CN102477427B

CN102477427B - 辅助鉴定绿壳蛋鸡的专用引物及其应用

Info

Publication number: CN102477427B
Application number: CN 201010568447
Authority: CN
Inventors: 杨宁; 姚俊峰; 曲鲁江; 徐桂云; 郑江霞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2030-11-26
Also published as: CN102477427A

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的专用引物及其应用。本发明提供的专用引物是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。本发明的方法包括如下步骤：用特异性引物对对待测样本的基因组DNA进行PCR扩增，然后MscI酶切PCR扩增产物，最后将PCR扩增产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切条带大小即可判别个体的基因型。本发明为绿壳蛋鸡育种工作提供了新的技术手段，有助于加快育种进展，节约育种成本，为加速东乡绿壳蛋鸡纯率的分子育种奠定了基础，为绿壳蛋鸡的育种工作提供了便利，将在绿壳蛋鸡的育种中发挥巨大作用。

Description

辅助鉴定绿壳蛋鸡的专用引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的专用引物及其应用。

背景技术

绿壳蛋鸡是我国的优良蛋鸡之一，所产的绿壳蛋因为其独特的蛋壳颜色和优秀的蛋品质被国内外专家高度重视和关注，并吸引消费者争相购买。我国现有的绿壳蛋鸡纯系是由一些地方品种选育而来的，由于群体来源广泛而且选育时间短，所以相对于经高度选育的白来航等品系，绿壳蛋鸡品系纯合度并不高。按照常规育种方法，提高绿壳纯度的选育就是在纯系留种时淘汰产生粉壳后代的种鸡以及杂交测定以选出杂合子，理论上一次测定就可以分出不同基因型。但是由于受到公鸡产蛋表型无法直接测定以及留种后代数有限等条件的约束，需要多代连续选育才能达到育种目标。

Bartlett et al.(Bartlett J R，Jones C P and Smith E J.Linkage analysisof endogenous viral elementl，blue eggshell，and pea comb loci in chickens(J).The Journal of Heredity，1996，87(1)：67-70)将鸡的绿壳基因(O)定位在1号染色体短臂上，它与内源病毒因子(ev1)及豆冠位点(P)连锁。杨宁等(杨宁，赵瑞，李显耀，徐桂云，杨长锁，严华祥.鸡绿壳蛋基因分子标记的研究.家禽研究最新进展——第十一次全国家禽学术讨论会论文集，2003.37-39)通过杂交试验发现中国东乡绿壳蛋鸡的绿壳性状也是由单基因控制的显性性状。东乡绿壳蛋鸡均携带绿壳基因，可分为纯合型(OO)和杂合型(Oo)。纯合型东乡绿壳蛋鸡与非绿壳蛋鸡(如白来航蛋鸡)杂交，F1代均产绿壳蛋。杂合型东乡绿壳蛋鸡与非绿壳蛋鸡(如白来航蛋鸡)杂交，F1代中，部分产绿壳蛋，部分产粉壳蛋。

绿壳蛋鸡产蛋量少，纯系产蛋期平均产蛋160个左右，所以一般用白来航鸡与之进行级进杂交，以提高产蛋量。杂交后代一般都出现分离现象，大部分产绿壳蛋，还有一部分产粉壳蛋。可能由于绿壳蛋鸡来源于地方品种，我国地方品种中很大一部分是褐壳蛋品种，所以绿壳蛋鸡中也有可能混有褐壳蛋的遗传因子，而褐壳蛋鸡和白壳蛋鸡(很大一部分是白来航)杂交后代产粉壳蛋，所以绿壳蛋鸡与白来航杂交后代会有粉壳蛋的出现(赵瑞，刘珍珍，徐桂云，杨宁.利用PCR-SSCP分析鸡绿壳蛋基因的SNP标记.农业生物技术学报.2006，14(5)：673-676)。

研究绿壳基因的遗传规律，提高绿壳蛋鸡品系的纯合度是很有必要的。利用分子标记辅助选择进行分子育种不但可以进行直接选择，还可以在早期选择，大大加快遗传进展。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定绿壳蛋鸡的专用引物及其应用。

本发明提供的专用引物为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

所述引物对可用于辅助鉴定绿壳蛋鸡，也可进一步用于辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系。

本发明还保护一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法，包括如下步骤：以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶MscI酶切PCR扩增产物；如果PCR扩增产物只有一种，且不能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡；如果PCR扩增产物有两种，且其中一种不能被限制性内切酶MscI酶切，另一种能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡；如果PCR扩增产物只有一种，且能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的非绿壳蛋鸡。

本发明还保护一种辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系的方法，包括如下步骤：以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶MscI酶切PCR扩增产物；如果PCR扩增产物只有一种，且不能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡纯系；如果PCR扩增产物有两种，且其中一种不能被限制性内切酶MscI酶切，另一种能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡杂合体；如果PCR扩增产物只有一种，且能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的非绿壳蛋鸡。

限制性内切酶MscI的酶切序列(其中的箭头所指位置为酶切位点)：

5’-TGG↓CCA-3’

3’-ACC↑GGT-5’。

所述待测鸡可为白来航蛋鸡或东乡绿壳蛋鸡。

所述PCR扩增的反应体系为：所述PCR扩增的反应体系为：基因组DNA 50-100ng，含Mg²⁺的10×PCR扩增缓冲液1.5μl，4mmol/L的dNTPs混合液0.8μl，10μmol/L的序列表的序列1所示DNA(上游引物)0.3μl，10μmol/L的序列表的序列2所示DNA(下游引物)0.3μl，Taq DNA聚合酶0.5U，补充ddH₂O至15μl。所述PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min。

所述酶切的反应体系为：PCR扩增产物3.5μl，10×酶切缓冲液1μl，限制性内切酶MscI4U，补充ddH₂O至10μl。所述酶切的反应条件为：37℃2-4个小时。

所述引物对可用于制备如下(A)或(B)的试剂盒：

(A)辅助鉴定鉴定绿壳蛋鸡的试剂盒；

(B)辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系的试剂盒。

本发明还保护含有所述引物对的如下(A)或(B)的试剂盒：

(A)辅助鉴定鉴定绿壳蛋鸡的试剂盒；

(B)辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系的试剂盒。

所述引物对可用于鸡的育种，是用上述方法鉴定得到的候选的绿壳蛋鸡纯系进行育种。

本发明的方法包括如下步骤：用特异性引物对对待测样本的基因组DNA进行PCR扩增，然后MscI酶切PCR扩增产物，最后将PCR扩增产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切条带大小即可判别个体的基因型。本发明的方法优点如下：电泳不出现杂带，基因型判型非常准确；耗时较短，仅需约4～6个小时；检测费用很低，每只鸡的检测费用只需在1.5元左右；操作简单、并可实现自动化、规模化检测；在产蛋前即可检测绿壳蛋鸡的基因型，实现了早期选择，且可以鉴别公鸡是否携带隐性等位基因。可根据本发明方法开发检测试剂盒。本发明的方法进行育种时，只需将亲本中的带隐性等位基因的个体剔除，即可使商品蛋鸡全部产绿壳蛋，为生产者带来良好效益。本发明为绿壳蛋鸡育种工作提供了新的技术手段，有助于加快育种进展，节约育种成本，为加速东乡绿壳蛋鸡纯率的分子育种奠定了基础，为绿壳蛋鸡的育种工作提供了便利，将在绿壳蛋鸡的育种中发挥巨大作用。

附图说明

图1为实施例2中，第一种样本的电泳图。

图2为实施例2中，第二种样本的电泳图。

图3为实施例2中，第三种样本的电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。引物合成及测序工作均由生工生物技术有限公司完成。

实施例1、多态位点的发现和pira-PCR-RFLP检测方法的建立

一、O基因在不同蛋鸡中的表达量差异的发现和引物对的设计

利用荧光定量PCR对绿壳蛋鸡纯合型、绿壳蛋鸡杂合型及非绿壳蛋鸡输卵管子宫部O基因的表达量进行分析，结果表明，该基因在绿壳蛋鸡纯系中表达量极高，在非绿壳蛋鸡中表达量极低甚至不表达，而在绿壳蛋鸡杂合型中的表达量位于纯合绿壳蛋鸡和非绿壳蛋鸡之间。

根据O基因设计引物如下：

F(上游引物)：5’-ACTATATCTCCCCTTAAACTA-3’(序列表的序列1)；

R(下游引物)：5’-CAAAATCGTCAAGATAAGAGATGGC-3’(序列表的序列2)。

二、多态位点的发现

将东乡绿壳蛋鸡杂合型与白来航蛋鸡杂交，得到F1代。

1、F1代的产蛋性状分析

通过与白来航蛋鸡杂交，分别确定步骤二中的F1代个体是纯合型还是杂合型。如果F2代个体均为绿壳蛋鸡(即没有发生性状分离)，该F1代个体为纯系。如果F2代个体中既有绿壳蛋鸡也有非绿壳蛋鸡，该F1代个体为杂合型。

2、多态位点的发现和pira-PCR-RFLP检测方法的建立

分别提取F1代(或白来航蛋鸡)的基因组DNA作为模板，用设计的引物对(F和R)进行PCR扩增。

用限制性内切酶MscI酶切PCR产物，将PCR扩增产物及其酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。

所有样本的PCR扩增产物均在相同的位置显示一条带，约174bp；所有纯合型F1代的酶切产物均显示一条带，且位置与PCR扩增产物的位置相同，约174bp；所有白来航蛋鸡的酶切产物均显示一条带，与PCR扩增产物的条带相比，酶切产物条带的位置离点样孔略远，约150bp；所有杂合型F1代的酶切产物均显示两条带，一条与PCR扩增产物的位置相同，另一条与白来航蛋鸡的酶切产物的位置相同。

分析原因如下：白来航蛋鸡与纯合型F1代的PCR扩增产物的大小相同或相似(约174bp)，但具体核苷酸存在差异(可能为SNP位点)，白来航蛋鸡的PCR扩增产物中具有MscI酶切识别位点，纯合型F1代的PCR扩增产物中不具有MscI酶切识别位点；纯合型F1代的PCR扩增产物不能被MscI酶切，所以酶切产物电泳显示的位置与PCR产物相同；白来航蛋鸡的PCR扩增产物能被MscI酶切，所以酶切产物电泳显示的位置与PCR产物不同，应该还产生了一个约24bp的小片段，只是该小片段在该电泳条件下没有显示出来；杂合型F1代则同时具有白来航蛋鸡和纯合型的两种DNA，所以带型为白来航蛋鸡和纯合型带型的叠加，同时显示与PCR扩增产物位置相同的带和与白来航蛋鸡的酶切产物位置相同的带。

以待测鸡的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增、酶切和电泳，产生的带型与东乡绿壳蛋鸡绿壳性状密切关联，可作为绿壳性状筛选的分子标记，从而可以有效剔除隐性非绿壳基因，提高东乡绿壳蛋鸡群体的绿壳率。

实施例2、pira-PCR-RFLP检测方法的应用

实验材料：33只东乡绿壳蛋鸡和12只白来航蛋鸡；国家家禽测定中心；参考文献：赵瑞，刘珍珍，徐桂云和杨宁.(2006).利用PCR-SSCP分析鸡绿壳蛋基因的SNP标记.农业生物技术学报14(5)：673-676.。

一、对个体进行基因型分型

分别对每个个体进行基因型分型，方法如下：

1、提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用引物对(F和R)进行PCR扩增，得到PCR产物。

F(上游引物)：5’-ACTATATCTCCCCTTAAACTA-3’(序列表的序列1)；

R(下游引物)：5’-CAAAATCGTCAAGATAAGAGATGGC-3’(序列表的序列2)。

PCR反应体系(15μl)：基因组DNA 50-100ng，10×PCR扩增缓冲液(含Mg²⁺)1.5μl，dNTPs(4mmol/l)混合液0.8μl，上下游引物(10μmol/l)各0.3μl，Taq DNA聚合酶0.5U，用ddH₂O补充反应体系至15μl。

PCR反应条件：95℃变性5min；循环程序为：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

3、酶切

取步骤2的PCR产物，37℃酶切2-4小时。

酶切反应体系：将3.5μl PCR产物、10×酶切缓冲液1μl、4U限制性内切酶MscI混匀，补充ddH₂O至10μl。

4、电泳

将步骤2的PCR扩增产物和步骤3的酶切产物分别进行3％琼脂糖凝胶(电压8V/cm，时间30min)。使用凝胶成像***观察结果。

根据PCR扩增产物和步骤3的酶切产物的电泳结果，所有被检测个体可分为3种：

第一种：PCR扩增产物与酶切产物各显示一条带，酶切产物小于PCR扩增产物；PCR扩增产物约174bp，酶切产物约150bp；

第二种：PCR扩增产物与酶切产物各显示一条带，且位置相同；均约174bp；

第三种：PCR扩增产物显示一条带，酶切产物显示两条带；PCR扩增产物约174bp，酶切产物分别为约174bp和约150bp。

第一种的电泳图见图1。图1中，1：PCR扩增产物；2：酶切产物；M：Marker；第二种的电泳图见图2。图2中，1：PCR扩增产物；2：酶切产物；M：Marker；第三种的电泳图见图3。图3中，1：PCR扩增产物；2：酶切产物；M：Marker。

12只白来航蛋鸡均为第一种；33只东乡绿壳蛋鸡中，23只为第二种，10只为第三种。

二、产蛋性状分析

将东乡绿壳蛋鸡分别与白来航蛋鸡杂交，分别确定个体是纯合型(纯系)还是杂合型。如果F1代个体均为绿壳蛋鸡(即没有发生性状分离)，该东乡绿壳蛋鸡为纯系。如果F1代个体中既有绿壳蛋鸡也有非绿壳蛋鸡，该东乡绿壳蛋鸡为杂合型。结果表明，显示第二种带型的东乡绿壳蛋鸡均为纯系；显示第三种带型的东乡绿壳蛋鸡均为杂合型。

实施例3、pira-PCR-RFLP检测方法的应用

实验材料：上海新扬商品代东乡绿壳蛋鸡(杂合型)；中国农业大学家禽资源基地东乡绿壳蛋鸡(纯系)(参考文献：赵瑞，刘珍珍，徐桂云和杨宁.(2006).利用PCR-SSCP分析鸡绿壳蛋基因的SNP标记.农业生物技术学报14(5)：673-676.。)。

杂合型与纯合型的判断标准如下：将东乡绿壳蛋鸡分别与白来航蛋鸡杂交，分别确定个体是纯合型(纯系)还是杂合型。如果F1代个体均为绿壳蛋鸡(即没有发生性状分离)，该东乡绿壳蛋鸡为纯系。如果F1代个体中既有绿壳蛋鸡也有非绿壳蛋鸡，该东乡绿壳蛋鸡为杂合型。

对所有个体进行基因型分型，方法同实施例2，结果见表1。

表1鸡1号染色体短臂G 67334934T在几个鸡群中的分布

本发明的引物对和方法鉴定纯合绿壳蛋鸡的准确性均达到了100％。本发明的引物对和方法此引物可用于在绿壳蛋鸡群体中剔除含G的个体，尤其是对公鸡的选择更有重要意义。

Claims

1.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

2.权利要求1所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的应用。

3.权利要求1所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系中的应用。

4.一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法，包括如下步骤：以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶MscI酶切PCR扩增产物；如果PCR扩增产物只有一种，且不能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡；如果PCR扩增产物有两种，且其中一种不能被限制性内切酶MscI酶切，另一种能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡；如果PCR扩增产物只有一种，且能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的非绿壳蛋鸡；所述待测鸡为白来航蛋鸡或东乡绿壳蛋鸡。

5.一种辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系的方法，包括如下步骤：以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶MscI酶切PCR扩增产物；如果PCR扩增产物只有一种，且不能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡纯系；如果PCR扩增产物有两种，且其中一种不能被限制性内切酶Msc I酶切，另一种能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的绿壳蛋鸡杂合体；如果PCR扩增产物只有一种，且能被限制性内切酶MscI酶切，待测鸡为候选的非绿壳蛋鸡；所述待测鸡为白来航蛋鸡或东乡绿壳蛋鸡。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：基因组DNA50-100ng，含Mg²⁺的10×PCR扩增缓冲液1.5μl，4mmol/L的dNTPs混合液0.8μl，10μmol/L的序列表的序列1所示DNA0.3μl，10μmol/L的序列表的序列2所示DNA0.3μl，Taq DNA聚合酶0.5U，补充ddH₂O至15μl；所述PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min；所述酶切的反应体系为：PCR扩增产物3.5μl，10×酶切缓冲液1μl，限制性内切酶MscI4U，补充ddH₂O至10μl；所述酶切的反应条件为：37℃2-4个小时。

7.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴定绿壳蛋鸡的试剂盒中的应用。

8.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系的试剂盒中的应用。

9.含有权利要求1所述引物对的辅助鉴定绿壳蛋鸡的试剂盒。

10.含有权利要求1所述引物对的辅助鉴定绿壳蛋鸡纯系的试剂盒。

11.权利要求1所述引物对在鸡的育种中的应用，是用候选的绿壳蛋鸡纯系进行育种；所述候选的绿壳蛋鸡纯系是采用权利要求5所述方法鉴定得到的。