CN104672315B - 控制黄瓜无卷须性状的基因及与黄瓜卷须性状相关的snp标记 - Google Patents

控制黄瓜无卷须性状的基因及与黄瓜卷须性状相关的snp标记 Download PDF

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Abstract

本发明涉及控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520，以及一种与黄瓜卷须性状相关的SNP标记及其应用，所述SNP标记位于如Seq ID No.2所示的黄瓜Csa5G644520基因第1012bp处，此处碱基为T的黄瓜表现为无卷须性状，而此处碱基为A的黄瓜表现为有卷须性状。本发明利用稀有SNP的方法和图位克隆等方法寻找到控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520以及与黄瓜卷须性状相关的SNP标记。通过衍生的酶切扩增多态性序列(dCAPS)的方法检测待测黄瓜的基因型，根据基因型即可判断黄瓜植株是否有卷须，从而加快无卷须黄瓜的育种进程。

Description

控制黄瓜无卷须性状的基因及与黄瓜卷须性状相关的SNP 标记
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520及与黄瓜卷须性状相关的SNP标记。
背景技术
无卷须是黄瓜的重要株型性状。几乎所有的黄瓜资源和品种都具有卷须性状，在来源于西双版纳地区的黄瓜品种中发现一份罕见的无卷须的黄瓜资源，该黄瓜资源没有卷须。卷须是黄瓜的攀援器官，但在人工栽培条件下通过支架和绑蔓，卷须已经失去它应有的作用，变为无用器官。但卷须作为一个器官仍然存在于植株上，几乎节节都会发生，卷须攀援消耗大量的养分，并且卷须会与同节位雌花强烈地竞争养分。在黄瓜的大田生产中，为实现高产，经常需要打掉卷须，花费大量的人力物力。因此培养无卷须黄瓜成为黄瓜株型育种改良的新方向。
分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良作物的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为农作物育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在农作物育种中的作用将日益突出。在黄瓜育种中，人们希望选择与黄瓜卷须性状密切相关的DNA标记，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。
传统的遗传学表明，黄瓜无卷须性状由一对隐性基因控制，但关于黄瓜无卷须性状的遗传定位和分子机制还不清楚，导致相关的分子育种工作进展缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520。
本发明的另一目的是提供与黄瓜卷须性状相关的SNP标记及其应用。
本发明的再一目的是提供用于检测所述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记的引物对及含有该引物对的试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种黄瓜Csa5G644520蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供控制黄瓜无卷须性状的，且编码所述Csa5G644520蛋白的基因Csa5G644520，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或在严格条件下与Seq ID No.2所示序列杂交的核苷酸序列。所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
本发明还提供含有基因Csa5G644520的载体。
本发明还提供含有基因Csa5G644520的转基因细胞系。
本发明还提供含有基因Csa5G644520的工程菌。
本发明还提供基因Csa5G644520在控制黄瓜无卷须性状中的应用。
进一步地，本发明提供一种与黄瓜卷须性状相关的SNP标记，其位于如Seq IDNo.2所示的控制黄瓜卷须发育的基因Csa5G644520第1012bp处，此处碱基为T的黄瓜表现为无卷须性状，而此处碱基为A的黄瓜表现为有卷须性状。
本发明还提供用于检测上述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记的特异性引物对，包括正向引物F 5’-AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3’和反向引物R 5’-TTGGAAGCTGGAAAATAGAAAATAT-3’。
本发明还提供一种鉴定有无卷须性状的黄瓜品种的方法，包括以下步骤：1)提取待测黄瓜的基因组DNA；2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增反应；
PCR扩增体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水；
PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；
3)检测PCR扩增产物，具体如下：
采用dCAPS法检测PCR扩增产物：用内切酶SspI对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条140bp大小的条带，则待测黄瓜在位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处的碱基为T，属于无卷须性状的黄瓜品种；检测结果为一条117bp大小的条带，或同时含有140bp和117bp两条带，则待测黄瓜在位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处的碱基为A或A/T杂合，属于有卷须性状的黄瓜品种。
本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测黄瓜卷须性状的试剂盒。优选所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。
本发明还提供所述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。即，根据基因型进行无卷须黄瓜品种的选育，从而加快黄瓜育种进程。
从世界各地收集了3342份黄瓜资源，其中只有一份黄瓜材料没有卷须，黄瓜无卷须是个稀有突变性状。本发明已经从3342份黄瓜资源中筛选了115份黄瓜核心种质，并对这115份黄瓜核心种质材料进行重测序分析。生物信息比较分析无卷须黄瓜材料与其它114份材料的基因组序列，从约360万个SNP中，筛选到无卷须黄瓜材料特有的1018个稀有SNP，其中导致异义突变的稀有SNP数目为75个，分别对应着75个基因，并结合黄瓜转录组分析，发现了一个只在卷须组织里特异表达的基因Csa5G644520，并推测该基因控制黄瓜卷须发育，该基因上的稀有SNP是导致黄瓜卷须表型改变的关键位点。与卷须表型相关的稀有SNP位点(图1)，该SNP位点位于编码Csa5G644520蛋白的基因序列第1012bp处，由A突变为T，该突变导致Csa5G644520蛋白的338位氨基酸从天冬酰胺变为酪氨酸。即114份有卷须的黄瓜材料在该位点都是A，1份无卷须的黄瓜在该位点是T。同时，对F2群体中随机挑选的100个单株进行PCR测序，检测结果表明与卷须表型相关的稀有SNP位点的信息与单株的表型性状完全符合，为共分离SNP标记。
为了验证Csa5G644520就是控制黄瓜卷须发育的基因，应用图位克隆的方法进行验证。用无卷须的黄瓜资源(tltl)和一份有卷须的黄瓜资源(TlTl)构建了6623单株的F2代群体，首先随机挑选了186个单株，对无卷须tl基因进行了初步定位，初定位将tl基因定位在SSR19343和SSR0618两个标记之间，遗传距离为3.4cM(图2)；选用初定位的两个标记SSR19343和SSR20486筛选F2群体中余下的6437单株，同时在初定位的基础上向内开发Indel标记和SNP标记并检测筛选到的重组单株，最终将tl基因定位在SNP35和SNP47的之间的18kb范围内(图3)，该范围内仅有1个基因(即Csa5G644520基因)，且与黄瓜卷须表型相关的稀有SNP(即SNP1)位于Csa5G644520基因的外显子上(图3)。此外，我们分析了115份核心种质在SNP35和SNP47的之间的18kb范围内的所有变异(包括SNP、InDel和SV等)，发现有2份有卷须种质(9930和CG8216)在该18kb区域内与无卷须种质(tltl)除了存在SNP1的唯一差异，其余区域序列完全一致(图4)，由此证明Csa5G644520基因就是控制黄瓜无卷须性状基因tl，SNP1即为无卷须性状产生的原因。为了进一步验证Csa5G644520基因上的稀有SNP1是导致无卷须性状产生的原因，我们针对稀有SNP1开发dcaps标记，在3342份黄瓜资源中进行验证(图5)，结果发现只有无卷须种质仅出现一条140bp大小的条带，即在Csa5G644520基因序列第1012bp处为碱基T，其余3341份有卷须黄瓜资源检测结果只有一条117bp条带，即在Csa5G644520基因序列第1012bp处为碱基A。
综上所述，Csa5G644520基因就是控制黄瓜无卷须性状基因tl，突变的SNP位点位于编码Csa5G644520蛋白的基因序列第1012bp处，由A突变为T，导致Csa5G644520蛋白的338位氨基酸从天冬酰胺变为酪氨酸，从而导致黄瓜由有卷须性状变为无卷须性状。
本发明首次定位克隆出控制黄瓜无卷须性状的基因。本发明还发现了一个与黄瓜卷须表型相关的SNP位点，可用于黄瓜株型改良育种，便于大规模快速准确地筛选无卷须黄瓜育种材料，大大加快无卷须黄瓜的育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例1中通过测序来验证与黄瓜卷须表型相关的稀有SNP位点；其中，a为无卷须单株，b为纯合有卷须单株，c为杂合有卷须单株，虚线处为突变位点。
图2为本发明实施例2中通过图位克隆的方法对控制黄瓜无卷须性状的Csa5G644520基因(tl基因)进行初步遗传定位的结果。
图3为本发明实施例3中通过图位克隆的方法对黄瓜无卷须性状的Csa5G644520基因(tl基因)定位克隆的结果。tl定位区间的18kb范围内仅含有一个基因，即Csa5G644520。
图4为本发明实施例4中对控制黄瓜无卷须性状的SNP的确认结果。生物信息学分析发现有2份有卷须种质(9930和CG8216)在该18kb区域内与无卷须种质(tltl)除了存在SNP1的唯一差异，其余区域变异完全一致。三角代表SV，黑点代表SNP，圆圈代表基因组同一物理位置上有差异的SNP。
图5为本发明实施例5中对控制黄瓜无卷须性状的SNP在世界范围内对3342份黄瓜资源验证的部分结果示意图。dCAPS检测无卷须种质仅有一条140bp大小的条带，其余3341份有卷须黄瓜资源检测结果仅有一条117bp条带。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1与黄瓜卷须性状相关的SNP位点的发现
从世界各地收集了3342份黄瓜资源，其中只有一份黄瓜材料没有卷须，黄瓜无卷须是个稀有突变性状。本发明已经从3342份黄瓜资源筛选了115份黄瓜核心种质，并对这115份黄瓜核心种质材料进行重测序分析。生物信息比较分析无卷须黄瓜材料与其它114份材料的基因组序列，从360万个SNP中，筛选到无卷须黄瓜材料特有的1018个稀有SNP，其中导致异义突变的稀有SNP数目为75个，分别对应着75个基因，并结合黄瓜转录组分析，发现了一个只在卷须组织里特异表达的基因Csa5G644520，并推测该基因控制黄瓜卷须发育，该基因上的稀有SNP是导致黄瓜卷须表型改变的关键位点。与卷须表型相关的稀有SNP位点(图1)，该SNP位点位于编码Csa5G644520蛋白的基因序列第1012bp处，由A突变为T，该突变导致Csa5G644520蛋白的338位氨基酸从天冬酰胺变为酪氨酸。即114份有卷须的黄瓜材料在该位点都是A，1份无卷须的黄瓜在该位点是T。同时，对F2群体中随机挑选的100个单株进行PCR测序，检测结果表明与卷须表型相关的稀有SNP位点的信息与单株的表型性状完全符合，为共分离SNP标记。
其中，黄瓜Csa5G644520蛋白的氨基酸序列及编码该蛋白的基因Csa5G644520序列分别如SEQ ID No.1和2所示。
设计用于扩增与黄瓜卷须性状相关的SNP标记的引物对，包括正向引物F 5’-CTAGGGAAAGGACTAAGGAGAA-3’和反向引物R 5’-AGTCAAATTGGAAGCTGGAAAA-3’。扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.3所示。该SNP位点位于该PCR扩增片段的240bp处，该处碱基可以为T或A。
其中，PCR反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。
PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。
实施例2控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520的遗传初定位
为了验证Csa5G644520就是控制黄瓜卷须发育的基因，应用图位克隆的方法进行验证。用无卷须的黄瓜资源(tltl)和一份有卷须的黄瓜资源(TlTl)构建了6623单株的F2代群体，首先随机挑选了186个单株，对无卷须tl基因进行了初步定位，初定位将tl基因定位在SSR19343和SSR0618两个标记之间，遗传距离为3.4cM(图2)。
实施例3控制黄瓜无卷须性状的基因的克隆
为了克隆黄瓜无卷须基因tl，选用初定位的两个标记SSR19343和SSR20486筛选余下的F2群体(6437个单株)中筛选，同时在初定位的基础上向内开发Indel标记和SNP标记，并检测筛选得到的重组单株，最终将tl基因定位在物理距离约18kb范围内，该范围内仅有1个基因Csa5G644520，即Csa5G644520基因就是黄瓜无卷须基因tl，且与黄瓜卷须表型相关的稀有SNP(即SNP1)位于Csa5G644520基因的外显子上(图3)。
实施例4控制黄瓜无卷须性状的SNP的确认证明
我们分析了115份核心种质在SNP35和SNP47的之间的18kb范围内的所有变异(包括SNP、InDel和SV等)，发现有2份有卷须种质(9930和CG8216)在该18kb区域内与无卷须种质(tltl)除了存在SNP1的唯一差异，其余区域序列完全一致(图4)，由此证明Csa5G644520基因就是控制黄瓜无卷须性状基因tl，SNP1(图4)即为无卷须性状产生的原因。
实施例5控制黄瓜无卷须性状的SNP标记的获得以及该标记在世界范围3342份黄瓜资源的验证
为了进一步验证Csa5G644520基因上的稀有SNP1是导致无卷须性状产生的原因，我们针对稀有SNP1开发dcaps标记，在3342份黄瓜资源中进行验证(图5)。
5.1目的片段的获得以及dCAPS分型检测
(1)扩增含SNP位点的核苷酸片段
正向引物F 5’-AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3’和反向引物R 5’-TTGGAAGCTGGAAAATAGAAAATAT-3’，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。
其中，PCR反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。
PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。
(2)对PCR扩增片段进行酶切，进行dCAPS检测
所得PCR产物用内切酶SspI酶切，反应体系以20μl计为：10U/μL SspI内切酶0.5μl，10×NEB缓冲液2μl，10μg/μl 100×BSA 0.2μl，PCR产物10μl，余量为水。反应条件为：37℃温育4小时。然后将得到的酶切产物在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染显色观察。
5.2基因型判定及卷须性状关联分析
检测结果发现，只有无卷须种质仅为一条140bp大小的条带，即在如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处为碱基T；其余3341份有卷须黄瓜资源检测结果只有一条117bp条带，即在如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处为碱基A；无卷须种质的杂合F1代(有卷须性状)同时含有140bp和117bp两条带，即在位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处的碱基为A/T杂合(图5)。
进一步有力证明Csa5G644520基因就是控制黄瓜无卷须性状基因tl，SNP1就是无卷须性状产生的原因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.黄瓜基因Csa5G644520在控制黄瓜无卷须性状中的应用，所述黄瓜基因Csa5G644520编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
2.一种与黄瓜卷须性状相关的SNP标记，其特征在于，其位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520第1012bp处，表现为无卷须性状的黄瓜此处碱基为T，表现为有卷须性状的黄瓜此处碱基为A，所述SNP标记的扩增引物为正向引物F 5’-AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3’和反向引物R 5’-TTGGAAGCTGGAAAATAGAAAATAT-3’。
3.一种鉴定有无卷须性状黄瓜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测黄瓜的基因组DNA；
2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应；其中所述引物对为正向引物F 5’-AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3’和反向引物R 5’-TTGGAAGCTGGAAAATAGAAAATAT-3’；
PCR扩增体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水；
PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；
3)检测PCR扩增产物，具体如下：
采用dCAPS法检测PCR扩增产物：用内切酶SspI对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条140bp大小的条带，则待测黄瓜在位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处的碱基为T，属于无卷须性状的黄瓜品种；检测结果为一条117bp大小的条带，或同时含有140bp和117bp两条带，则待测黄瓜在位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp处的碱基为A或A/T杂合，属于有卷须性状的黄瓜品种。
4.权利要求2所述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。
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