mg
维生素PP    2.0mg
维生素B6盐酸盐 2.0mg
对氨基苯甲酸    0.5mg
表3：优良马铃薯品种用培养皿组织培养的离体压条技术对增加腋生枝数量的影响
培养方法＊    腋生枝数
250ml烧瓶培养    4±1.6＊＊
培养皿培养    13±3.5
＊：接种1株初生苗（3cm高）培养4周后腋生枝的数目。
＊＊：每个处理20株培养物的平均±S.D.
表4：用于大量生产优良品种的马铃薯微块茎的培养基组合物的组分
组份    含量（mg/l）
硝酸铵    1，000.000
硝酸钾    1，500.000
氯化钙2H2O 440.000
硫酸镁7H2O 370.000
硫酸镁    500.000
磷酸钾    37.250
乙二胺四乙酸二钠    27.850
硫酸亚铁7H2O 16.900
硫酸锰H2O 6.200
硼酸    8.600
硫酸锌7H2O 0.830
碘化钾    0.250
钼酸钠2H2O 0.025
硫酸铜5H2O 0.025
Staba复合维生素    组分见表2
肌醇    100.000
抗坏血酸    50.000
氯化氯胆碱（CCC）    100.000
核苷玉米素    0.100
蔗糖    90，000.000
琼脂    10，000.000
培养基pH＝5.7
表5：形成微块茎苗和普通（不形成微块茎）苗（均为优良马铃薯品种）之间培养环境条件对微块茎生产效率影响的对比
每个培养皿产生微块茎数
普通苗在正常培养条件下培养＊    0
普通苗在微块茎诱导条件下培养＊＊    2±1.2
形成微块茎苗在正常培养条件下培养    2±0.7
形成微块茎苗在微块茎诱导条件下培养    10±3.5
＊：25℃恒温培养，16小时光照和8小时黑暗的光照周期。所用培养基与用于形成微块茎苗繁殖的相同。
＊＊：使用微块茎诱导培养基，苗经高温（30℃）和黑暗低温（10℃）预处理，培养温度白天20℃，夜间12℃，6小时光照和18小时黑暗的光照周期，光照强度约500勒克司。
表6：两种不同培养方法（均为优良品种）每个培养空间单位马铃薯微块茎生产效率的对比
每个培养空间单位＊    培养方法之间
培养方法    产生的微块茎数＊＊    的生产效率
a.烧瓶培养法＊＊＊    385±42.2＊＊＊＊
（用液体培养基）    b/a＝31.9
b.培养皿培养法＊＊＊＊＊    12.280±981.4
（用固体培养基）
＊：采用直径120cm宽70cm高30cm的培养架。
＊＊：直径5cm和重100mg以上的微块茎播种在土壤上时实际上用作种用马铃薯。
＊＊＊：采用250ml的锥形烧瓶。
＊＊＊＊：3个重复的平均±S.D.。
＊＊＊＊＊：采用直径10cm高1.5cm的培养皿。
表7：按表6所述培养方法培养优良品种的马铃薯微块茎生产效率的具体对比
培养    每个培养皿产生    微块茎生产时    每个培养空间单
方法    微块茎的平均数    需培养时间    位放置培养皿数
a.烧瓶培养法    5    14-16周    1
b.培养皿培养法    10    8-10周    10
具体生产效率的对比    2倍    1.5倍    10倍
总生产效率的对比    2×1.5×10＝约30倍＊
＊：对比说明：按本发明的培养皿培养方法的生产率效约为传统烧瓶培养方法的30倍。
表8：低温保藏的时间和赤霉酸处理＊对打破优良品种的马铃薯微块茎休眠状态的影响
收获后低温保藏时间    发芽率（%）＊＊    经赤霉酸处理的发芽率（%）
1周    0    5
2周    0    20
3周    10    60
4周    25    90
5周    50    95
6周    80    97
7周    95    95
8周    95    95
＊：经5ppm浓度室温处理1小时。
＊＊：室温条件下两周后检查发芽率。
表9：低温保藏期间脱落酸处理＊对抑制优良品种的马铃薯微块茎发芽的影响
处理    抑制时间
低温保藏，未经ABA处理    6个月
低温保藏，经ABA处理    12个月
＊：经10ppm浓度室温处理3小时
表10：温浴（38℃，1小时）和赤霉酸处理（5ppm，室温，1小时）对刺激已经打破休眠状态的优良品种的马铃薯微块茎发芽的影响
处理    微块茎＊达到90%以上发芽＊＊所需时间
未处理    14天
GA处理    7天
38℃温浴处理    10天
GA+38℃温浴处理    4天
＊：已经打破休眼状态的微块茎
＊＊：处于节长1mm以上肉眼可看见的发芽状态
表11：马铃薯微块茎和天然种用马铃薯（均为优良品种）单株产量＊对比
处理    平均产量
马铃薯微块茎    507±156.5g
天然种用马铃薯    812±230.8g
＊：系微块茎和天然种用马铃薯各30株的平均产量

Claims (4)

1、一种大量生产无病毒马铃薯微块茎的方法，其特征在于：
(1).在以下组份(Ⅰ)的培养基上由优良品种的无病毒马铃薯诱导形成微块茎的苗，
组份(Ⅰ)：硝酸铵2000mg/l，硝酸钾2500mg/l，氯化钙2H2O440mg/l，硫酸镁7H2O370mg/l，磷酸钾170mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，硫酸亚铁7H2O27.85mg，硫酸锰H2O16.90mg/l，硼酸6.20mg/l，硫酸锌7H2O8.60mg/l，碘化钾0.83mg/l，钼酸钠2H2O0.25mg/l，硫酸铜5H2O0.025mg/l，氯化钴6H2O0.025mg/l，肌醇100mg/l，抗坏血酸50mg/l，赤霉酸(GA)0.10mg/l，核苷玉米素0.10mg/l，蔗糖20000mg/l，琼脂10000mg/l，维生素B121.5mg/l，维生素Bo0.5mg/l，维生素B20.5mg/l，生物素1.0mg/l，胆碱盐酸盐1.0mg/l，泛酸钙1.0mg/l，维生素B11.0mg/l，维生素PP2.0mg/l，维生素B6盐酸盐2.0mg/l，对氨基苯甲酸0.5mg/l)；
(2).在黑暗中先后在高温和低温下处理所述形成微块茎的苗，和
(3).在可堆积的容器中在以下组分(Ⅱ)的固体微块茎诱导培养上培养步骤(2)得到的所述形成微块茎的苗，
组份(Ⅱ)硝酸铵1000mg/l，硝酸钾1500mg/l，氯化钙2H2O440mg/l，硫酸镁7H2O370mg/l，磷酸钾500mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，硫酸亚铁7H2O27.85mg，硫酸锰H2O16.90mg/l，硼酸6.20mg/l，硫酸锌7H2O8.60mg/l，碘化钾0.83mg/l，钼酸钠2H2O0.25mg/l，硫酸铜5H2O0.025mg/l，氯化钴6H2O0.025mg/l，维生素B121.5mg/l，维生素Bc0.5mg/l，维生素B20.5mg/l，生物素1.0mg/l，胆碱盐酸盐1.0mg/l，泛酸钙1.0mg/l，维生素B11.0mg/l，维生素PP2.0mg/l， 维生素B6盐酸盐2.0mg/l，对氨基苯甲酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，抗坏血酸50mg/l，氯化氯胆碱(CCC)、氯化磷(2，4-二氯苄三丁基氯化磷)、Amo-1618((5-羟基香芹基)三氯化甲基哌啶羧酸铵)或B-905(N-二甲基-氨基琥珀酸)100mg/l，核苷玉米素0.1mg/l，蔗糖90，000mg/l，琼脂10，000mg/l。
2、按权利要求1方法，其中所述形成微块茎的苗得自细胞系KCTC8445P（ATCC  NO.40769）。
3、按权利要求1方法，其中所述高温和低温分别为30℃和10℃。
4、按权利要求1的方法，其中步骤（3）中所述的培养是在光下20℃和暗中12℃交替进行的。
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