CN101780272A - 一种含有TGF β1自体疫苗制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有TGFβ1自体疫苗制剂的应用。所述的疫苗制剂中添加佐剂，制备成用于治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂。所述的疫苗制剂是由家畜自身TGFβ1的部分、全部、部分或全部的突变体、或全部的类似基因序列与至少一个能够提高免疫原性的辅助T细胞表位或载体蛋白的基因序列重组，构建真核或原核表达质粒，转化宿主菌并表达得到的融合蛋白；或者直接由构建得到的真核表达质粒制成。该疫苗制剂可以直接用于制备治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂；其诱导家畜产生中和自身TGFβ1的抗体，解除在持续性感染过程中TGFβ1水平过高而造成的免疫抑制作用；同时抑制机体持续性感染部位的诱导型调节性T细胞生成，有利于机体打破对体内病原体的免疫耐受状态，促进机体对持续性感染的病原体的清除作用。

Description

一种含有TGF β1自体疫苗制剂的应用

技术领域

本发明属于免疫学和动物疫苗制造技术领域，具体涉及治疗家畜持续性病原体感染的TGFβ1自体疫苗制剂的应用。

背景技术

家畜的持续性病原体感染现象在现代养殖业中非常普遍。受感染家畜虽然往往并不表现出明显的临床症状，但是却具有持续向外界排毒的能力；在母畜还可通过胎儿传递到下一代，这些持续存在的病原体还可能在家畜体内发生变异造成新的流行，成为一种重要的传染源。持续性感染还可能造成免疫耐受或麻痹，严重影响再次接种疫苗时的效果。这对养殖业中的传染性疾病的防控和净化工作带来了极大的困难。

目前在养殖业中，发生持续性感染的疾病主要有圆环病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟、细小病毒、猪肺炎支原体、伪狂犬病毒、牛病毒性腹泻病毒、马传染性贫血、猪副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、结核分支杆菌。同时也还有一些由多种病原体在局部造成的持续性感染如：母畜的慢性子***、***炎等疾病。对于发生持续性病原体感染的家畜来说，其可能的结果有：家畜经过一段较长时间感染过程，但最终机体彻底的清除体内的病原体，机体进入健康状态；第二种情况是机体虽然持续感染病原体，不引起明显病理变化，但是终身处于感染状态；第三种情况是持续性感染的病原体最终突破或摧毁机体的免疫***，使动物最终死于原发或继发感染。发生持续性病原体感染的家畜通常具有传染性，而且这种传染往往不易觉察而具有更大的危害性。

目前虽然人们制备了各种各样的疫苗来防止家畜发生病原体的感染，并取代了极大的成就。但是目前却尚无有效的方法来治疗家畜的持续性感染。大剂量、长时间的药物治疗虽然有助于治疗家畜的持续性病原体感染，但是效果有限，同时带来高昂的费用。当前解决家畜持续性病原体感染的有效措施是采取严格的淘汰制度。这一措施在生产实践中推广起来有一定的难度。首先，处于持续性感染状态的家畜其症状往往并不明显，要确定是否是持续性感染需要采取实验室诊断手段，而这些操作技术要求高，成本高；同时，大规模的淘汰制度造成巨大的经济损失，这使得大多数养殖场无法接受，因此推行起来相当的困难。探索新型的解决家畜机体内持续性病原体感染的问题，对于控制当前疾病泛滥具有重要的意义。

造成病原体持续性感染的机制有多个方面，每种病原体持续感染的机制有所不同，但大体有以下几个方面：1)病原体损害免疫***，以致免疫***正常功能受损；2)病原体侵入免疫特赦部位(如中枢神经***、睾丸、眼结膜内)，造成免疫***不能有效的发挥作用；3)病原体基因变异而导致抗原表位改变以逃避免疫***的监控；4)导致宿主细胞基因表达的变化，特别是主要组织相容性复合物的表达下降，使宿主细胞不能有效提呈胞内病原体的抗原肽；5)宿主因先天性或后天性因素造成整体免疫应答低下或宿主产生对体某些抗原的免疫耐受性。其中宿主对病原体的免疫耐受是造成一些病原体持续感染的主要原因之一。打破机体对病原体的免疫耐受状态，重新激发或加强机体免疫***针对病原体的特异性免疫应答反应，对于机体彻底清除病原体具有重要作用。

近几年来，人们在宿主对病原体的免疫耐受机制的研究中取得了较大的进展。处于持续性病原体感染状态的家畜与病原体通常是机体免疫***与病原体间处于一个暂时的平衡状态。机体的免疫***在展开对病原体攻击的同时也会造成自身组织的损伤。为了防止免疫反应对机体自身产生过大的损害，机体会通过多种方法来调控免疫反应的强度：机体的局部会分泌多种细胞因子如IL-10、TGFβ等来抑制免疫反应；同时机体诱导产生的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞也能够直接或通过分泌细胞因子等来抑制免疫效应细胞对病原体的免疫反应。在这一过程中，TGFβ1发挥了关键性的作用，其本身可以对多种免疫效应细胞具有抑制作用，同时，还可以诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的生成而发挥免疫抑制作用(Song Guo Zheng.Int JClin Exp Med.2008；1(3)：192-202；Chen W.J.Exp.Med.198：1875-1886)。

TGFβ1是由两个结构相同，分子量为12.5KD的亚单位借助分子间的二硫键连接而成的二聚体。TGFβ1在合成初期是一种无活性的大分子复合物(分子量为100-250kD)，称之为潜在性的TGFβ1，经激活后产生分子量为25kD的二聚体，由两条相同的12.5kD亚单位肽链通过二硫键相连结，每条单链含有112个氨基酸。TGFβ1是一类多功能的细胞因子，可由多种细胞合成和分泌。以旁分泌和自分泌的方式发挥作用。其广泛参与动物的各种病理生理过程。主要包括免疫***的调控、细胞的生长分化、细胞外基质的分泌和沉积等多个方面，转化生长因子β通过与I类和II类受体结合发挥作用，信号通路有SMAD蛋白和SMAD非依赖途径。

TGFβ1在免疫***中是一种强烈的免疫抑制因子，能以自分泌或旁分泌方式作用于多种免疫细胞。能够通过调节淋巴细胞的增殖、分化和存活等方面来调节免疫耐受，对淋巴细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞均有重要调节作用，TGFβ1能够直接或通过间接途径来抑制T细胞反应。抑制辅助性T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)的增殖，抑制细胞毒T细胞(CTL)的产生，抑制免疫球蛋白合成，拮抗IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ等免疫调节因子的效应。TGFβ1还能够抑制CD4⁺T的增殖、抑制树突状细胞的成熟，降低树突状细胞表面II类主要组织相容性复合物的表达，从而抑制树突状细胞的抗原提呈功能。(Gorelik L.Nat Rev Immunol.2002，2：46-53)。而且还能抑制巨噬细胞的活化和促炎性细胞因子的释放(Tsunawaki，S.Nature，1988，334(6179)：260-262)。

TGFβ1在病理生理情况下，能够抑制免疫反应过强造成自身组织的损伤(Li MO.Annual Review of Immunology，2006，24：99-146)。并能促进受损的组织修复。TGFβ1的这一机制虽然使机体的免疫损伤有所抑制，但是带来的副作用是使机体对病原体的清除能力下降，为病原体的持续感染创造了条件，由于家畜持续性感染的病原体多是胞内存在，特异性的CD8⁺T不足造成机体无法彻底清除隐藏在自身细胞内的病原体，这是造成持续性感染的主要原因之一。目前发现TGFβ-smad2信号通路造成CD8⁺T细胞凋亡是导致病毒持续性感染的主要原因(Tinoco R.Immunity.2009，31(1)：145-57；Sanjabi S.Immunity.2009，31(1)：131-44)。

疫苗在免疫过程中，可能激发机体产生过高水平的TGF-β1，这些TGF-β1是造成免疫失败的主要原因之一(Sudipta Bhowmick.Infect Immun，2009，77(4)：1514-1523)。目前已经发现TGFβ1可能是造成持续性寄生虫感染的重要原因之一(Charles F.The Journalof Immunology，2008，180，4090-4097)。

近年已经发现TGFβ1诱导产生的诱导型CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在免疫耐受和控制免疫反应强度等方面发挥关键性作用。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞是近年来新发现的一类具有特异性免疫抑制作用的细胞，通过多条途径来发挥免疫抑制作用，其可以通过细胞细胞接触的方式特异性抑制免疫效应细胞的功能。在慢性FV病毒感染小鼠体内分离出的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可以通过细胞接触的方式抑制CD8⁺T细胞的细胞毒性作用，在小鼠的其它一些病毒如HSV、SV40等以及人的病毒性持续感染如HCV、HIV、HBV、HTLV、EBV持续性感染的过程中同样发现类似现象。利用抗CD25单克隆抗体清除CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可显著增强抗原特异性CD8+T细胞抗病毒免疫反应强度(Furuichi Y.World J Gastroenterol，2005，11(24)：3772-3777)。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞除抑制CD8⁺T细胞外，还可以抑制B淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞、树突状细胞等免疫细胞的功能；阻碍效应性T细胞向病毒高滴度组织迁移，还可以抑制细胞分泌IFN-γ、TNF等细胞因子来发挥免疫抑制功能。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞还可以通过膜结合型TGFβ1来发挥免疫抑制作用(Kazuhiko Nakamuraa.The Journal ofExperimental Medicine.2001.194(5)：629-644)。在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染过程中，诱导性调节性T细胞的产生可能是造成免疫反应低下的原因之一，并且这种诱导性调节性T细胞的产生依赖TGFβ1的作用(Silva-Campa E.Virology.2009，387(2)：373-379)。

利用抑制TGFβ1来提高机体的免疫反应水平是一条可行的途径，目前已有研究利用TGF-β1拮抗剂来打破肿瘤免疫耐受，提高肿瘤存活期的研究报道。Lucía Gil-Guerrero等发现能够抑制转化生长因子的肽段P₁₇(KRIWFIPRSSWYERA)在体内和体外能够下调CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的活性，有利于增强疫苗的免疫效果，并且有利于机体打破对于病毒和肿瘤的免疫耐受状态。(Gil-Guerrero L.J Immunol.2008，181(1)：126-135)。

抑制TGFβ1的功能可以有多条途径，主要有单克隆抗体、抑制性多肽及可溶性TGF-β1受体、人工合成的化合物等。也有报道利用TGF-β1来构建自体疫苗，但其目的是用来打破机体对肿瘤的免疫耐受，促进机体对肿瘤的免疫反应。但目前尚没有利用TGF-β1自体疫苗制剂来进行家畜持续性病原体感染的治疗方面的报道。

目前的证据表明虽然一定水平的TGFβ1水平是保证机体免疫反应平衡的重要因素，但是适当的降低TGFβ1水平并不会对机体造成明显的伤害。有实验表明对于TGFβ1基因敲除的小鼠往往表现出致命的自身免疫性疾病(Kallapur S.Humana Press：Totowa，NJ，1998：335-368)。但是在利用TGFβ1抑制剂来处理小鼠时，发现TGFβ1抑制剂并不会造成明显的自身免疫性疾病。这些使用的TGFβ1抑制剂包括：中和抗体、可溶性TGFβ1受体、受体激酶拮抗药物、反义制剂。其可能的原因是这些抑制剂对TGF的信号通路抑制作用是不完全的。

利用TGF-β1自体疫苗制剂来抑制机体内的TGF-β1功能具有成本低，使用方便，效果持久等优点。目前的研究已经表明通过一定的方法是可以在动物体内诱导自身抗体的产生，其处理的方法一般是利用自身蛋白再连接一段能激发机体免疫反应的载体蛋白或多肽来实现的。本发明中，利用TGFβ1自身的B细胞表位，添加外源辅助T细胞表位，制备TGFβ1自体疫苗制剂，并制备出药物制剂，其能够有效的刺激机体产生抗自身TGFβ1的抗体。产生的抗体可以中和TGFβ1，从而部分抑制了TGFβ1的功能，能够有效激发机体的免疫反应水平。同时，通过该制剂还可以抑制CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的功能，打破机体对病原体的免疫耐受，从而重新激发机体对病原体的免疫反应，加速机体清除病原体。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有TGFβ1自体疫苗制剂的应用，其用于制备治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂。

家畜持续性病原体感染伴随着局部或血液中TGFβ1水平的上升，同时诱导型CD4⁺CD25⁺调节性T细胞数量和功能增强，这二个因素能发挥免疫抑制和免疫耐受的作用，从而抑制了机体对持续性感染病原体的清除效果。应用该制剂制备的治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂后，能够诱导家畜产生抗自身TGFβ1的抗体，这些产生的抗体能够中和自身的TGFβ1，并能在局部抑制CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的产生和功能，从而能够促使机体打破对持续性病原体的免疫耐受，加速机体清除持续性感染的病原体。这为解决家畜持续性病原体感染问题提供了一种新型的方法和途径。

本发明的一种含有TGFβ1自体疫苗制剂的应用在于，所述的疫苗制剂用于制备治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂。在所述的疫苗制剂中添加佐剂，即制备成上述药物制剂。

所述的家畜持续性病原体的感染包括慢性感染、隐性感染、反复感染及健康带毒。具体包括：圆环病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟、细小病毒、猪肺炎支原体、伪狂犬病毒、牛病毒性腹泻病毒、马传染性贫血、猪副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、结核分支杆菌引起的感染，以及多种病原体引起的母畜慢性子***、***炎。

所述的疫苗制剂是由家畜自身TGFβ1的部分、全部、部分或全部的突变体、或全部的类似基因序列与至少一个能够提高免疫原性的辅助T细胞表位或载体蛋白的基因序列重组，构建真核或原核表达质粒，转化宿主菌并表达得到的融合蛋白；或者直接由构建得到的真核表达质粒制成。

所述的辅助T细胞表位包括载体蛋白、通用辅助T细胞表位PADRE、破伤风类毒素氨基酸片段TTE、家畜感染病原体来源的辅助T细胞表位或根据动物主要组织相容性复合物II类结合基因序列人工设计的T细胞表位。

所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、乙肝表面抗原，乙肝核心抗原、大肠杆菌不耐热肠毒素B、卵白蛋白、热休克蛋白或者是直接来源于表达载体上的标签蛋白融合蛋白。

所述的辅助T细胞表位还包括多种辅助T细胞表位混杂而成，或者是单个外源辅助T细胞表位重复串联而成的形式。

本发明的机理如下：

成熟TGFβ1蛋白是由二个单体蛋白通过二硫键形成的二聚体结构，从蛋白质数据库(美国RCSB Protein Data Bank，PDB ID：1KLA)能够方便的获取成熟TGFβ1的氨基酸序列(见氨基酸序列表1)、PDB文件和已经解析好的TGF-β1蛋白的晶体三维结构。可以用文字编辑软件来查看蛋白结构，同时也可采用三维结构观察软件来直观的观察TGF-β1的三维结构，这些结构包括蛋白质的二级结构、三级结构、四级结构，同时还可以观察整个二聚体的表面氨基酸分布、二硫键的位置，这为推测TGF-β1的B细胞表位提供了极大的方便。该单体蛋白共112个氨基酸残基，其中57-68氨基酸形成α螺旋，16-18、43-45、90-92、95-97、77-82、108-112共形成6个β折叠，69-72、92-95共形成二个转角。B细胞表位的选择可以是TGF-β1的全部、部分、或突变体。同时，也可以根据TGF-β1的三维结构，结合B细胞表位预测的软件，优选出B细胞表位。优选的B细胞表位包括但不限于1-15、1-30、19-42、46-56、69-75、79-108、83-107氨基酸序列。

将这些优选的序列通过氨基酸序列比对，查找与其相似的TGFβ1家属的同源序列，如果可能，尽量避免与其它细胞因子部分序列存在过高的同源氨基酸序列，防止在免疫过程中产生过广泛的交叉免疫反应。

由于TGFβ1是真核生物所表达，如果在原核生物中进行表达效果，有必要对该基因序列进行必要的优化，使其氨基酸的密码子为宿主菌使用频率高的密码子。该领域的技术人员可以方便的查找到各种生物的密码子使用频率表并进行相应的优化。

如何诱导机体产生抗自身TGFβ1的抗体是本发明着重需要解决的问题。TGFβ1对于免疫的动物来说是一种自体蛋白质，由于机体的自身抗原耐受机制作用，直接用TGFβ1来进行免疫时，其肽段不能有效的被抗原提呈细胞提呈激活辅助性T细胞，从而不足以诱导有效的抗体生成。为了增强自体TGFβ1的免疫原性，有必要对TGFβ1进行必要的修饰，这些修饰包括增加至少一个T细胞表位。

解决这一问题的方法是在自身抗原中引入外源辅助T细胞表位，这些外源辅助T细胞表位根据被免疫动物的主要组织相容性复合物的遗传背景不同而有所区别，提供这种外源的外源辅助T细胞表位可以是载体蛋白或已知的辅助T细胞表位。同时还包括为了增强免疫原性而增加的氨基酸序列，其氨基酸序列可以是目前已知的辅助T细胞表位或载体蛋白氨基酸序列，提高免疫原性的辅助T细胞表位包括但不局限于通用辅助T细胞表位(PADRE)、破伤风类毒素氨基酸片段(TTE)，也可以来源于家畜感染的病原体的辅助T细胞表位，还可以是根据动物主要组织相容性复合物II类结合基序人工设计的T细胞表位。同时，T细胞表位可以是多个T细胞表位混杂而成，也可以是单个串联而成。载体蛋白其主要的目的是提供有效的辅助T细胞表位，包括但不限于牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、乙肝表面抗原，乙肝核心抗原、大肠杆菌不耐热肠毒素B、卵白蛋白、热休克蛋白。也可以是直接来源于表达载体上的标签蛋白融合蛋白。

辅助T细胞表位的选择可参照已知的病原体的辅助T细胞表位。由于家畜不同品种的遗传背景差异，主要组织相容性复合物存在差异，有必要增加多个不同的辅助T细胞表位来适用不同遗传背景的需要。为了增强辅助T细胞表位的效果，可以采用多个T细胞表位或重复T细胞表位，T细胞表位之间可以采用合适的氨基酸序列连接。本领域的技术人员能通过现有技术方便的用不同的辅助T细胞表位取代本发明所提到辅助T细胞表位。需说明的是这里所述的T细胞表位目仅用于举例。但选择的外源T细胞表位需注意的有效的T细胞表位处决于所要免疫的动物的主要组织相容性复合物种类，必要条件是其能被主要组织相容性复合物有效提呈至细胞表面。

同时，T细胞表位的选择还可以优化为利用持续性感染病原体的辅助T细胞表位。以猪为例，可以选择通用型T细胞表位，同时还可以选择常见的猪持续性感染病原体的已知T细胞表位，包括但不局限于猪瘟病毒NS2-3相应的1446～1460氨基酸残基的E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)、圆环病毒ORF1的81～100位等多肽(Stevenson LS.Viral Immunol.2007，20(3)：389-98)；繁殖与呼吸综合征病毒GP5 117～131位等多肽(Vashisht K.Vaccine.2008，26(36)：4747-4753)；***病毒VP1基因的20～40位等多肽(Collen T.JImmunol.1991，146(2)：749-755)等。作为本领域的技术人员，能较方便的通过相关文献或免疫技术来确定持续性病原体感染的抗原表位。同时，这些持续性感染病原体特异性的疫苗包括减毒活疫苗、灭活苗、亚单位重组苗、DNA疫苗及特殊载体的基因疫苗等。可以与本发明的TGFβ1自体疫苗制剂配合使用，以达到更好的效果。

在疫苗制剂的设计时，可以将TGFβ1和载体蛋白或辅助T细胞表位重组构建表达质粒，表达质粒可以是原核表达质粒，也可以是真核表达质粒。利用这些构建好的表达质粒转化宿主细胞，可以在体外得到融合蛋白。添加合适的佐剂即成为本发明的药物制剂。同时，也可以通过真核表达质粒直接作为DNA制剂来使用。

除非特别说明，本发明所采用的常规分子操作技术均可参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂译)。

同时为了增强TGFβ1自体疫苗制剂的效果，该制剂还可以添加一种或多种佐剂，制备成治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂，这些佐剂包括但不局限与氢氧化铝、白油、油脂、完全或不完全弗氏佐剂、细胞因子来源佐剂、也可以是商业化的佐剂如MF59、ISA15AVG、ISA206等。

通过本发明优选的TGF-β1自体疫苗制备的药物制剂所激发的抗体效价是不持久的，但这样带来的一个好处是防止机体持久的产生TGF-β1特异性抗体，从而长时间抑制TGF-β1的正常生理功能而导致严重的副作用。因为当机体内持续性病原体感染被清除后，机体无必要继续产生TGF-β1特异性抗体。当然在特定情况下如果有必要维持合适的抗TGF-β1特异性抗体浓度，可定期采用本发明的制剂来激发机体的免疫***。

以往在家畜持续性病原体感染上采取预防措施、感染后药物治疗，淘汰法等等，这些措施不仅成本花费大，而且效果差。本发明是首次将TGFβ1自体疫苗制剂应用于制备治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂中，使用成本低，治疗效果好。目前还没有相关的研究报道，这在技术上是一个重大突破。

具体实施方式

本发明将通过以下的实施例来进行更详细的解释，但是不应局限于此。

实施例1：TGF-β1全氨基酸序列与LTB载体蛋白融合表达的自体疫苗制剂制备，包括如下步骤：

1.1重组质粒pET-TGF-LTB质粒的构建

1.1.1从genebank网站分别下载TGFβ1和LTB的氨基酸序列，TGFβ1的氨基酸序列见SEQID NO：1，LTB的氨基酸序列见SEQ ID NO：2，为了使TGFβ1的B细胞表位不受LTB的影响，在LTB和TGFβ1二核苷酸序列间加上柔性接头序列(GGGGSGGGGSGGGGS)，序列见SEQ ID NO：3。其中LTB位于柔性接头序列的5’端，TGFβ1位于柔性接头序列的3’端。序列为LTB-GGGGSGGGGSGGGGS-TGFβ1。根据大肠杆菌优选的密码子转换成核苷酸序列，核苷酸序列见SEQ ID NO：4。

1.1.2将核苷酸序列交生物公司进行全基因合成，并在5’端和3’端分别增加EcoR I和HindIII限制线酶切位点。

1.1.3用EcoR I和HindIII双酶切表达合成的基因序列和原核表达质粒pET28a(+)(Novagen公司商业产品)。并利用凝胶电泳纯化出目的片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α细菌，培养后提取质粒送生物公司进行测序鉴定。挑取核苷酸序列和读码框均无误的质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen公司商业产品)。挑取单菌落进行培养或冷冻保存备用。

1.2重组质粒的诱导表达

诱导过程参照载体说明书Novagen公司的pET***操作手册进行。将重组菌划线培养，挑取典型新鲜的单菌落，在新鲜LB培养基中振荡培养过夜，次日按1％体积比转接新鲜LB培养液，37℃振荡培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为1mmol/ml。继续振荡培养4h。离心收集菌体，PBS洗涤，按1/20体积比浓缩。超声波破碎，高速离心后，将上清转移至另一离心管中。所得沉淀用TE缓冲液恢复至原体积。沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色。同时设立含pET28a(+)空载体的受体菌和不加IPTG诱导的E.coliBL21(DE3)/pETLTB-TGF作为对照。结果显示融合蛋白得到了较好的表达，表达产物大部分位于包涵体中。

1.3重组蛋白的western-blot分析

先将重组蛋白作SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜。具体转印显色等操作均按《分子克隆实验指南》来进行。然后用含5％BSA的TBST封闭过夜，以兔抗TGF-β1多克隆抗血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，DBA显色试剂盒显色。结果显示所表达的融合蛋白能与抗血清良好的结合，表明所表达的蛋白保留了TGF-β1的抗体结合特性。

1.4重组蛋白的纯化

培养阳性克隆菌，加入IPTG诱导融合蛋白表达，经超声破碎，提取包涵体蛋白，利用His-Tag特性经镍柱亲和纯化。

1.5重组LTB-TGF蛋白药物制剂制备

取纯化好的LTB-TGF融合蛋白，调整其蛋白浓度为1mg/ml。分别与等体积佐剂混合，经充分乳化，即形成用于治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂。具体操作步骤可参照佐剂说明书进行。

实施例2：通用辅助T细胞表位(PADRE)、破伤风毒素T细胞表位肽与TGF-β1全蛋白序列融合表达的自体疫苗制剂制备：

通用辅助T细胞表位(PADRE)的氨基酸序列见SEQ ID NO：5，破伤风毒素T细胞表位肽(TTE)的氨基酸序列见SEQ ID NO：6，构建的融合蛋白氨基酸序列为：PADRE-TTE-GGGGSGGGGSGGGGS-TGFβ1，将氨基酸序列按大肠杆菌密码子优化并采用全基因合成的方法得到该融合蛋白的核苷酸序列，并克隆入表达载体，转化表达菌株得到融合蛋白。其具体制备方案参照实施例一及《分子克隆实验指南》进行。

实施例3：TGFβ1自体疫苗制剂对小鼠CD4+CD25+调节性T细胞数量的影响。

利用制备的LTB-TGF或PARDE-TGF融合蛋白二次免疫小鼠，其中第一次为融合蛋白与完全弗氏佐剂混合免疫，第二次采用融合蛋白与不完全弗氏佐剂混合免疫小鼠。二次免疫时间间隔15天，第二次免疫后15天测定CD4⁺CD25⁺调节性T细胞数量及分布。所采用的试剂为美国eBioscience公司的FITC大鼠抗小鼠CD4单抗及PE大鼠抗小鼠CD25单抗，利用BD FACSCaliburTM型流式细胞仪测定CD4⁺CD25⁺调节性T细胞数量及分布。结果表明自体疫苗制剂能够显著降低调节性T细胞的数量。

实施例4：TGFβ1自体疫苗制剂对圆环病毒隐性感染猪的治疗效果。

2.1选取体重30公斤左右，健康无病、检测猪细小病毒、圆环病毒、蓝耳病、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒均呈阴性的小猪20头。圆环病毒持续性感染猪的判定标准：外观及行为无明显致病症状，体温正常、圆环病毒抗体阳性、套式PCR检测病原体呈阳性。将判定为持续性感染的猪随机分为二组。

2.1.1圆环病毒抗体检测方法：采用间接ELISA方法来进行，试剂盒为武汉科前动物生物制品有限责任公司产品，操作方法参照试剂盒说明书进行。样品OD₆₃₀值大于0.42，判为阳性；样品OD₆₃₀值在0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD₆₃₀值小于0.38，判为阴性。

2.1.2 PCR的检测方法：采用套式PCR的方法检测圆环病毒DNA。外部引物为P1(5’-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAG-3’)和P2(5’-AGGAGGCGTTACCGCAGAAG-3’)；内部引物为P3(5’-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3’)和P4(5’-CCGCACCTTCGGATATACTG-3’)。引物由生物公司合成。二次PCR反应条件均按94℃1min，65℃1min，72℃1min共30个循环，最后72℃延伸5min。取PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

2.2实验分组及处理：20头判定为持续性感染的猪随机分为二组，一组为对照组，不作任何处理。另一组为实验组，采用本发明实施例1的TGF-β1疫苗制剂制成的药物制剂治疗。

2.3结果观察：结果显示，实验组的抗圆环病毒抗体水平明显高于对照组，二组差异显著(P＜0.05)。提高的抗体水平有助于机体清除隐性感染的猪圆环病毒。PCR结果显示实验组10头猪中，有8头显示为圆环病毒DNA阴性，而对照组中10头猪只有1头呈阴性。结果表明TGF-β1自体疫苗制剂制备的药物制剂能有效促进机体对圆环病毒的清除速度。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>一种含有TGFβ1体疫苗制剂的应用

<130>genebank

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>112

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>1

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys

1               5                   10                  15

Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

            20                  25                  30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys

        35                  40                  45

Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu

    50                  55                  60

Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro

65                  70                  75                  80

Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro

                85                  90                  95

Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser

            100                 105                 110

<210>2

<211>103

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>2

Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln

1               5                   10                  15

Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala

            20                  25                  30

Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe

        35                  40                  45

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala

    50                  55                  60

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr

65                  70                  75                  80

Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Tyr Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn

            100

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>柔性接头序列

<400>3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

<210>4

<211>693

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>4

atggctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg    60

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc    120

attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac    180

tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag    240

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc    300

agtatgaaaa acggtggtgg tggtagcggt ggtggtggta gtggcggtgg cggtagcgcc    360

ctggatacca actattgctt tagctctacg gagaaaaact gctgtgttcg tcagctgtac    420

attgatttcc gcaaagatct gggctggaaa tggatccatg aaccgaaagg ctatcacgca    480

aacttctgcc tgggtccgtg tccgtacatt tggtctctgg atacgcagta tagtaaagtg    540

ctggccctgt acaaccagca taatccgggt gcaagcgcag caccgtgctg tgttccgcag    600

gcgctggaac cgctgccgat tgtgtattac gttggtcgta aaccgaaagt ggaacagctg    660

tctaatatga tcgttcgcag ttgcaaatgt agc                                 693

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>人工氨基酸序列

<400>5

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

1               5                   10

<210>6

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>人工氨基酸序列

<400>6

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu

1               5                   10

Claims (8)

1.一种含有TGFβ1自体疫苗制剂的应用，其特征在于，所述的疫苗制剂用于制备治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂。

2.根据权利要求1所述的疫苗制剂的应用，其特征在于，所述的疫苗制剂中添加佐剂，制备成用于治疗家畜持续性病原体感染的药物制剂。

3.根据权利要求1所述的家畜持续性病原体的感染，其特征在于：所述的家畜持续性病原体的感染包括慢性感染、隐性感染、反复感染及健康带毒。

4.根据权利要求1或2或3所述的疫苗制剂的应用，其特征在于，所述的家畜持续性病原体感染包括：圆环病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟、细小病毒、猪肺炎支原体、伪狂犬病毒、牛病毒性腹泻病毒、马传染性贫血、猪副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、结核分支杆菌引起的感染，以及多种病原体引起的母畜慢性子***、***炎。

5.根据权利要求1或2所述的疫苗制剂的应用，其特征在于，所述的疫苗制剂是由家畜自身TGFβ1的部分、全部、部分或全部的突变体、或全部的类似基因序列与至少一个能够提高免疫原性的辅助T细胞表位或载体蛋白的基因序列重组，构建真核或原核表达质粒，转化宿主菌并表达得到的融合蛋白；或者直接由构建得到的真核表达质粒制成。

6.根据权利要求5所述的疫苗制剂的应用，其特征在于：所述的辅助T细胞表位包括载体蛋白、通用辅助T细胞表位PADRE、破伤风类毒素氨基酸片段TTE、家畜感染病原体来源的辅助T细胞表位或根据动物主要组织相容性复合物II类结合基因序列人工设计的T细胞表位。

7.根据权利要求5所述的疫苗制剂的应用，其特征在于：所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、乙肝表面抗原，乙肝核心抗原、大肠杆菌不耐热肠毒素B、卵白蛋白、热休克蛋白或者是直接来源于表达载体上的标签蛋白融合蛋白。

8.根据权利要求5或6所述的疫苗制剂的应用，其特征在于：所述的辅助T细胞表位还包括多种辅助T细胞表位混杂而成，或者是单个外源辅助T细胞表位重复串联而成的形式。