CN1180681C - 马哈利樱桃砧木繁殖方法 - Google Patents

Abstract

一种马哈利樱桃砧木繁殖方法，采用了组培苗的制备、组培苗生根培养、长苗炼苗培养、移栽组培方法，在暗室进行组培苗的制备和组培苗生根培养，并在自然光下长苗、长根、炼苗同步进行，组培步骤采用了适合于马哈利樱桃砧木快速繁殖的芽生长培养基和增殖培养基以及生根培养基，增殖和生根效果好，使马哈利樱桃砧木生根率达85%以上，而且根系粗壮整齐，同时组培苗生长健壮，叶色浓绿，有效地节约了人力和物力，移栽成活率可达87.65%，为工厂化生产奠定了基础。本发明组培方法具有简便易行、简化了程序、提高了工效、降低了成本等优点，可用于马哈利樱桃砧木的快速繁殖。

Description

马哈利樱桃砧木繁殖方法

技术领域

本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域，具体涉及到马哈利樱桃砧木的繁殖方法。

背景技术

马哈利樱桃砧木(Mahaleb)原产欧洲中、南部，为野生品种，多呈灌木状态。枝干灰褐色，枝细而短，分枝力强。叶片小，圆形或卵圆形，有光泽，表面光滑有蜡质层。花小、白色。果实小，完全成熟后紫黑色，离核。果肉不能食用。种子较小，椭圆至圆形，种子每公斤粒数为12000～15000粒。经层积处理后，发芽率可达90％以上，多用实生播种繁殖。出苗率高，幼苗生长整齐，播种当年有95％以上的苗木可供芽接。与大樱桃嫁接亲和力强，接口愈合良好，苗木生长健壮，抗旱、抗寒、耐瘠薄，且抗根头癌肿病。在肥沃土壤上马哈利的树冠比马扎德小，结果较早、耐旱耐瘠，固地性好。该种砧木极耐寒，不传播Buckskin病。根癌病、萎蔫病和细菌性溃疡病比马扎德轻，但不适宜潮湿、粘重的土壤。现在多用做繁殖大樱桃的砧木。

采用植物组织培养方法可以在短期内快速繁殖多种植物，不仅繁殖速率极高，且因为其是无性繁殖，可以保持原繁殖母株的优良性状，近年来在生产上应用越来越广。植物组织培养技术的原理是利用植物细胞的全能性，即组成植物体的每一个细胞都具有发育成为一个完整植株的潜在能力，采取植物体上的单个细胞、细胞团、分生组织或器官的一部分，通过人工配制不同营养成分和激素的培养基来培养并调控其发育，使这些细胞、组织等形成成千上万个小植株并且保持了母本植株的全部的优良性状，这种方法可以在短时间内获得大量的组培苗，并能在人工控制条件的车间内一年四季进行，因而可以实现种苗繁殖的工厂化生产，可在较小的面积内进行大规模生产，因而无需占用大量土地。

上述的植物组织培养方法，先培养成无根苗，再将无根苗在生根培养基中诱导生根，长苗和生根在两种不同培养基中进行，在繁殖生根培养和炼苗阶段，通常先在室内培养一段时间，然后移到自然光下进行长苗和炼苗。增加了繁殖生根培养和炼苗时间。

马哈利樱桃砧木组培苗生根困难，移栽成活率低使其一直无法实现大规模工厂化生产，至今国内外尚未见到实现工厂化生产马哈利樱桃砧木苗的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题以及解决其技术问题所采用的技术方案是它包括如下步骤：

(1)组培苗的制备

原材料的预处理：剪取大田栽培的盛果期单株的无病虫害的健壮营养枝，切取其幼芽，流水冲洗干净，用干净滤纸吸干；在超净工作台上将冲洗干净的幼芽在70％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗3次，每次5分钟，再置入0.1％HgCl₂溶液中灭菌6～8分钟，用无菌水冲洗幼芽3～5次，每次5分钟，最后用无菌滤纸吸干，作为外植体扦***1/2MS基本培养基中使芽生长，每隔3～5天将芽转接入新的1/2MS基本培养基中，重复2～3次，待培养基不再变色时，将芽转接入芽生长培养基中，该芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                   15～80g

琼脂粉                                   4～10g

6-(苄胺基)嘌呤                           0.2～0.6mg

当芽长至1.5～3cm，有3～5片真叶时，将苗转入增殖培养基中进行繁殖，该增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                   15～80g

琼脂粉                                   4～10g

6-(苄胺基)嘌呤                           0.3～4mg

吲哚乙酸                                 0.3～0.9mg

赤霉素                                   0.1～3mg

酪蛋白                                   0.01～0.05g

配制好的增殖培养基分装在培养瓶中，每瓶装25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将增殖生长的丛生芽分离成单个芽接入培养瓶中，其中生长较快的苗在转接时可切成带1～2个芽的茎段扦插于增殖培养基上，培养瓶置于光照强度为3500～4500lx、温度为20℃～30℃、湿度为70％～90％的培养室中培养，每天照射10～12小时，每一次继代培养使用新鲜配置的增殖培养基，继代培养条件与第一代培养条件相同，选取繁殖8～30代的1.5～3cm高的健壮组培苗或1.5～3cm的带顶芽的上部茎段为材料进行生根培养。

(2)组培苗生根培养

将(1)中切好的组培苗或茎段放入生根培养基中进行生根培养，该生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                     15～80g

琼脂粉                                     4～10g

吲哚-3-丁酸                                0.1～0.9mg

或所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                     15～80g

琼脂粉                                     4～10g

吲哚乙酸                                   0.5～3.5mg

将配制好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，培养瓶移入温度为18℃～22℃、湿度为70％～90％的暗室中进行暗培养，暗培养3～7天；

(3)长苗炼苗培养

将经过暗培养的培养瓶直接移入光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室内，每天光照9～11小时，驯化20～25天，打开瓶盖加入0.5～1.0厘米高自来水炼苗5～10天，当苗高2～6厘米，根长1～2.5厘米时进行移栽。

(4)移栽

取出(3)中经过炼苗的幼苗，洗净根上残留的生根培养基，用浓度为100ppm的生根粉浸泡处理幼苗根部，移入装有营养土的移栽容器中，移栽前浇足1/10MS基本培养基溶液，上覆盖塑料薄膜，保持湿度在70％～100％；7天后逐渐通风，15天后揭膜，在此期间喷洒1/10MS基本培养基溶液，继续在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为70％～90％的温室内，培养20～50天，在苗高5～15厘米，有8～15片叶时移栽入大田。

本发明的优选芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                    20～50g

琼脂粉                                    4.5～7g

6-(苄胺基)嘌呤                            0.2～0.5mg

本发明的优选增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                            20～50g

琼脂粉                                            4.5～7g

6-(苄胺基)嘌呤                                    0.4～3mg

吲哚乙酸                                          0.4～0.8mg

赤霉素                                            0.1～2mg

酪蛋白                                            0.01～0.04g

本发明的优选生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                           20-50g

琼脂粉                                           4.5-7g

吲哚-3-丁酸                                      0.3～0.7mg

本发明的优选生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                           20～50g

琼脂粉                                           4.5～7g

吲哚乙酸                                         1～3mg

本发明的最佳芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                            30g

琼脂粉                                            6g

6-(苄胺基)嘌呤                                    0.5mg

本发明的最佳增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                            30g

琼脂粉                                            6g

6-(苄胺基)嘌呤                                    2mg

吲哚乙酸                                          0.5mg

赤霉素                                            0.2mg

酪蛋白                                            0.02g

本发明的最佳生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                            30g

琼脂粉                                         5g

吲哚-3-丁酸                                    0.6mg

本发明的最佳生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                          30g

琼脂粉                                          5g

吲哚乙酸                                        2mg

本发明采用暗培养进行组培苗的制备和组培苗生根培养促进生根和培育壮苗，并在自然光下长苗、长根、炼苗同步进行的组织培养方法，组培步骤采用了适合于马哈利樱桃砧木快速繁殖的增殖培养基和生根培养基，增殖和生根效果好，使马哈利樱桃砧木生根率达85％以上，而且根系粗壮整齐，同时组培苗生长健壮，叶色浓绿，有效地节约了人力和物力，移栽成活率可达87.65％，为工厂化生产奠定了基础。本发明组培方法具有简便易行、简化了程序、提高了工效、降低了成本等优点，可用于马哈利樱桃砧木的快速繁殖。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

(1)组培苗的制备

原材料的预处理：剪取大田栽培的盛果期优良单株的无病虫害的健壮营养枝，切取其幼芽，流水冲洗干净，用干净滤纸吸干；材料消毒：在超净工作台上将冲洗干净的幼芽在70％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗3次，每次5分钟，再置入0.1％HgCl₂溶液中灭菌6～8分钟，用无菌水冲洗幼芽3～5次，每次5分钟，最后用无菌滤纸吸干，作为外植体扦***1/2MS基本培养基中使芽生长，每隔3～5天将芽转接入新的1/2MS基本培养基中，重复2～3次，待培养基不再变色时，将芽转接入芽生长培养基中。本实施例所用的芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                            30g

琼脂粉                                            6g

6-(苄胺基)嘌呤                                    0.5mg

当芽长至1.5～3cm，有3～5片真叶时，将苗转入增殖培养基中进行快速繁殖。本实施例所用的增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                         30g

琼脂粉                                         6g

6-(苄胺基)嘌呤                                 2mg

吲哚乙酸                                       0.5mg

赤霉素                                         0.2mg

酪蛋白                                         0.02g

配制好的增殖培养基分装在培养瓶中，每瓶装25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将增殖生长的丛生芽分离成单个芽接入培养瓶中，其中生长较快的苗在转接时可切成带1～2个芽的茎段扦插于增殖培养基上，将培养瓶置于光照强度为3500～4500lx、每天照射10～12小时、温度为20℃～30℃、湿度为70％～90％的培养室中培养，每一次继代培养使用新鲜配置的增殖培养基，继代培养条件与第一代培养条件相同。选取繁殖8～30代的1.5～3cm高的健壮组培苗或1.5～3cm的带顶芽的上部茎段为材料进行生根培养。实验结果表明：6-(苄胺基)嘌呤和吲哚乙酸可使苗生长健壮整齐，增殖倍数提高到6.8以上。赤霉素可使苗生长迅速整齐，苗健壮，叶色浓绿，浓度大于0.5mg/L时苗生长不整齐而且有畸形苗出现。酪蛋白有利于苗生长整齐健壮。

(2)组培苗生根培养

将(1)中切好的组培苗或茎段放入生根培养基中进行生根培养，本实施例的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                          30g

琼脂粉                                          5g

吲哚-3-丁酸                                     0.6mg

将配制好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟。培养瓶移入暗室中进行暗培养，暗室中温度为18℃～22℃，湿度为70％～90％。根据正交试验结果，暗培养对马哈利樱桃砧木的生根影响最大，赤霉素对发根率有较强的抑制作用。采用本实施例的生根培养基暗培养7天后进行自然光炼苗生根，生根率分别达85.21％，且根系健壮，苗壮且生长整齐，符合工厂化生产的要求。

(3)长苗炼苗培养

将经过暗培养的培养瓶直接移入光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室内，每天光照9～11小时，驯化20～25天，打开瓶盖，炼苗5～10天，开盖炼苗时培养瓶加0.5～1.0厘米高自来水防污保湿。当苗高2～6厘米，根长1～2.5厘米时进行移栽。

(4)移栽

取出(3)中经过炼苗的幼苗，洗净根上残留的生根培养基，用市销的浓度为100ppm的生根粉浸泡处理幼苗根部，移入装有营养土(蛭石∶腐殖土∶田园土＝2∶1∶2)的移栽容器中，移栽容器可采用塑料钵或育苗盘或苗床，移栽前浇足1/10MS基本培养基溶液，上覆盖塑料薄膜，保持湿度在70％～100％，7天后逐渐通风，15天后揭膜，在此期间喷洒1/10MS基本培养基溶液，继续在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为70％～90％的温室内，培养20～50天，在苗高5～15厘米，有8～15片叶时移栽入大田。

实验结果表明：用浓度为100ppm的生根粉浸泡处理幼苗根部，移栽成活率达到87％以上，以蛭石为基质的平均成活率达89.25％，前期生长良好，后期生长缓慢、长势差，因此，需在缓苗后生长一段时间进行2次移栽。以营养土为基质及用生根粉浓度为100ppm溶液浸泡的幼苗移栽成活率达87.65％，移栽初期部分叶缘干枯，对成活有一定影响，但后期生长健壮、长势良好，不需要二次移栽，有利于快繁成苗，简化了繁殖步骤。

实施例2

在本实施例组培苗的培养步骤中，所用的芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                       15g

琼脂粉                                       4g

6-(苄胺基)嘌呤                               0.2mg

在本实施例组培苗的培养步骤中，所用的增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                       15g

琼脂粉                                       4g

6-(苄胺基)嘌呤                               0.3mg

吲哚乙酸                                     0.3mg

赤霉素                                       0.1mg

酪蛋白                                       0.01g

在组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                       15g

琼脂粉                                           4g

吲哚-3-丁酸                                      0.1mg

在本实施例中其它培养步骤与实施例1相同。

实施例3

在本实施例组培苗的培养步骤中，所用的芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                           80g

琼脂粉                                           10g

6-(苄胺基)嘌呤                                   0.6mg

在本实施例组培苗的培养步骤中，所用的增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                           80g

琼脂粉                                           10g

6-(苄胺基)嘌呤                                   4mg

吲哚乙酸                                         0.9mg

赤霉素                                           3mg

酪蛋白                                           0.05g

在组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                           80g

琼脂粉                                           10g

吲哚-3-丁酸                                      0.9mg

在本实施例中其它培养步骤与实施例1相同。

实施例4

在以上实施例1～3组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                           30g

琼脂粉                                           5g

吲哚乙酸                                         2mg

在本实施例中所用的芽生长培养基和增殖培养基与相应的实施例相同。其它培养步骤与实施例1相同。实验表明：采用本实施例的生根培养基生根率达90.62％。

实施例5

在以上实施例1～3组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        15g

琼脂粉                                        4g

吲哚乙酸                                      0.5mg

在本实施例中所用的芽生长培养基和增殖培养基与相应的实施例相同。其它培养步骤与实施例1相同。

实施例6

在以上实施例1～3组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        80g

琼脂粉                                        10g

吲哚乙酸                                      3.5mg

在本实施例中所用的芽生长培养基和增殖培养基与相应的实施例相同。其它培养步骤与实施例1相同。

为了证明本发明的有益效果，发明人采用了本发明实施例1方法以及培养过程中所用的芽生长培养基、增殖培养基、生根培养基，进行了实验室实验，各种实验情况如下：

实验材料：马哈利樱桃砧木枝条、MS基本培养基、1/2MS基本培养基、吲哚乙酸、吲哚-3-丁酸、酪蛋白、6-(苄胺基)嘌呤、生根粉、琼脂粉、白砂糖。

材料提供单位：马哈利樱桃砧木枝条由杨凌中富绿色硅谷有限公司提供，MS基本培养基和1/2MS基本培养基按照《植物组织培养》一书MS基本培养基配方由陕西师范大学生命科学院中药材组培快繁实验室配制，吲哚-3-丁酸、吲哚乙酸和6-(苄胺基)嘌呤由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，生根粉、酪蛋白和琼脂粉由北京奥博星生物技术责任有限公司生产，白砂糖市售。

实验仪器：超净工作台、培养瓶。

实验方法与实验结果：

1、6-(苄胺基)嘌呤对芽成活及生长的影响

本试验是将健壮的幼芽灭菌消毒后接种于含不同浓度6-(苄胺基)嘌呤的

MS基本培养基上，1周后检查芽的成活率，实验结果见表1。

         表1 6-(苄胺基)嘌呤对芽成活及生长的影响表

6-BA(mg/L)    接种芽数      成活芽数      成活率(％)

0.2              54            38           70.37

0.5              56            42           75.00

1.0              52            28           53.85

2.0              47            21           44.68

实验结论：当6-(苄胺基)嘌呤浓度在0.5时，芽不仅成活率高，而且生长健壮，叶色浓绿，无畸形苗。当6-(苄胺基)嘌呤浓度在1.0以上时，苗愈伤化随激素浓度的增加愈伤化严重，幼苗生长畸形率增加。

2、激素对芽增殖的影响

(1)6-(苄胺基)嘌呤对芽增殖的影响

在MS基本培养基中加入不同浓度的6-(苄胺基)嘌呤进行芽增殖培养，实验结果见表2。

         表2 6-(苄胺基)嘌呤对芽增殖的影响表

6-BA(mg/L)  接种芽数    增殖芽数     芽增殖倍数       长势

1              64          345          5.39          +++

2              62          390          6.29          +++

3              64          446          6.97          +++

4              66          620          9.37          ++

5              63          710          11.27         +

实验结论：在6-(苄胺基)嘌呤浓度较低时，芽生长健壮，在浓度为2.0mg/L时芽长势好，苗整齐，叶色浓绿。浓度在3.0mg/L时苗生长健壮，但有少量愈伤组织出现，不利于生根，在浓度为3.0mg/L以上时，虽然芽增殖数量较大，但是芽弱小，无法用于下一次增殖用，而且愈伤组织大量产生，不利于生根。所以2.0mg/L为6-(苄胺基)嘌呤用于芽增殖的最佳浓度。

(2)6-(苄胺基)嘌呤与吲哚乙酸配合使用对芽增殖的影响

在MS基本培养基中加入不同浓度的6-(苄胺基)嘌呤和吲哚乙酸进行芽增殖培养，实验结果见表3。

         表3 6-(苄胺基)嘌呤与吲哚乙酸配合使用对芽增殖的影响表

6-BA(mg/L)  IAA(mg/L)    接种芽数    芽增殖数      芽增殖倍数     长势

1.0           0.2           55          297          5.40         ++++

1.0           0.5           49          270          5.41         +++

1.0           1.0           53          302          5.70         ++

2.0           0.2           54          319          5.91         ++

2.0           0.5           52          354          6.81         ++++

2.0           1.0           39          268          6.87         ++

实验结论：在6-(苄胺基)嘌呤的浓度为2.0mg/L和吲哚乙酸为0.5mg/L时苗生长健壮整齐，增殖率高。

(3)赤霉素对芽增殖的影响

在MS基本培养基中加入不同浓度的赤霉素进行芽增殖培养，实验结果见表4。

              表4赤霉素对芽增殖的影响表

赤霉素    接种芽数    增殖芽数    芽增殖倍数    平均苗高

(mg/L)                                            (cm)

0.2         50         346         6.92           2.55

0.5         51         360         7.06           2.79

1.0         47         336         7.15           2.95

2.0         51         368         7.22           3.03

实验结论：当赤霉素的浓度为0.5mg/L时苗生长迅速整齐，苗健壮，叶色浓绿；浓度大于0.5mg/L时苗生长不整齐而且有畸形苗出现。

3、不同条件对生根的促进作用

利用混合正交表L₈(4×2⁴)安排实验，实验有5个因素，其中A因素为4水平，其余四个因素为2水平：

A因素为不同的激素配比，有四个水平：萘乙酸0.5mg/L、吲哚乙酸2.0mg/L、吲哚乙酸6.0mg/L+吲哚-3-丁酸0.2mg/L、吲哚-3-丁酸0.6mg/L；

B因素为赤霉素，有两个浓度水平：0mg/L、0.5mg/L；

C因素为酪蛋白，有两个浓度水平：0mg/L、0.1mg/L；

D因素为光照，有两个水平：正常光照培养生根(光照强度为3500～45001x、每天照射10-12小时)和完全黑暗培养生根；

E因素为在生根培养之后是否转接到1/2MS基本培养基上，有两个水平：转接与不转接；

共安排8个实验，试验这5个因素对砧木生根率的影响，本试验全部在1/2MS基本培养基中添加以上成分，实验结果及结果分析见表5和表6。

表5不同条件对生根的影响情况表

表6不同条件对生根率的影响情况正交实验结果分析表

实验结论：根据正交试验结果，可见暗培养对马哈利樱桃砧木的生根影响最大。赤霉素对发根率有较强的抑制作用，从根的生长状态及节约成本考虑，生产运用的最佳实验组合为：A₂B₁C₁D₂E₁或A₄B₁C₁D₂E₁。根据以上实验结果补充实验：在1/2MS基本培养基中加入吲哚乙酸2.0mg/L或吲哚-3-丁酸0.6mg/L，暗培养7天后进行自然光炼苗生根，生根率分别达90.62％和85.21％，且根系健壮，苗壮且生长整齐，符合工厂化生产的要求。

4、移栽实验

分别试验了蛭石、营养土(蛭石∶腐殖土∶田园土＝2∶1∶2)两种基质和不同浓度(0、50、100ppm)的生根粉对组培苗移栽成活率的影响，实验结果见表7。

          表7移栽基质和不同处理方法对移栽的影响表

基质    生根粉浓度    移栽数      成活数        成活率(％)

           (ppm)

蛭石       0            68          58            85.29

蛭石       50           65          60            92.31

蛭石       100          71          64            90.14

营养土     0            82          68            82.93

营养土     50           77          67            87.01

营养土     100          81          71            87.65

实验结论：处理的移栽成活率均达到87％以上，以蛭石为基质的平均成活率达89.25％，前期生长良好，后期生长缓慢、长势差，因此，需在缓苗后生长一段时间进行2次移栽。以营养土为基质及用生根粉浓度为100ppm溶液浸泡的幼苗移栽成活率达87.65％，移栽初期部分叶缘干枯，对成活有一定影响，但后期生长健壮、长势良好，不需要二次移栽，有利于快繁成苗，简化了繁殖步骤。

Claims (3)

1、一种马哈利樱桃砧木繁殖方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)组培苗的制备

原材料的预处理：剪取大田栽培的盛果期单株的无病虫害的健壮营养枝，切取其幼芽，流水冲洗干净，用干净滤纸吸干；在超净工作台上将冲洗干净的幼芽在70％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗3次，每次5分钟，再置入0.1％HgCl₂溶液中灭菌6～8分钟，用无菌水冲洗幼芽3～5次，每次5分钟，最后用无菌滤纸吸干，作为外植体扦***1/2MS基本培养基中使芽生长，每隔3～5天将芽转接入新的1/2MS基本培养基中，重复2～3次，待培养基不再变色时，将芽转接入芽生长培养基中，该芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                    15～80g

琼脂粉                                    4～10g

6-(苄胺基)嘌呤                            0.2～0.5mg

当芽长至1.5～3cm，有3～5片真叶时，将苗转入增殖培养基中进行繁殖，该增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                    15～80g

琼脂粉                                    4～10g

6-(苄胺基)嘌呤                            0.3～4mg

吲哚乙酸                                  0.3～0.9mg

赤霉素                                    0.1～3mg

酪蛋白                                    0.01～0.05g

配制好的增殖培养基分装在培养瓶中，每瓶装25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将增殖生长的丛生芽分离成单个芽接入培养瓶中，其中生长较快的苗在转接时可切成带1～2个芽的茎段扦插于增殖培养基上，培养瓶置于光照强度为3500～4500lx、温度为20℃～30℃、湿度为70％～90％的培养室中培养，每天照射10～12小时，每一次继代培养使用新鲜配置的增殖培养基，继代培养条件与第一代培养条件相同，选取繁殖8～30代的1.5～3cm高的健壮组培苗或1.5～3cm的带顶芽的上部茎段为材料进行生根培养；

(2)组培苗生根培养

将(1)中切好的组培苗或茎段放入生根培养基中进行生根培养，该生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                         15～80g

琼脂粉                                         4～10g

吲哚-3-丁酸                                    0.1～0.9mg

或所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                         15～80g

琼脂粉                                         4～10g

吲哚乙酸                                       0.5～3.5mg

将配制好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，培养瓶移入温度为18℃～22℃、湿度为70％～90％的暗室中进行暗培养，暗培养3～7天；

(3)长苗炼苗培养

将经过暗培养的培养瓶直接移入光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室内，每天光照9～11小时，驯化20～25天，打开瓶盖加入0.5～1.0厘米高自来水炼苗5～10天，当苗高2～6厘米，根长1～2.5厘米时进行移栽；

(4)移栽

取出(3)中经过炼苗的幼苗，洗净根上残留的生根培养基，用浓度为100ppm的生根粉浸泡处理幼苗根部，移入装有营养土的移栽容器中，移栽前浇足1/10MS基本培养基溶液，上覆盖塑料薄膜，保持湿度在70％～100％，7天后逐渐通风，15天后揭膜，在此期间喷洒1/10MS基本培养基溶液，继续在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为70％～90％的温室内，培养20～50天，在苗高5～15厘米，有8～15片叶时移栽入大田。

2、按照权利要求1所述的马哈利樱桃砧木繁殖方法，其中芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        20～50g

琼脂粉                                        4.5～7g

6-(苄胺基)嘌呤                                0.2～0.5mg

其中增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        20～50g

琼脂粉                                        4.5～7g

6-(苄胺基)嘌呤                                0.4～3mg

吲哚乙酸                                      0.4～0.8mg

赤霉素                                        0.1～2mg

酪蛋白                                        0.01～0.04g

其中生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        20～50g

琼脂粉                                        4.5～7g

吲哚-3-丁酸                                   0.3～0.7mg

其中生根培养基或为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        20～50g

琼脂粉                                        4.5～7g

吲哚乙酸                                      1～3mg。

3、按照权利要求1所述的马哈利樱桃砧木繁殖方法，其中芽生长培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        30g

琼脂粉                                        6g

6-(苄胺基)嘌呤                                0.5mg

其中增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        30g

琼脂粉                                        6g

6-(苄胺基)嘌呤                                2mg

吲哚乙酸                                      0.5mg

赤霉素                                        0.2mg

酪蛋白                                        0.02g

其中生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                        30g

琼脂粉                                        5g

吲哚-3-丁酸                                   0.6mg

其中生根培养基或为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

白砂糖                                            30g

琼脂粉                                            5g

吲哚乙酸                                          2mg。