CN102449154A - 植物中用于胁迫耐性的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

我们表征了植物转录因子并且公开了它在修饰植物对胁迫条件的响应中的用途，所述胁迫条件包括冷冻、干旱、盐度和病原体侵入。进行微阵列分析，其表明这种耐受通过增加定位在细胞质外体中抑制大的胞外冰晶生长的防冻蛋白质而发生。我们还公开了这种蛋白质的用途。

Description

植物中用于胁迫耐性的方法和组合物

发明领域

本发明涉及对生物和非生物胁迫具有增强的耐受性的转基因植物以及用于获得这些植物的方法。分离的核酸和肽序列也在本发明的范围内。

发明背景

有害的气候条件和人类活动以及生物制剂是植物的胁迫效应物并且严重地影响它们的生产率和生存。归因于这种胁迫的生产率的损失有时候达到50％以上。植物培育者已经开发了并且致力于开发对策从而避免或减少这些情况的负面影响。

在非生物性导致胁迫的因素中，干旱、土壤的盐度以及极端温度是最有害的一些。关于极端温度，将胁迫分为三类：冷冻(freezing)胁迫(由0℃以下的温度引起)，寒冷(chilling)胁迫(由0℃以上的低温引起)以及热(heat)胁迫(由高温引起)。寒冷温度(chilling temperature)引起对光合组织的损害，抑制整个光合过程和碳水化合物转运以及蛋白质的生物合成和呼吸率。同时，加速蛋白质降解。所有这些作用发生的相当慢并且涉及部分或全部的膜功能丧失。相反，冷冻温度(freezing temperature)导致迅速的损害，其杀死植物。然而已经观察到：相比最初不遭受寒冷周期而直接经受冷冻的植物，在若干天内经受寒冷的植物更好的耐受冷冻温度；此过程被称为“驯化”。

物种诸如冬谷类作物适应于冷或中度冷的天气并且如果事先已经适应了降低的温度可以相当好的耐受0℃～15℃的温度以及冷冻温度(Levitt，1980，Thomashow，1999)。相反，热带和亚热带物种对低温敏感并且显得缺乏有效的驯化机制，所述热带和亚热带物种包括重要的农作物诸如玉米、稻或番茄。

耐寒性和耐冻性经由不同的机制发生。对寒冷的响应包括不饱和酶(unsaturase)的激活，所述不饱和酶的激活能够改变膜的脂质组成，在低温下产生增加的膜流动性。另一方面，耐冻性需要事先的驯化周期。在此驯化周期期间，合成并积累某些特殊蛋白质。

“防冻”蛋白质在许多越冬植物中被发现；在冷冻温度下它们抑制在细胞间隙内产生的冰的生长和再结晶。这些蛋白质展示出与病程相关(pathogenesis-related)蛋白质(PR)的高水平的同源性，并且在一些情况中也抵抗嗜冷病原体(Griffith和Yaish，2004；Chinnusamy等人，2007)。其他物种通过增加蔗糖(Guy，1992)或游离脯氨酸浓度(Nanjo等人，1999)的机制来呈现耐冻性。

一种减少植物生产率损失的对策是通过加强内生***(endogenoussystem)来增加固有胁迫耐性。转录因子(TF)在植物对环境因素的响应中以及在形态发生程序中发挥关键作用。它们是这样的蛋白：反式作用、能够识别并结合定位在它们的靶基因的调控区的特异DNA序列(顺式作用元件)。当这些蛋白质与它们的靶点结合时，它们激活或抑制整个转导信号通路。

使用生物信息学已经在植物中鉴定出大约1500个TF，并且TF包括众多的基因家族。然而，虽然它们可能涉及所述响应，但是它们可能不一定给予耐受性。例如，这通过拟南芥(Arabidopsis)的TF ATHB7和ATHB12(Lee和Chun，1998)举例说明。这些展示出与向日葵HAHB4的高的同源性，尤其是在HD-Zip结构域。两种基因由干旱和ABA上调。然而，也已经表明相比野生型(WT)，转基因植物过表达这些基因并不更加耐受干旱胁迫。在WO 2004/099365中描述了HAHB4。另一个实例是DREB2基因，DREB2基因由低的温度诱导，但是在其野生型形式中不能给予低温耐受性。因此，依旧需要的是进行系列功能基因组学实验从而测试并证明TF对胁迫耐性的作用，因为这样的作用是不可预知的(Arce等人，2008)。

以与亮氨酸拉链有关的同源异型结构域的存在为特征的HD-Zip蛋白质构成植物转录因子的一个家族。DNA结合结构域(HD)与邻近的二聚化基序(缩写为ZipLZ或LZ的亮氨酸拉链)的联合是只发现于植物界的组合，尽管发现在很多真核转录因子中所述结构域是彼此独立的(Schena和Davis，1992)。根据在所述保守结构域内和所述保守结构域外的序列相似性以及通过相应基因的内含子/外显子模式，植物TF的这个大家族已经被划分为四个亚家族(I至IV)(Schena和Davis，1994，Sessa等人，1994，Chan等人，1998；Ariel等人，2007)。亚家族I的成员与假回文(pseudopalindromic)序列CAAT(A/T)ATTG相互作用；亚家族II蛋白质识别基序CAAT(C/G)ATTG(Sessa等人，1993；Palena等人，1999)。在所有情况中，蛋白质同源或异源二聚体的形成是DNA结合的前提(Sessa等人，1993；Gonzalez等人，1997)。

据几位作者报导，转录因子HD-Zip家族成员的表达受多种外部因素的调节，所述外部因素诸如光照、ABA、盐或水胁迫(Schena和Davis，1992；Carabelli等人，1993；Schena等人，1993；

等人，1994；

等人，1996，Chan等人，1998；Lee和Chun，1998；

等人，1999a和1999b；Gago等人，2002；Henriksson等人，2005)。在转基因植物中过表达HD-Zip I和II基因的研究进一步支持所提议的此蛋白质家族作为响应环境条件的发育调节物的作用(Schena等人，1993；Manavella等人，2006；Manavella等人，2008；Ariel等人，2007；Cabello等人，2007，Dezar等人，2005a)。仍有需要鉴定和表征这种蛋白质以使利用此类分子的具体成员可以将有益特征给予植物。

在1992年从向日葵茎cDNA文库中分离出了HAHB1的cDNA而它的序列存放在Genebank中(登录号L22847，见SEQ.ID.NO：2：本文中所述核酸序列以及SEQ ID.NO：5：本文中是经翻译的蛋白质序列)并且描述了所述cDNA的克隆(Chan RL、Gonzalez DH，1994)。在所述文库中，由此基因编码的蛋白质已经作为与来自其他物种的HD-Zip蛋白质同源的基因被参比，但是此结论只是基于对在***发生树中的序列的比较(Gonzalez等人1997，Chan等人，1998以及Ariel等人，2007)。

本发明惊人地示范了HAHB1(向日葵(Helianthus Annuus)同源异型框1)在产生对胁迫条件具有增强的耐受性的转基因植物中的效用。

发明概述

在本专利公开中，我们描述了转录因子HAHB1和其变体诸如ATHB13用于修饰植物对胁迫条件的响应的用途，转录因子HAHB1是HD-Zip蛋白质向日葵亚家族I的成员，所述胁迫条件包括冷冻、干旱、盐度和生物性胁迫。因此，本发明的多种方面都涉及给予或增加这种胁迫耐性的植物和方法。从基因组文库分离基因并表征其表达模式。我们证明通过产生携带有受组成型35S启动子或固有的HAHB1启动子控制的向日葵HAHB1cDNA的转基因植物，在营养阶段和生殖阶段展示出明显增加的对低温条件的耐受的转基因植物被产生。此外，相比未改造的植物，所述转基因植物在对干旱或盐度条件的响应中展示出更好的耐受性。当使用HAHB1的同源物ATHB13时观察到类似的效果。进行微阵列分析以评估转基因拟南芥植物中的表达模式。所述数据表明观察到的耐受性通过增加定位在细胞质外体中的防冻蛋白而发生，所述防冻蛋白抑制大的胞外冰晶的生长。此外，发明人也表明所述HAHB1基因在向日葵中瞬时的过表达诱导多种胁迫耐性相关基因的表达。

HAHB1是HD-Zip亚家族I(HD-Zip I)的成员。HD-Zip I家族的所有成员在N端的同源异型结构域(HD)和亮氨酸拉链结构域(LZ)中显示高的序列相似性，但是在C端区域具有显著的多的多样性。例如，HAHB1和HAHB4两者都是HD-Zip I的成员，但是它们在它们的C端区域几乎不具有序列相似性。尽管将HD-Zip I划为单一的家族，但是不同的HD-Zip I家族成员展示差异性的表达模式并且涉及不同的发育和生理过程如在下问详述的。本发明人已经表征了HAHB1并且将其结构与同原序列进行了比较。本发明人使用嵌合构建体(chimeric construct)还发现在给予HAHB1功能方面重要的是所述HAHB1蛋白质的C端。据预测，不仅在HD和LZ结构域还在C端结构域显示高的同源性的HAHB1同源基因当在转基因植物中表达时具有如HAHB1的相似效果，如本文中ATHB13所示。

从本文提供的信息，本领域技术人员将理解：如果被表达，HAHB1、它的部分或它的同系物，在它自己的启动子的控制下或在组成型启动子诸如CaMV 35S启动子的控制下，或在另一种的类型的启动子诸如例如低温诱导型启动子或非生物性胁迫诱导型启动子的控制下，给予转基因植物增强的耐受性例如耐冻性。

此耐冻性随着对干旱和高盐条件的的耐受性而增强。我们也表明不仅HAHB1能在HAHB1启动子的控制下表达以达到胁迫响应表达，而且任何基因序列可以有效的联合所述HAHB1启动子从而达到在低温或冷冻条件、高盐或低水或病原体入侵下的表达。

如上所述，不希望受限于任何具体的理论，由HAHB1的表达给予的对冷冻条件的耐受显然是由于在细胞质外体内的防冻蛋白质的合成和作用，所述防冻蛋白质通过其随后的脱水作用抑制冰晶形成。还有可能在质外体外(在细胞内)的其他蛋白质也被增量翻译(up translated)。

根据本文提供的总体信息，本领域技术人员将理解本发明描述并允许本领域技术人员从向日葵获得并分离基因序列，所述基因序列可以用于给予增强的对胁迫条件的耐受性，所述增强的对胁迫条件的耐受性包括增强的耐寒性和耐冻性、增强的对干旱的耐受性、增强的对高盐和/或生物性胁迫条件的耐受性。此外，使用本领域已知方法，本文所公开的从向日葵分离的基因序列或它的部分可以用于从其他植物分离相关序列，所述相关序列可以用于给予增强的对非生物性和生物性胁迫条件的耐受性如本文所述。

因此，本发明的目的是提供来自向日葵的分离的蛋白质或基因序列HAHB1、它的部分或它的变体，所述HAHB1、它的部分或它的变体甚至在除向日葵外的其他植物物种中可以用于给予增强的对非生物性和生物性胁迫条件的耐受性如本文所述。

本发明的进一步目的是提供来自向日葵的分离的基因序列HAHB1、它的部分或它的变体，所述HAHB1、它的部分或它的变体可以用于从其他植物中分离相关序列，所述植物包括与向日葵不相关的植物物种，所述序列可以用于提供对如本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的增强的耐受性。

本发明的进一步目的是提供分离的启动子基因序列，所述分离的启动子基因序列可以用于调节与所述启动子序列有效相关的序列的表达从而将响应如本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的表达性质给予因此相关的序列。

本发明的进一步目的是提供包含本文所述核酸序列的表达构建体或载体，所述核酸序列将对本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的增强的耐受性给予引入这样的表达构建体或载体的植物。

本发明的进一步目的是提供转基因植物，所述转基因植物具有对本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的增强的或增加的耐受性。

本发明的进一步目的是提供组合物和方法，所述组合物和方法用于在植物中诱导防冻蛋白质(AFP)的生产从而避免或最小化暴露于低温条件的植物否则由于冰晶形成而造成的损伤。

本发明的进一步目的是提供新的方法，所述新的方法用于鉴定和使用本文公开的新的组合物从而给予对本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的增强的耐受性。

因此，基于本文所提供的信息，本领域技术人员将能够制备包含核酸序列的表达构建体或载体，所述核酸序列将对本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的增强的耐受性给予引入这样的表达构建体或载体的植物。这将使本领域技术人员能够产生具有对本文所述的非生物性和生物性胁迫条件的增强的耐受性的植物。

无意被理论限制，本领域技术人员将理解本文提供的所述组合物和方法将允许在植物中诱导防冻蛋白质(AFP)的生产从而避免或最小化暴露于低温条件的植物否则由于冰晶形成而造成的损伤。

从对本文所提供的完全的公开和所附权利要求的审阅，对于本领域技术人员，本发明的其他目的、优势和益处将是明显的。

附图简述

图1.HAHB1在幼苗和成熟植物中的表达模式

a：在7日龄的向日葵幼苗的不同组织和器官中的HAHB1的转录物水平(从左至右：根、下胚轴、子叶(cotelydon)、顶端分生组织)；b：在21日龄向日葵植株的不同组织和器官中定量的HAHB1的转录物水平(从左至右：根、下胚轴、子叶、茎、叶片、叶柄)；转录物水平通过定量RT-PCR和计算自其中使用肌动蛋白转录物(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照的三个独立样本的标准差来确定；关于在根部测得的值标准化所有值，所述在根部测得的值被任意地赋值为一。y轴表示所观察到的变化(x倍)。

图2.向日葵HAHB1在幼苗中由细胞因子上调(up-regulated)而在成熟植物中由ABA上调

a：用不同激素处理两小时后在7日龄幼苗中HAHB1的转录物水平(从左至右：对照、ABA、BAP、GA、IAA、JA、SA)；b：用不同激素处理两小时后在21日龄叶盘中HAHB1的转录物水平(从左至右：对照、IAA、ACC、SA、JA、ABA、GA、BAP)；转录物水平通过定量RT-PCR和计算自其中使用肌动蛋白转录物(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照的三个独立样本的标准差来确定；关于在根部测得的值标准化所有值，所述在根部测得的值被任意地赋值为一。y轴表示所观察到的变化(x倍)。

图3.向日葵HAHB1由非生物性胁迫因子上调

a：如在附图和详细实验程序部分中所述用非生物性胁迫因子处理两小时后在7日龄幼苗中HAHB1的转录物水平(从左至右：对照、干旱、NaCl、暗、蔗糖、H₂O₂)b：在放置在4℃的7日龄幼苗中HAHB1的诱发动力学(从左至右：对照、3、4、5、6、7、8hs)；c：如在附图中所述用非生物性胁迫因子处理两小时后在21日龄叶盘中HAHB1的转录物水平(从左至右：对照、4℃、UV-B、NaCl、暗、干旱)；转录物水平通过定量RT-PCR和计算自其中使用肌动蛋白转录物(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照的三个独立样本的标准差来确定；关于在根部测得的值标准化所有值，所述在根部测得的值被任意地赋值为一。y轴表示所观察到的变化(x倍)。

图4.具有构建体35S:HAHB1的转基因植物的形态学和发育特性

a：转基因植物和WT植物的21日龄叶。转基因植物展示锯齿形叶片而WT植物不展示。箭头指出转基因植物的锯齿形边缘。b：转基因植物和WT植物的生命周期期间的茎高；c：在正常生长条件培养的30日龄植物。图4a显示转基因植物和野生型植物之间叶片形态学的差异。与非转化对应物相比转化植物显示锯齿形边缘和差异的形状(图4a和4c)。在4c中，转基因植物(35S:HAHB1；三个独立株系A、B和C)和WT植物显示相似的发育特性。在正常生长条件中植物是健康的。

图5.异位地和组成型表达35S:HAHB1的转基因植物对冷冻条件更加耐受

a：在冷冻处理后以上清液的电导率来测量的转基因植物和非转化植物的膜稳定性(见实验程序，翻至稳定性部分)；b：在冷冻条件中处理8小时后植物放置在正常生长条件中恢复6天后拍摄的照片：在冷冻处理后WT植物死亡而转基因植物(35S:HAHB1；三个独立株系TG(转基因)A、TG-B和TG-C)显示较小的受损程度。近似地，25％的叶片(TG基因型)衰老而其他是绿色和健康的。x轴显示在-8℃的时间周期而y轴显示浸出率(leaching ratio)(L)。经历如在b中的冷冻条件的所有基因型(转基因和非转化)的幸存百分比：

图6.在经历寒冷条件的植物中的叶绿素含量

如在实验程序中所述的测量在经历了所示周期的寒冷温度的表达HAHB1的转基因植物和野生型植物中的叶绿素含量。y轴上的值用μg叶绿素每g新鲜叶片表示。x轴显示在4℃的天数。

图7.表达HAHB1的转基因植物更耐受盐胁迫

a：在盐胁迫处理后以上清液的电导率来测量的表达HAHB1的转基因(TG-A和TG-B)植物和非转化植物(wt)的膜稳定性(见实验程序，翻至稳定性部分)；在x轴上NaCl的浓度用mM表示；b：在用200mMNaCl浇水2天后拍摄的说明照片。WT植物显示近似50％的死亡叶片(更浅色叶片)而转基因植物株系A和B分别展示超过80％和100％的健康绿色叶片。一些(不是所有)死亡叶片用箭头标记。

图8.表达HAHB1的转基因植物更耐受干旱

在给如在实验程序部分所描述的经历了干旱的转基因植物和野生型植物浇水2天后拍摄的说明照片。如可以通过衰老叶片(更浅色)估计的近似75％的WT植物死亡；而25％受损，只出现极少的绿色叶片。转基因植物呈现不同数目的死亡叶片(株系A20％，株系B和C 50％)并且较年轻的叶片是绿色且健康的。

图9.由HAHB1启动子区域指导的GUS报告基因的表达模式

在用prHAHB1:GUS转化的拟南芥转基因植物中GUS酶活性的组织化学检测。a、b、c和d：14日龄幼苗；e，30日龄植物以及f，45日龄植物；分生组织(a和b)；子叶(c)、下胚轴s(d)、顶端分生组织(e)和长角果(f)的视图。归因于由HAHB1启动子指导的基因表达的GUS活性(较暗的区域)清楚地可见于下胚轴、子叶和叶片的维管***中(A-D)以及分生组织区域中(E)和长角果的基部中(F)。

图10.在经历了寒冷条件的植物中由HAHB1启动子区域指导的GUS报告基因的表达模式

在寒冷条件后在用prHAHB1:GUS转化的拟南芥转基因植物中GUS酶活性的组织化学检测；a和b，顶端分生组织；c和d，根部；使用30日龄的植物。归因于由HAHB1启动子指导的基因表达的GUS活性(较暗的区域)清楚地可见于分生组织区域中(A和B)以及根部的维管***中(C和D)。

图11.具有构建体promHAHB1:HAHB1的转基因植物的形态学和发育特性

a：在正常生长条件培养的25日龄植物(wt和表达HAHB1的转基因植物)。植物(WT和三个独立转基因基因型)在正常生长条件下展示无法区分的表现型。b：转基因植物和WT植物的生命周期期间的茎高(y轴)。

图12.在其自身启动子的控制下表达HAHB1的转基因植物更耐受冷冻条件

a：在将植物(wt和表达HAHB1的转基因植物，事先在-8℃生长了8小时)放置在正常生长条件下恢复6天后拍摄的照片；TG-A、TG-B和TG-C代表来自三个独立转基因基因型(构建体promHAHB1:HAHB1)的植物。WT植物衰老并且几乎死亡(一些，但不是全部，死亡叶片用箭头标记)而转基因植物在老叶中展示一定的损伤，但是在较年轻的叶片中展示健康的外观。b：作为4℃下培育时间的函数在具有构建体promHAHB1:HAHB1的转基因植物中的HAHB1转录物水平其中y轴代表x倍的变化；转录物水平通过定量RT-PCR和计算自其中使用肌动蛋白转录物(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照的三个独立样本的标准差来确定；用在未处理的植物(0时刻)中测量的被任意的赋值为一的值来标准化所有值。在冷冻/恢复处理后四个基因型中存活者的百分比：

图13.转基因(35S:HAHB1)植物和野生型植物的质外体蛋白质

SDS-PAGE显示自以下植物获得的存在于细胞质外体中的蛋白质：未驯化植物(A)、在4℃驯化16小时的植物(B)、在4℃驯化10天的植物(C)以及在-8℃放置3小时的植物(D，冷冻处理)。所有样品分离自25日龄WT或转基因植物(35S:HAHB1的三个独立株系(A、B和C)或它们的混合(D))。在A、B和C中加载的样品获得自7g叶片组织而等体积的提取物被加载到凝胶中。在D中加载的样品获得自3g叶片组织而等体积被加载到凝胶中。箭头指示差异表达的条带。

图14.分离自驯化的转基因植物和野生型植物的质外体蛋白质的层析谱

纯化自两种基因型(转基因，表达HAHB1的两个独立株系：TG-A和TG-B，或野生型)的质外体蛋白质的Sephadex G-200柱洗脱层析谱(见实验程序)；转基因质外体蛋白质中的第二个峰增加到与其中此峰达到0.5-0.6OD的WT提取物相比的0.8-0.9OD。

图15.在经历了不同胁迫处理的转基因植物和野生型植物中防冻蛋白质的表达水平

在经历了干旱(EH)、4℃或用ACC(乙烯前体)、水杨酸(SA)或脱落酸(ABA)处理的植物(对照和表达HAHB1的两个独立转基因株系：TG-A和TG-B)中PR2(15c和f)、PR3(15b和e)和PR4(15a和d)的表达水平。

图16.HAHB1防止大冰晶的形成

提取质外体蛋白质并与26％蔗糖混合并且在几分钟的时间内在-80℃冷冻所述混合物；之后，将所述样品逐渐加热到0℃然后在-8℃放置一小时；最后，观察所述样品并用光学显微镜(x4)拍摄照片；A、B、C，在存在质外体转基因蛋白质(来自基因型35S:HAHB1的三个独立株系)的情况下形成的晶体；D，在存在质外体WT蛋白质的情况下形成的晶体；E，在存在26％蔗糖而没有蛋白质的情况下形成的晶体。

图17.具有构建体35S:GLUC的转基因植物更耐受冷冻条件

a：表达35S:GLUC的转基因植物和WT植物在正常生长条件下的形态学特性；在与对照植物相比的转基因植物(具有GLUC基因，AT4g16260)的五个独立F2株系的形态学特性中检测到非显著差异；b：转基因植物和WT植物在发育阶段晚期的茎高；c：经历了冷冻条件(-8℃下7hrs)并在拍照前在正常条件(22-24℃)下恢复超过六天的植物；在所述实验中使用三个独立株系，每装有100g土壤的盆(7x8cm)中有四株植物。在17a中，WT和三个独立转基因基因型在正常生长条件下展示无法区分的表现型而当它们经历了胁迫时，所有所示WT植物萎蔫(17c，死亡叶片是更浅色的)而转基因植物显示很大改善的存活率。冷冻处理后各基因型存活者的百分比：

基因型     存活者％

101.3      8

35S:GLUC   50

图18.在冷冻条件下具有构建体35S:PR2的转基因植物当与其WT对应物相比时展示差异的行为

a：在正常生长条件下转基因植物和WT植物的形态学特性；在与对照植物相比的转基因植物(具有PR2/葡聚糖酶基因/BGL2，AT3g57260)的五个独立F2株系的形态学特性中检测到非显著差异；b：转基因植物和WT植物在发育阶段晚期的茎高；c：经历了冷冻条件(-8℃下7hrs)并在拍照前在正常条件(22-24℃)下恢复超过六天的植物；在所述实验中使用三个独立株系，每装有100g土壤的盆(7x8cm)中有四株植物。在18a中，WT和三个独立转基因基因型在正常生长条件下展示无法区分的表现型而当它们经历了胁迫时WT植物萎蔫(18c)而转基因植物也受到相当的损伤如在c中所示，但是一些个体依然是绿色且健康的。冷冻处理后各基因型存活者的百分比：

基因型    存活者％

101.3     8

35S:PR2   17

图19.在低温驯化期间向日葵质外体蛋白质差异的表达

SDS-PAGE显示获得自经过4℃驯化的植物的质外体蛋白质在2周龄的向日葵植物中的表达模式；NA：未驯化植物；A12、A25和A42代表在将植物放置在4℃12、25和42天后采集的样品。

图20.用推定与低温响应相关的35S:HAHB1过表达基因转化的向日葵叶盘

用空载体(121)或35S:HAHB1(HAHB1)转化向日葵叶片；通过qRT-PCR来测量不同响应基因的转录物水平；使用肌动蛋白基因(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照而标准差计算自至少三个独立实验；所测量的基因是几丁质酶(A)、SAG21(B)、ZATlO(D)和DREBs(C)，每个的功能在结果部分描述。

图21.比较HD-Zip类蛋白质中的成员

将HAHB1羧基端的序列与使用blast算法发现的来自其他植物物种的最同源的蛋白质的羧基端作比较。a)至d)显示从所述C端的N端到所述C端的C端的C端序列。a)显示CI基序，d)CII基序。使用clustal算法比对序列(Waterhouse等人，2009)。对预期不具有与HAHbI或ATHB13相似功能的蛋白质，尽管在HD-Zip区域有高的同源性，但是在C端具有显著的趋异性。然而，此各HD-Zip成员间的比较在所述羧基端基序CI和CII中也显示一定程度的保守性。大部分同源蛋白质在功能上未被表征，但是在HD-Zip结构域中高的同源性允许将它们分类为HD-Zip蛋白质或编码HD-Zip蛋白质的基因。根据所述比对，可能推论出如本文所示的共有序列。

图22.融合不同HD-Zip结构域的嵌合蛋白质的示意图

使用融合一个蛋白质的HD-Zip结构域与另一个的羧基端结构域的嵌合蛋白质转化拟南芥植物，获得纯合株系并且分析表现型，尤其是关于由wt蛋白质HAHB1给予的已知特性，如与例如HAHB4的已知特性和作用比较。左侧：构建体的名称。CI和CII代表HAHB1的两个羧基端保守基序。C-ter表示不同于HAHB1或其同源物的HAHB4的羧基端。

图23.不同HAHB1区域与非冗余蛋白质DB的比对(Blastp算法)

图表中的条代表HAHB1的特定区域之间的同一性(ID)或相似性(SIM)的％和如已经由Blatp算法计算的在那个区域(白色)、ATHB13(模式化)和ATHB23(黑色)最相似的蛋白质。所比较的不同区段有：完整的HAHB1序列、HD-Zip结构域、整个COO端(CICII)、分离的第一基序(CI)和分离的第二基序(CII)。Blastp算法采用具有最高同源性的区域计算这些百分比。这显示在以下的图表中。

图24.转基因(35S:PR2)和野生型植物的质外体蛋白质

SDS-PAGE显示获得自未驯化WT和转基因(35S:PR2)植物的质外体蛋白质。所述样品分离自在正常条件下生长的25日龄植物。箭头指示差异表达的条带。分离来自在正常条件下生长的WT和转基因植物的质外体蛋白质并用SDS-PAGE分析。如可以观察到的，尽管所述植物没有经历低温胁迫，表达的PR2存在于转基因基因型中的细胞质外体中。此条带的分子量与PR2的预期分子量一致，但是还未进行序列确定。

图25.在用构建体35S:HAHB1和35S:ATHB13瞬时转化的大豆和烟草(Nicotians tabacum)叶盘中推定的PR2、PR4和葡聚糖酶被上调。

通过qRT-PCR测量不同响应基因的转录物水平；使用肌动蛋白基因(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照而标准差计算自至少三个独立实验；测量的向日葵基因是几丁质酶(tc18434)、HASAG21(tc19654)、HAZAT10(tc16546)和HADREB(tc23839)而对于大豆，它们是GMPR2(AK285952.1)、GMPR4(AK246040.1)和GM-葡聚糖酶(AY461847.1)以及对于烟草，是NTPR2(EU867448.1)和NTPR4(S72452.1)。

图26.表达转录因子HAHB1的纯合植物更耐受假单胞菌侵染。

26a：用假单胞菌侵染的植物是垂死的(用箭头显示萎蔫区域)而转基因植物是健康并且绿色的。26b是所述植物在侵染两天后的照片。在此照片中可以看到转基因植物未出现由更亮色区域所示的坏死，而WT植物出现坏死。26c是用伊文斯蓝(其染色坏死组织)染色后拍摄的照片。在此图中也可以评估基因型之间的差异：WT植物被染色(用箭头标记的斑点区域)而转基因不被染色。

图27.表达35S-β葡聚糖酶和PR2的纯合拟南芥植物。

35S-β葡聚糖酶(At4g16260)是微阵列实验中鉴定的HAHB1目标基因中的一个而表达35S-PR2的植物更耐受冷冻条件。121指定野生型(在冷冻条件下14％的幸存者)、35S-β葡聚糖酶(62％)、35S-PR2(42％)。在冷冻处理后对照植物展示显现为整个植物标记的萎蔫的严重损伤而转基因呈现更大百分比的健康组织，相比在35S:PR2基因型中，在35S:葡聚糖酶基因型中更高。

图28.PR4(所示五个独立株系中的三个)当它在转基因拟南芥植物中过表达和异位表达时给予耐冻性。

植物在对照条件下生长25天然后在蛭石/珍珠岩中在-8℃处理2小时。然后在拍照前将所述植物放置在正常条件下恢复6天。在冷冻处理后对照植物展示显现为整个植物标记的萎蔫的严重损伤而转基因(35S:PR4)呈现更大百分比的健康组织。转基因植物是F2(杂合)。处理后各基因型存活者的百分比：

图29.以释放的盐水的电导率来测量的wt和表达PR2的转基因植物(株系8、16和18)中的膜稳定性。

在冷冻处理后与WT植物相比，较低的相对电导表明35S:PR2植物中较高的膜稳定性。x轴显示“在-8℃1小时”的处理。

图30.以释放的盐水的电导率来测量的wt和表达葡聚糖酶的转基因植物中的膜稳定性

基本上按由Sukumaran和Waiser描述的(1972)来进行浸出技术。植物在标准条件下生长20天然后用50mM NaCl来浇水(11在45x45cm盘中)。此后一周，用150NaCl给所述植物浇水并且在更后的一周用200mM NaCl浇水。每次盐水浇水后的一天，切下来自每株植物的六枚叶片并用蒸馏水反复冲洗。之后将所述叶片放置在15ml双蒸去离子水中在25℃的水浴中连续搅动3hr。在倾析水提物后测量电导(C1)。然后，将所述叶片在65℃水浴中连续搅动地放置16小时并且在测量溶液电导(C2)前在25℃放置另外的一小时。实际电导以C2/C1(L＝C1/C)间的比率来计算并被用作损伤指数。高于0.5的L值表明严重的损伤。Y轴表明“相对电导”。在一小时的冷冻处理后，35S:H1植物中较低的相对电导表明比在PrH1:H1和WT植物中更高的膜稳定性。在对照条件中或在两小时的冷冻处理后，在基因型之间没有差异。

图31.葡聚糖酶转基因植物更耐受干旱胁迫

通过7天不给植物浇水使25日龄植物经历干旱胁迫。在重新浇水五天后拍摄照片。5b、14a和27a是载有葡聚糖酶转基因的株系。WT植物(左手侧第一列植物)比35S:葡聚糖酶植物(第二至第三列)损伤的更严重，如在它们的叶片中的萎蔫所示的。处理后各基因型存活者的百分比：

图32.过表达PR2的纯合植物更耐受干旱胁迫

基本如在图31中所述的那个那样进行此测定，但是其中是基因型35S:PR2对WT植物。WT植物(左手侧第一列植物)地上部分中的萎蔫显示它们比显示更健康组织的35S:PR2植物(第二至第三列：株系8C、16B、18B)受到干旱更显著的影响。

处理后各基因型存活者的百分比：

图33.评估用ACC、乙烯前体处理的幼苗的三重反应的发生。

量化顶钩(apical hook)的存在与否并且所得的比例用于比较各株系中的反应程度。35ScaMV:HAHB4拟南芥株系对乙烯几乎没有反应。H4WCT、H1WCT和H4H1显示中度的反应。最后，HAHB1和WT是高度反应的。X轴：株系，Y轴：没有顶钩的植物(比例)。

图34.在经历-8℃的植物中ATHB13表达动力学

ATHB13在-8℃放置3小时的21日龄幼苗中的诱导动力学。在0、30、60、120和180分钟采集样品。在放置在-8℃的21日龄叶片中的ATHB13的转录物水平通过定量RT-PCR和计算自其中使用肌动蛋白转录物(ACTIN2以及ACTIN8)作为内部对照的三个独立样本的标准差来确定；关于在0时刻测量的被任意地赋值为一的值标准化所有值。Y轴显示倍数诱导。

本发明优选实施方案详述

现在将进一步描述本发明。在以下的段落中，本发明的不同方面被更详细的定义。除非明显相反地指示，这样定义的各方面可以与任何其他一个或多个方面结合。尤其是，显示为优选的或优势的任何特征可以与显示为优选的或优势的任何其他一个或多个特征结合。

除非另外指示，本发明的执行将采用在本领域技术中的植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术。这样的技术在文献中得到充分的解释。

本文使用的术语胁迫/胁迫耐性包括非生物性和生物性胁迫。所述胁迫/胁迫耐性优选地选自：冷冻、低温、寒冷、干旱、高盐和/或病原体侵入。如本文所示，转基因植物显示对这些类型胁迫的增加的/增强的耐受性。可以如在实施例中所示的那样测量所述耐受性。与野生型(wt)植物相比耐受性增加。所述增加可以至少是两倍直至10倍或更多。

在一方面，本发明涉及分离的包含SEQ ID.No.1的核酸序列、其功能片段、部分或功能变体的核酸序列。在一个实施方案中，所述分离的核酸序列包括SEQ ID.No.1的核酸序列或由SEQ ID.No.1的核酸序列组成。

本文所用的术语“HAHB1的功能部分或功能变体”是指变体基因序列或保留全长的非变体序列的生物学功能即当在转基因植物中表达时给予胁迫耐性的所述基因序列的部分。具体地，所述变体可以是编码如本文所述的HAHB1的C端(或HAHB1的CI和/或CII或共有序列)的嵌合序列，例如与另一个HD-Zip I家族成员的N端偶联的。术语“变体”也可以指编码与HAHB1同源的肽/蛋白质序列并且在HD和LZ结构域以及同样在C端结构域(如下面说明的尤其是CI和CII)显示同源性的序列。功能变体也包括例如在非保守残基中与如本文所示的HAHB1和HAHB1序列基本相同(即只具有微小序列变化)并且给予胁迫耐性的HAHB1的变体。功能部分可以是编码CI和/或CII基序的序列。

本发明人也已经显示如在SEQ ID.No.1中定义的HAHB1启动子在感应胁迫条件中是有效的并且可以用于在转基因上给予胁迫诱导的基因表达，例如在寒冷、冷冻、低盐度或干旱条件下。因此，本发明也涉及胁迫可诱导的包括SEQ ID.No.1的核酸序列、功能片段或其功能变体的启动子或由SEQ ID.No.1的核酸序列、功能片段或其功能变体组成的启动子。所述启动子对于在用在所述启动子控制下的基因转化的转基因植物中控制转基因的转基因表达有用。因此，本发明也涉及包括包含SEQ ID.No.1的核酸序列、功能片段或其功能变体的基因构建体的载体并且涉及在SEQID No.1、功能片段或其功能变体中定义的序列作为胁迫诱导型启动子的用途。此外，本发明涉及用于在植物中给予胁迫诱导的基因表达的方法，其中所述方法包括用包含可操作地与用于表达的目标基因序列相连的SEQ ID No.1的核酸序列、功能片段或其功能变体的表达盒转化植物。

任何目标基因序列可以此方式可操作地联合从而在将具有构建体的植物暴露于选自冷冻、低温、寒冷、干旱和/或高盐条件的适当胁迫条件时获得这种诱导型表达。

在进一步的方面，本发明涉及分离的包含SEQ ID.No.7的核酸序列的核酸序列或由SEQ ID.No.7的核酸序列组成的核酸序列。在另一方面，本发明涉及分离的包含SEQ ID.No.2的核酸序列的核酸序列或由SEQ ID.No.2的核酸序列组成的核酸序列。本发明也涉及分离的包含SEQ ID.No.5的序列的多肽序列或由SEQ ID.No.5的序列组成的多肽序列。

本发明进一步涉及包括编码在植物中给予胁迫耐性的蛋白质的基因构建体的载体。具体地，本发明涉及包括编码包含SEQ ID No.5、其功能部分或变体的HAHB1蛋白质或由SEQ ID No.5、其功能部分或变体组成的HAHB1蛋白质的基因构建体的载体。在一个实施方案中，所述载体包括编码包含SEQ ID No.5的HAHB1蛋白质或由SEQ ID No.5组成的HAHB1蛋白质的基因构建体。

在进一步的方面，本发明涉及包括包含SEQ ID.No 2、6或7的核酸序列、其功能部分或功能变体的基因构建体的载体。尤其，所述序列包含核酸SEQ ID.No.6或7或由核酸SEQ ID.No.6或7组成。在一个实施方案中，SEQ ID.No 2、6或7的核酸序列、其功能部分或功能变体可操作地与启动子序列相连。例如，所述载体包含其中SEQ ID.6的核酸序列可操作地与启动子相连的表达盒。在另一个实施方案中，SEQ ID.7的核酸序列可操作地与启动子相连。

在上述载体的基因构建体中使用的启动子可以是包含SEQ ID No.1、其功能部分或功能变体的内源HAHB1启动子。例如，所述载体包含表达盒，其中SEQ ID.6或7的核酸序列可操作的与包含SEQ ID No.1的核酸序列的HAHB1启动子相连。在另一个实施方案中，所述启动子可以是驱动基因的组成型过表达的启动子。根据本发明的过表达是指以与由其内源启动子驱动的表达相比的更高的水平表达所述转基因。例如，过表达可以使用强启动子进行，强启动子诸如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)、水稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子或任何给予增强表达的启动子。也可以使用胁迫诱导型启动子，诸如RubisCO小亚基启动子。因为本领域技术人员将能够选择合适的启动子，所以不认为此列表是有限制的。

例如，所述载体包含表达盒，其中SEQ ID.6或7的核酸序列可操作的与CaMV35S启动子相连。备选地，可以通过使用转录或翻译增强子或激活子(activator)获得增强的或增加的表达并且可以将增强子结合到基因中从而进一步增加表达。此外，可以使用诱导型表达***，诸如类固醇或乙醇诱导型表达***。同样关注的是异位表达，即在其中通常不表达它的组织中的基因表达。

在另一个方面，本发明涉及用本文所述载体或基因序列转化的宿主细胞。具体地，本发明涉及表达具有SEQ ID NO.5、其功能部分或功能变体的蛋白质的宿主细胞。在优选实施方案中，所述细胞是植物细胞。所述植物细胞可以是如本文进一步所定义的单子叶植物或双子叶植物的细胞。

在本文中我们证明HAHB1通过诱导抑制冰晶形成的防冻蛋白质(AFP)的生物合成给予转基因植物胁迫耐性，例如耐冻性。

因此，在另一个方面，本发明涉及用本文所述的载体或本文所述的基因序列转化的转基因植物。因此，本发明涉及表达或过表达编码向日葵HAHB1蛋白质或其变体或功能部分的基因的转基因植物。优选地，HAHB1蛋白质包含在SEQ ID NO.5、其功能部分或功能变体中所定义的序列或基本由在SEQ ID NO.5、其功能部分或功能变体中所定义的序列组成。因此，在一个实施方案中，所述转基因植物表达或过表达编码在SEQID NO.5中所定义的HAHB1蛋白质的基因。例如，所述植物可以由包含SEQ ID No.6或7的核酸序列、其功能部分或功能变体的基因构建体转化。包含SEQ ID No.6或7的序列的核酸可以在上面定义的启动子的控制下。在一个实施方案中，包含SEQ ID No.6或7的序列的核酸在包含SEQ IDNo.1的核酸序列、其功能部分或功能变体的HAHB1启动子的控制下。在另一个实施方案中，包含SEQ ID No.6或7的序列的核酸在CaMV35S启动子的控制下。如以下说明的，所述基因序列也可以是编码HAHB1(在HD、LZ和CICII结构域中具有高同源性)的同系物诸如ATHB13或包含HAHB1的C端结构域的嵌合构建体的基因序列。所述植物的特征在于相比其野生型对应物它对胁迫条件更耐受，特别是对选自以下的胁迫：冷冻、低温、寒冷、干旱、高盐和/或病原体侵入。在一个实施方案中，所述胁迫是冷冻。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于产生胁迫耐受植物或增强植物的胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码包含在SEQ ID NO.64或其功能变体或部分中所示的序列的ATHB13的核酸序列转化植物。因此，如关于SEQ ID NO.2、6和7所要求的用途和方法同样适用于SEQ ID NO.64。另一个可用的实例是与HAHB1高度同源的基因ATHB23。

因此获得的转基因植物的特征在于与对照植物相比它显示增强的胁迫耐性。所述对照植物优选地是野生型植物。

在另一个方面，本发明涉及用于产生胁迫耐受植物的方法，所述方法包括用本文所述的核酸序列或本文所述的载体转化植物。本发明还涉及用于在植物中增加胁迫耐性的方法，所述方法包括用本文所述的核酸序列或本文所述的载体转化植物。

在这些方法的一个实施方案中，转基因指导包含SEQ ID No.5的序列的HAHB1蛋白质的表达。例如，可以使用包含SEQ ID No.6或7的序列的核酸序列来进行转化。此序列可以是在包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能部分或功能变体的HAHB1基因启动子的控制下或在CaMV35S启动子的控制下。所述转基因还可以指导HAHB1蛋白质(例如与另一个HD-Zip蛋白质的N端融合的C端)的部分或HAHB1同系物例如ATHB1 3的部分的表达。

与本发明上述方面有关，胁迫耐性选自对非生物性或生物性胁迫的耐受。非生物性胁迫选自冷冻、低温、寒冷、干旱和/或高盐条件。生物性胁迫是由病原生物诸如细菌或真菌病原体引起的胁迫(见实施例16和图26)。

在另一个方面，本发明涉及通过本文所述方法可获得的植物或由本文所述方法获得的植物。

在另一个方面，本发明涉及本文定义的核酸序列或载体在给予植物增加的胁迫耐性的用途。在一个实施方案中，所用序列是包含SEQ ID No.6或7的序列的核酸。此序列可以在包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能部分或功能变体的HAHB1启动子的控制下或在CaMV35S启动子的控制下。所述胁迫耐性选自对非生物性或生物性胁迫的耐受。非生物性胁迫选自冷冻、低温、耐寒性、干旱和/或高盐条件。生物性胁迫是病原体例如假单胞菌的侵入。

如本文所示，其中引入有本文所定义的载体或序列的植物可以是拟南芥。本发明人已经证明来自向日葵的HAHB1基因序列可以指导拟南芥中HAHB1蛋白质的表达。此外，本发明人已经证明在其他植物或植物组织中分别转基因表达35S:HABH1和表达35S:ATHB13导致预期的目标基因的上调，因此证明HABH1和ATHB13两者在外源植物宿主中是有效的并且证明HABH1和ATHB13的转基因表达在植物的遗传操作中具有普遍应用。因此技术人员将理解本发明不限于在本文的实验中用作非限制性实施例的拟南芥、大豆或烟草。技术人员将理解可以使用任何单子叶或双子叶植物。双子叶植物可以选自这样的科，其包括但不限于：菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)(例如欧洲油菜(Brassica napus))、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)、Aesalpiniaceae含羞草科(Mimosaceae)、蝶形花科(Papilionaceae或Fabaceae))、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，所述植物可以选自莴苣、向日葵、拟南芥、椰菜、菠菜、西瓜、南瓜、甘蓝、番茄、马铃薯、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、苜蓿、豆、大豆、蚕豆、豌豆、扁豆、花生、鹰嘴豆、杏树、梨树、桃树、葡萄藤或甘菊属。在一个实施方案中，所述植物是欧洲油菜(oilseed rape)。

还包括生物燃料和生物能农作物诸如甘蔗、欧洲油菜/油菜、亚麻子和柳树、杨树、杂种杨(poplar hybrid)、柳枝稷(switchgrass)、芒属(Miscanthus)或裸子植物诸如火炬松。还包括用于以下用途的农作物：青贮饲料(例如青贮玉米)、放牧或饲料(草、三叶草、红豆(sanfoin)、苜蓿)、纤维(例如棉花、亚麻)、建筑材料(例如松树、橡树)、纸浆(例如杨树)、用于化学工业的给料器原料(feeder stock)(例如高芥酸欧洲油菜、亚麻子)以及用于康乐目的(例如高尔夫球场草皮)、公共和私人花园装饰(例如金鱼草、牵牛花、玫瑰、天竺葵、烟草品种)以及用于家庭的植物和切花(非洲紫罗兰、秋海棠、菊花、天竺葵、鞘蕊花(Coleus)吊兰、龙血树、橡胶树)。

单子叶植物可以例如选自以下各科：棕榈科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，所述植物可以是谷类作物，诸如小麦、稻、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、洋葱、韭菜、黍、荞麦、草皮、多花黑麦草(Italian rye grass)、柳枝稷、芒属、甘蔗或羊茅属植物品种。

优选地，其中引入本发明的序列或载体的植物是作物植物。作物植物是指用于人或动物消耗或使用的或用于其他非食物/饲料用途的工业规模种植的任何植物。

优选的植物是玉米、烟草、小麦、稻、欧洲油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、大麦、豌豆、扁豆、蚕豆、棉花、莴苣、椰菜或其他蔬菜芸苔或杨树。

本文所述的编码HAHB1蛋白质的序列或载体作为转基因被引入植物中。这可以通过植物遗传工程领域已知的多种办法进行，例如使用土壤杆菌或粒子轰击来转化。

所述基因可以是在不同植物物种中表达的外源基因，诸如向日葵HAHB1。备选地，本发明也涉及使用表达HAHB1同系物的内源基因，例如编码对于其中引入它和表达或过表达它的植物来说是内源的HAHB1同系物的基因。如本文别处所说明，所述同源基因在HD和LZ结构域显示高的序列相似性，而且在C端结构域(CI和CII)也显示高的序列相似性因为所述C端结构域对于给予HAHB1功能看来是关键的。

我们描述了植物中若干选择参数的测量，所述植物用构建体转化，所述构建体载有在组成型启动子诸如35S启动子的控制下的HAHB1基因或在本文中统称为HAHB1的其合适的变体、类似物、同系物或直向同源物，所述35S启动子可操作地与HAHB1蛋白质的编码序列相连从而制备名为35S:HAHB1的构建体，或者所述构建体载有在HAHB1基因的启动子的控制下的HAHB1基因、其合适的变体、类似物、同系物或直向同源物，在本文中这种构建体统称为promHAHB1:HAHB1。在下面的实验部分进一步详细的描述使用那些参数来对这些植物和用对照构建体例如pBI 121并且在本文中被称为“WT”转化的植物进行的比较。所述比较证实在包含在任一启动子的控制下的HAHB1构建体的植物中观察到的耐冻性的增加是由于诱导的AFP的作用，并且这基本上帮助保存膜稳定性和叶绿素含量以及抑制冰晶形成和重组植物中的破坏。

之前已有报道，在载有在组成型启动子诸如CaMV 35S控制下的转录因子作为转基因的转化植物中普遍观察到发育和形态学的损失(Arce等人，2008以及其中的参考文献)。这些损失很可能是由在正常生长条件下不必要的特殊蛋白质生物合成的激活所产生的代谢值导致的。在这种意义上，HAHB1似乎非常轻微地延缓了用35S:HAHB1构建体转化的植物的较早发育阶段的发育率，但是此特性在所述转化植物生命周期的晚期几乎完全消失。在用构建体promHAHB1:HAHB1转化的转基因植物中没有观察到形态学或发育负面特性，表明在这些植物中所述基因在没有环境胁迫存在的情况下以很低的水平表达。显然这些转录物水平对于产生高代谢值是不够的但是对于获得所需的耐冻性响应是足够的。

区别寒冷和冷冻条件间的不同是重要的，因为在这两种不同的胁迫中由植物引发的结果和反应是不同的。延长的冷冻引起组织死亡并且最终导致植物死亡而延长的寒冷导致植物驯化和发育停滞。在4℃培育若干月的拟南芥植物中，不管是根据本发明的WT还是根据本发明的转基因，当放置在正常条件下时所述植物存活。这些驯化的植物随后在冷冻条件下的暴露证明与未驯化的植物相比所述驯化的植物的存活得到增强。尽管不能检测在寒冷条件下驯化的WT和驯化的HAHB1转化植物之间存活的差异，但是我们能够测量基因型之间叶绿素含量和膜稳定性两者的显著差异，从而显示转基因基因型获得更好的耐受性。

另一方面，与WT植物相比，对HAHB1转化植物的冷冻处理在营养阶段和生殖阶段两者中检测到更大的存活百分比，这加强了在寒冷期间获得的结果。合起来，所述观察证实转化HAHB1给予植物耐冻性和耐寒性两者。

与冷冻或寒冷一样，干旱弧高的盐浓度，例如，也引起对植物的胁迫。然而，植物对不同类型的非生物性胁迫的耐受不一定由相关的机制给予并且实际上经由不同的信号转导通路发生。因此，不能预期当表达时给予一种类型胁迫的基因也能够给予不同类型的胁迫。显著地并且是出人意料地，在本文中我们证明在植物中HAHB1的作用是增强对所有这三种不同胁迫因子-冷冻、干旱和高盐的耐受响应。HAHB1转基因植物比非转化对照更耐受干旱和高盐，这表明HD-Zip蛋白质至少当其组成地表达时在若干非生物性胁迫响应中以某种方式伴随地起作用。微阵列数据证实了这点，因为若干之前描述为涉及非生物性胁迫耐性的基因诸如DREB在异位地并且组成地表达HAHB1的转基因植物中强烈的被诱导。

此外，如在实施例中所示，HAHB1转基因植物更耐受病原体例如假单胞菌的侵入。

耐受响应在物种之间是保守的。在一种关于冷冻响应更具特征的物种冬黑麦中，与在拟南芥微阵列中检测到的那些同源的防冻蛋白质最终是造成此耐受的原因。另一方面，尽管可用的向日葵基因组数据是有限的，但是我们能够鉴定一些基因(与在微阵列中检测到的那些同源)，所述基因在瞬时转化的向日葵叶片中显示较高的表达水平。驯化测定显示一致的结果：当将所述植物放置在4℃时在拟南芥和向日葵两者中质外体蛋白质模式改变。在本文的实验步骤部分中，我们提供来自重结晶实验的数据，所述数据显示在阻止冰晶形成方面转基因植物质外体提取液比来自对照的提取液更有效。

我们还显示被认为在抗病原体响应中起作用的拟南芥PR蛋白质在所述防冻响应中发挥作用。在冷冻条件下测试过表达HAHB1并且分别地过表达PR2、PR3和葡聚糖酶的植物并且这些基因型比对照(wt)植物对冷冻更耐受。不希望受限于理论，一方面可能的是防冻蛋白质组只有当HAHB1存在并且它们全部表达时可以协作地起作用从而获得最佳耐受。另一方面，根据本文呈现的数据，这些PR蛋白质中的一些如果被高度地表达可以能够独立地给予耐冻性。如在实施例10和图27至32所示，相比野生型，PR2、PR4和β-葡聚糖酶的过表达给予对冷冻条件的耐受。此外，还观察到对增加的盐度的耐受。因此，在转基因植物中表达PR2、PR4和β-葡聚糖酶可以导致增加的胁迫抗性。表达可以从内源启动子或本文定义的任何其他启动子例如适合过表达的启动子开始。

因此，在另一个方面，本发明涉及用于产生耐胁迫植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码PR2的核酸序列转化植物。所述序列可以包含SEQ ID NO.66、其同系物或变体。所述耐受优选地是耐冻性或耐旱性。由此方法获得的植物也在本发明的范围内。也在本发明的范围内的是编码PR2的核酸序列在增加/给予胁迫耐性中的用途。

在进一步的方面中，本发明涉及用于产生耐胁迫植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码葡聚糖酶的核酸序列转化植物。所述序列可以包含SEQ ID NO.65、其同系物或变体。所述耐受优选地是耐冻性或耐旱性。由此方法获得的植物也在本发明的范围内。也在本发明的范围内的是编码葡聚糖酶的核酸序列在增加/给予胁迫耐性中的用途。

在进一步的方面中，本发明涉及用于产生耐胁迫植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码PR4的核酸序列转化植物。所述序列可以包含SEQ ID NO.67、其同系物或变体。所述耐受优选地是耐冻性或耐旱性。由此方法获得的植物也在本发明的范围内。也在本发明的范围内的是编码PR4的核酸序列在增加/给予胁迫耐性中的用途。

在另一个方面，本发明涉及用于鉴定当被引入植物中时给予胁迫耐性的核酸序列的方法，所述方法包括使用核酸序列在文库中探查植物基因组或植物基因组克隆，所述核酸序列包含SEQ.ID.NO：1、2、6、7的序列、或其部分或编码与SEQ.ID.NO.11、12或14的序列具有同源性的序列的序列、或编码SEQ.ID.NO：8或13的全部或选定部分的核酸或编码SEQ.ID.NO：5的全部或选定部分的核酸。所述序列也能够用于探查电子文库，从而使用生物信息学鉴定具有同源性的序列。

本发明也涉及由上述方法获得的或可以由上述方法获得的分离的核酸序列。

在另一个方面，本发明涉及与如在SEQ ID NO.6或7中定义的HAHB1序列同源的核酸序列，其中所述基因序列当被引入植物并在植物中表达时能够给予胁迫耐性。

优选地，所述同源的核酸序列显示对包含SEQ ID NO.6或7的HAHB1序列至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的同源性。

所述同源核酸序列的特征在于它编码的蛋白质在其N端区域具有与如在SEQ ID No.14中所示的共有序列有同源性的同源异型结构域。

所述序列也包含亮氨酸拉链。所述亮氨酸拉链已经在例如CDD数据库中定义，在所述CDD数据库中它以此名称被识别：PSSM Id：121415。

此外，所述同源核酸序列的特征在于它编码的蛋白质具有与在SEQ IDNO.8中所示的HAHB1的C端序列同源的C端序列。此外，所述同源核酸序列的特征在于它编码的蛋白质具有包含与在SEQ ID NO.11和/或12中所示的共有序列同源的序列的C端序列。优选地，所述同系物与包含SEQ ID NO.11的HAHB1序列的同源性至少是80％，优选地是至少90％，更优选地是至少95％。

从本文所提供的信息，技术人员将理解保守结构域的存在并且将了解基于提供的序列信息，还可以设计引物从而促进同源物的鉴定。

除蛋白质序列同源性和给予胁迫耐性的生物功能外，当在植物中通过转基因技术表达时，因为在由其启动子指导的表达模式以及在蔗糖中的行为方面它显示与HAHB1的相似性，所以同源序列也可以被鉴定。

由于可获得详细的序列信息，还可能使用生物信息学从现有的数据库鉴定同源序列。一旦所述同源序列已经因此被鉴定，可能设计寡核苷酸从而使用分离自所选的处于其中所述基因被表达的状态的植物的RNA扩增相应的cDNA。扩增后，可以将所述DNA片段克隆到合适的载体中从而通过序列测定来验证(多拷贝)并且亚克隆到适用于由选定的启动子指导的植物转化的载体中。如果需要同源物的启动子，必须通过PCR扩增它或备选地从基因组文库分离整个基因。当整个序列未知以及只有部分片段已知以致不能构建探针时，不得不从基因组文库分离。同样地如果可以获得这样的文库和合适的探针cDNA可以从cDNA文库分离。如此鉴定的基因然后能够在下述方法中使用。

在另一个方面，本发明涉及用于产生耐胁迫植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用上述同源核酸序列转化植物。

以下四个有区别的特性支持将HD-Zip蛋白质分类为四个亚家族：所述HD-Zip结构域的保守性确定DNA结合特异性、基因结构、另外的保守基序以及功能。

HD-Zip家族成员正好在HD基序的下游展示LZ基序。所述两个基序存在于属于其他真核界的转录因子中，但是它们在单个蛋白中的彼此联合只有植物才有。HD负责特异地结合到DNA而LZ作为二聚化基序起作用。HD-Zip蛋白质以二体形式与DNA结合，而LZ的缺少完全地消除了它们的结合能力，表明受此基序驱使的单体的相对取向对于DNA的有效识别是关键的。

在拟南芥中，亚家族I由十七个成员组成(ATHB1/HAT5、3/HAT7、5、6、7、12、13、16、20、21、22、23、40、51、52、53、54)。HD-ZipI亚类的基因(在拟南芥中)根据它们的******共享它们的内含子/外显子分布。所编码的蛋白质的分子量大约是35kDa并且展示高度保守的HD和保守性略低的LZ。据我们所知，还没有描述其他相似性或另外的保守基序的出现。

由PCR辅助的结合位点选择和足迹法测定组成的全面的体外描述确定由HD-Zip I基因编码的所测试的所有蛋白质以二聚体的形式识别假回文序列CAAT(A/T)ATTG(Ariel等人，2007)。

比对15个最同源的拟南芥HD-ZIP亚家族I蛋白质，可能获得同源异型结构域的相对好的共有序列，但是不能获得亮氨酸拉链的相对好的共有序列。后者的确定取决于亮氨酸和某些其他残基的保守性其中特别要注意相对位置，所以同系物的百分比倾向于很低(所述保守性主要是由亮氨酸的位置定义的结构保守性)。

在对15个拟南芥HD-Zip I类蛋白质的比对中，同源异型结构域的百分比比亮氨酸拉链结构域的百分比高得多。

已经被表征的HD-Zip I类基因的表达表明它的表达受外部因子像干旱、极端温度、渗透胁迫和光照条件的调节，并且对植物的不同组织和器官是特异的。在对这种环境条件尤其是其中非生物性因子产生胁迫的响应中它们作为转录因子的作用与发育事件有关，但是不一定给予对这样胁迫的耐受。对于确实给予耐受的那些因子，也不能事先预知它们将对那种胁迫给予抗性。

具有很近的***发生相似性的不同亚类的拟南芥HD-Zip I基因展示共同的器官表达模式并且对同样的环境因子起反应。

ATHB1，第一个分离的成员，作为介体在叶片细胞命运决定中起作用，而ATHB16涉及蓝光感知信号转导。提出另一组基因涉及ABA相关的非生物性胁迫响应。从表达研究和转基因植物获得的证据表明ATHB 7、12、5和6受水分亏缺条件和/或外部施用ABA的上调或下调。在这些刺激的作用下，HD-Zip I基因作为发育和生长调节子起作用。向日葵HAHB4基因，对它的部分而言，当它在组成型或干旱诱导的启动子的控制下表达时给予转基因拟南芥植物耐旱性，而ATHB7和ATHB12则不，即使在拟南芥中它们是更相关的基因，除了在C端。因为不能获得向日葵基因组序列，并且考虑到HAHB4不具有如ATHB7和12所具有的作用，所以最有可能的是它们不是直向同源基因，即使它们展示高的序列同源性并且受相同外部因子的调节。

ATHB3、13、20或23的过表达提示这些基因涉及调节子叶和叶片发育，即使ATHB1 3和ATHB23是呈现出与HAHB1最高同源性的拟南芥基因。

通过系列基因复制HD-Zip I基因已经进化得相当复杂，这导致共生同源基因的亚类，所述亚类共享内含子/外显子分布、氨基酸序列和表达模式。各HD-Zip I基因亚类的异位表达引起不同的表型作用。

本发明人研究了为何与同样的DNA序列结合(由HD结构域的螺旋III确定的特征)并且具有类似表达模式的所有HD-Zip I蛋白质，却参与不同的信号转导通路并且甚至执行不同的功能。

在本文中我们已经显示对各HD-Zip成员的比较显示了在属于不同物种的蛋白质的羧基端区域中的高度的保守性(见本文中作为图21提供的比对)。

根据羧基端结构域的保守性，可以将亚家族I划分为若干组。所有的成员在HD-Zip结构域共享同源性，但是当进行整个编码蛋白的比对时，可以看到(***发生树)若干组，在它们之间羧基端有所不同。

虽然在此区域出现高度的保守性，但是尽管进行了深入的生物信息学分析但还没有检测到与任何其他已知基序的相似性。HAHB1与不同的并且关系远的物种的蛋白质共享此相似性。不希望受限于理论，本发明人相信所述C端区域提供无序的蛋白质-蛋白质相互作用结构域，并且此结构域与其他多种蛋白质的相互作用确定了所述蛋白质的功能。

本发明人在本文中已经显示在没有HD-Zip结构域的情况下，HAHB1COO端不能自发地行使功能。他们也已经显示融合到HAHB1的COO端的HAHB4的HD-Zip(它的COO端缺失)，看来作用就像HAHB1一样。到目前为止所有表征的HD-Zip I成员与同样的DNA序列结合。因此，据信融合到任何亚家族I HD-Zip结构域的HD-Zip区域的HAHB1 COO端担当功能性的HAHB1。

从本文所示实验，可见是C端区域(CICII)给予蛋白质功能。因此HD-Zip I家族成员C端的多样性似乎解释了这些蛋白质的不同的功能和发育作用。因此也可以在本文所述的用于给予增加的非生物性和生物性胁迫耐性的方法中使用包含担当功能性的HAHB1的融合到任何亚家族IHD-Zip结构域的HD-Zip区域的HAHB1 COO端的嵌合构建体。

在这种嵌合构建体中，N端区域的特征在于它包含与在SEQ ID NO.14中所示的共有序列(其获得自亚家族I)具有同源性的同源异型结构域，并且在其C端连接有亮氨酸拉链。此外，此保守的同源异型结构域能够与此亚家族特征性的并且区别于其他亚家族的成员所结合的序列的回文序列CAAT(A/T)ATTG结合。

因此，在另一个方面，本发明涉及包含如在SEQ ID No.8、9、10、11、12或13中定义的序列或由如在SEQ ID No.8、9、10、11、12或13中定义的序列组成的分离的核酸序列。包含这种序列的载体也在本发明的范围内。

在另一个方面，本发明涉及嵌合基因构建体，所述嵌合基因构建体包含编码HD Zip蛋白质N端序列、其部分或包含亚家族I N端共有序列基序的序列的核酸序列，所述核酸序列与编码包含HAHB1的C端、其部分的序列或包含HAHB1C端共有序列基序的序列的核酸序列可操作地相连。

本发明还涉及由此基因构建体编码的多肽。所述多肽能够在其中引入有表达这种多肽的基因的植物中给予胁迫耐性。

在本发明的这个方面的一个实施方案中，所述多肽的C端序列包含SEQ ID NO.8、9和/或10或由SEQ ID NO.8、9和/或10组成。在另一个实施方案中，所述多肽的N端序列包含SEQ ID NO.14或与SEQ ID NO.14的共有序列具有同源性的序列或由SEQ ID NO.14或与SEQ ID NO.14的共有序列具有同源性的序列组成。所述同源性至少是80％，优选地至少是90％，更优选地至少是95％或98％。在另一个实施方案中，所述多肽具有亚家族I的HD-Zip蛋白质的N端序列或N端共有序列基序，所述亚家族I的HD-Zip蛋白质的N端序列或N端共有序列基序可操作地与以下序列相连：包含如在SEQ ID NO.11和/或SEQ ID NO.12中定义的序列或由如在SEQ ID NO.11和/或SEQ ID NO.12中定义的序列组成的序列或与如在SEQ ID NO.11中定义的C端共有基序具有同源性的序列和/或与如在SEQID NO.12中定义的C端共有基序具有同源性的序列。所述同源性至少是80％，优选地至少是90％，更优选地至少是95％或98％。

在另一个实施方案中，所述多肽的N端是HAHB4的N端。

本发明还涉及用于在植物中给予本文所述的胁迫耐性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达其中编码如以上定义的多肽或蛋白质的嵌合基因构建体。

实施例

已经大体上描述了本文中公开的本发明，包括使本领域技术人员能够制造并使用本发明的方法，提供以下的实施例从而进一步扩充此描述，从而使本领域技术人员能够实践本发明，包括其最佳模式。然而，随后的实施例的细节不是限制性的。相反，为了理解本文中预期的本发明的范围，必须应当参考所附权利要求和其等价物。

实验程序

除非另有明显说明，在随后的非限制性实施例中使用以下的材料和方法：

A.构建体

35SCaMV:HAHB1：如之前所述cDNA分离自构建在lambda gt10中的文库(Chan和Gonzalez，1992，并且所述序列被提供给GenBank，见登录号L22847，并且在本文中SEQ ID.NO：2：代表其核酸序列而SEQID.NO：5：代表其翻译的蛋白质序列)。在pMTL22载体的EcoRI位点中克隆此片段并用BamHI/SacI限制酶切从而将其克隆到事先用同样的酶处理过的pBI 121载体中。这样，所述cDNA的表达在35S CaMV启动子的控制下。

HAHB1:GUS：使用之前通过PCR使用两个特异的寡核苷酸分离的基因的第一个内含子(SEQ ID.NO：3：本文中)作为探针从BAC基因组文库分离启动子区域(SEQ ID.NO：1：本文中)。用若干酶限制酶切近似125kbp的BAC***片段、电泳并使用相同的探针在Southern印迹中杂交。在pUC119载体中亚克隆正义的2000bp HindIII片段并测序。所述***片段呈现部分编码序列以及所述启动子区域。通过PCR使用寡核苷酸PromHAHB1(表a)和PR(表a)扩增所述启动子区域并克隆到TOPO载体(Invitrogen)中。然后用XbaI和BamHI限制酶切此质粒并且最终克隆到pBI101.3载体中。用此方法HAHB1的启动子指导所述GUS报告基因的表达。此构建体的名称是HAHB1:GUS。

promHAHB1:HAHB1：用BamHI/SacI限制酶切HAHB1:GUS并且将HAHB1 cDNA克隆到所述载体中，从而替代GUS基因。用此方法HAHB1的表达被它自己的启动子控制。

使用这三个构建体以及pBI121和pBI101.3(用作对照)转化DH5α大肠杆菌细胞然后转化根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

按以下方法克隆拟南芥葡聚糖酶和PR2两者：使用寡核苷酸葡聚糖酶CDS-R/葡聚糖酶CDS-F和PR2 CDS-R/PR2CDS-F扩增拟南芥(Col 0)基因组DNA。用于葡聚糖酶的寡核苷酸的序列在本文的序列表中显示为SEQ ID NO.23和24。用于PR2的寡核苷酸的序列在本文的序列表中显示为SEQ ID NO.21和22。

一旦获得所述DNA片段，将它们克隆到事先用BamHl/SacI限制酶切的pBI121载体中以替代GUS编码基因。和其他构建体一样，所述克隆在E.Coli细胞中进行然后转化土壤杆菌细胞。然后遵循植物浸渍法(floral dipmethod)转化拟南芥植物。

B.植物材料和生长条件

拟南芥Heyhn.ecotype Columbia(Col-0)购自Lehle Seeds(Tucson，AZ)。在图片中显示的周期期间，植物在强度为大约150μEm^-2s^-1的长日照光周期下(用冷白荧光灯和GroLux荧光灯的混合光照16h)直接种植在22-24℃生长室中的8cm直径x7cm高度的盆中的土壤中。

根据如在图列中详述的实验目的，将向日葵(Helianthus annuus L.)(向日葵cv.contiflor 15，来源于Zeneca)种子在28℃培养室的土壤中种植不同的时间周期。

C.非生物性胁迫和激素处理

将生长在湿纸上的向日葵幼苗(7日龄)放入含有不同激素(以图例中所示的浓度)的液体培养基中并培育两小时。然后在液氮中冷冻所述植物；从各个样品提取总RNA并通过实时PCR(RT-PCR)分析如以下所述。

在21日龄植物的情况中遵从类似的程序，但是在此情况中，将1cm直径的叶盘(每种处理三个盘)而不是整个幼苗放入含有激素的培养基中。对于幼苗干旱测定，将幼苗在干纸上放置30分钟。

D.拟南芥转化

通过植物浸渍法使用转化的根癌土壤杆菌株系LBA4404来获得转基因拟南芥植物(Clough和Bent，1998)。根据卡那霉素抗性和在具有特异寡核苷酸的基因组DNA上进行的阳性PCR选择转化的植物。为评估HAHB1的表达，在T2转化体上进行RT-PCR，如以下所述。每个构建体的五个阳性独立株系(来源于至少两次不同的转化实验)被用于选择纯合的T3和T4以便分析HAHB1的表现型和表达水平。使用用pBI101.3转化的植物作为阴性对照。对于其他的构建体，进行类似的选择并且选择三至五个独立株系用于分析。

E.向日葵叶片的瞬时转化

用5ml根癌土壤杆菌株系LBA4404渗透向日葵叶片(在Rl发育阶段中；Schneiter和Miller，1981)然后用35S:HAHB1或用作对照的35S:GUS转化。在渗透后，将植物在生长室中放置另外的48hr；从经渗透的叶片切下1cm直径的盘(每个50mg)然后使用Trizol提取RNA(见下)。对每个基因转录物测量，分析来自不同植物的两个盘并且重复所述实验至少两次。为测试这些实验中的渗透效率，如之前所述的通过组织化学测定来测量GUS报告基因的表达(Dezar等人，2005b)。

F.水胁迫处理

土壤中的早期水胁迫处理进行如下：十六个8x7cm盆，每个盛有120g土壤和4个种子，使其水饱和，将其放置在35cm方形塑料盘中并且除直到观察到严重损伤为止不再添加水以外如上所述的那样培养。

对在同样培养条件中生长的成熟的4周龄植物进行水胁迫处理。在此年龄，不再添加水直到胁迫变得明显为止(大约另外的17天)。在两种情况中，在浇水两天后拍摄照片。

G.寒冷测定

在14天期间(营养阶段)或25天期间(生殖阶段)拟南芥植物在与水胁迫相同的温度和光周期中生长。然后，将它们放置在4℃的具有同样光周期和光照条件并且在相应的图中所示的周期期间维持所述条件的特殊的培养室中。

H.冷冻测定

进行两种不同的测定类型。第一种将在正常条件下生长的未驯化植物在-8℃培育6-8小时。在所述冷冻处理后将所述植物再放置在正常条件下并在6天的恢复后测量所有参数。

所用的备选处理将14日龄植物在4℃培育超过7或14天并且只是在此驯化处理后，使它们经历超过6-8hrs的-8℃。此后，将所述植物在4℃放置24hrs然后在正常生长条件下放置6天。

I.盐胁迫处理

对于在正常条件下生长的14日龄植物，将1.5L 50mM NaCl添加到整个盘中。七天后，使用另外的一升150mM NaCl给所述植物浇水并且在七天后最后添加又一升200mM NaCl。用此方法盐胁迫在生殖阶段期间发生。通过添加从50到200mM增加浓度的NaCl用于每4天给10日龄植物浇水来产生营养阶段期间的盐胁迫。

J.叶绿素定量

在用液氮冷冻后制备来自100mg叶片的提取液。向每个样品添加1.5ml 80％的丙酮并且将试管在黑暗中放置30min。在此培育期间将所述样品固体倒出并用分光光度计在645和663nm测量上清中的吸光度。根据Whatley等人的方法(1963)定量叶绿素浓度。

K.膜稳定性

通过离子渗漏技术确定膜稳定性。在用根据所述实验的盐胁迫或低温处理前用蒸馏水冲洗每种基因型的叶片。在相应的处理后，将它们放置在15ml蒸馏水中并且在25℃搅动1hr。此后，测量周围液体培养基中的电导率(C₁，与稳定性成反比)。在持续搅动的条件下在65℃放置4小时并且在25℃放置另外的一小时后在上清中确定最终的电导率(C₂)。损伤指数(L)计算为C₁/C₂的比率。此技术的基础是损伤的组织失去电解质而这些电解质扩散到周围培养基中并且增加电导率。大于0.5的值表示严重的损伤(Sukumaran和Weiser，1972)。

L.对转基因植物的激素和胁迫处理

将来源于promHAHB1:HAHB1基因型的转基因植物(21日龄)在200μM SA、200μM ABA或20μM ACC中放置超过2hrs。在培育后，将它们冷冻并且从每个样品提取总RNA。通过将所述植物放置在4℃培养室中或干纸上来进行分别超过8和2hrs的低温和干旱处理。使用用pBI101.3质粒转化的植物作为对照。

M.RT-PCR测量

根据制造商的使用说明使用

试剂(Invitrogen^TM)来制备用于实时RT-PCR的RNA。RNA(1μg)被用于使用M-MLV反转录酶(Promega)的RT-PCR反应。在含有1μl SyBr green(10x)、10pmol每种引物、3mMMgCl₂、5μl RT反应和0.20μl Platinum Taq(Invitrogen Inc.)的25μl终体积中使用MJ-Cromos 4装置进行定量PCR。在80-84℃、40个循环期间测量荧光。也使用Trizol(Invitrogen Inc.)技术来制备向日葵RNA。使用公开可用的序列(www.arabidopsis.org)来设计每个基因特异的寡核苷酸。所设计的序列列举在表a中。

N.质外体蛋白质提取液和色谱法纯化

基本上如由Mauch和Staehelin所述的那样(1989)进行质外体蛋白质提取。植物叶片(7g)在正常条件下生长超过25天然后备选地在4℃驯化超过10天或在8℃放置3h如在图例中标明的并且处理如下。在驯化周期后，在真空下使它们在含有5mM EDTA、10mM抗坏血酸、10mMβ-巯基乙醇、1mM PMSF、2mM己酸和2mM苄脒的溶液中渗透20min。在渗透后，在纸上干燥所述叶片并将其放置在20ml注射器中。将其中装有干燥叶片的注射器放置在50ml管中并且以830g离心20min。在离心后，当其不被叶绿素污染时从所述管的底部回收质外体提取液。在此情况下(叶绿素污染)丢弃所述提取液。通过Bradford技术确定蛋白质浓度。之后，经由用50mM NH₄HCO₃平衡的Millipore Centricon Ultracel YM-10柱来浓缩所述提取液。经由之前用50mM NH₄HCO₃平衡好的SephadexG-200柱纯化每个样品的整分试样(每份1mg蛋白质)并且用相同缓冲液进行洗脱并且之后用分光光度计在280mn测定。

在根据Laemmli技术进行的12％SDS-PAGE中分析所述蛋白质并用考马斯亮蓝R-250(Sigma)使其显现。使用Amersham Biosciences LMW校准试剂盒作为分子量标记。此试剂盒显示以下条带：97、66、45、30、20和14.4kDa。

O.冰的再结晶

基本上如由Griffith所述的那样(2005)进行再结晶测定。向如上所述的获得自事先驯化的植物的质外体提取液(10μl)添加10μl 26％(w/w)的蔗糖。相当于不同基因型的每种混合物处理如下：-80℃3分钟、-20℃10分钟、-8℃15分钟、4℃30秒以及最终-8℃1小时。使用缓冲液(10μl)代替质外体提取液来进行对照。观察所述样品并且用NIKON光学显微镜拍照。

实施例1HAHB1表达模式

HAHB1 cDNA分离自向日葵茎文库(Chan和Gonzalez，1994)但是其功能未被表征。此cDNA编码365个氨基酸的蛋白质并且似乎是HD-Zip亚家族I的非偏离(non divergent)成员。为表征此基因的表达，从7日龄器官分离总RNA并且如在实验部分所述的通过qRT-PCR分析这些。图1a显示在此发育阶段TF主要表达在下胚轴和顶端分生组织中而在子叶和根中的表达较低但是可检测的。在21日龄植物中此表达模式改变(图1b)在叶柄和叶片中显示主要的表达而在根部、子叶、下胚轴和茎中显示较低的表达水平。

实施方案2HAHB1的表达由ABA、细胞因子和非生物性胁迫效应物上调

我们研究了在7和21日龄植物中一些植物激素在此基因表达中的作用。显示在图2a和2b中的结果表明在幼苗中BAP对HAHB1的表达显示较大的作用而ABA在更成熟的植物的叶片中展示主要作用。测试的其他植物激素(IAA、乙烯(ACC)、SA、JA和GA)抑制或轻微诱导或对此TF的表达根本不产生作用。向日葵幼苗(7日龄)或正生长的植物(21日龄)经历不同的非生物性胁迫处理以便研究此基因在对环境条件的响应中的作用。

干旱、盐度、由H₂O₂造成的氧化胁迫以及由蔗糖造成的渗透性胁迫在幼苗中都显示低诱导表达此基因。黄化植物展示的转录物水平比在正常生长条件下观察到的那些高两倍(图3a)。另一方面，低温(4℃)诱导超过五倍的HAHB1的表达，表明在此条件下对此基因显著的上调。时间进程显示在低温处理7小时后HAHB1的最大表达(图3b)。相反，在更成熟的植物(21日龄)中，展示不同的行为。

若干非生物性胁迫效应物诸如干旱、高浓度的NaCl、黑暗和低温诱导HAHB1基因的表达(图3c)。

合起来，结果表明在成熟的叶片中HAHB1受多种不同的非生物性胁迫条件的诱导。

实施例3获得异位表达HAHB1的拟南芥转基因植物

为确认HAHB1的功能，我们已经使用异位表达方法。HAHB1的编码区域被融合到花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)的35S启动子，并且使用所述构建体转化拟南芥植物。恢复若干纯合株系。选择被命名为35S:HAHB1-A、-B、-C、-D和-E的五个独立转基因株系用于更详细的分析。

图4a显示转基因植物和野生型植物之间叶片形态学的差异。在与其非转化对应物的比较中转化植物显示锯齿形边缘和差异的形状(图4a和4c)。关于发育速率，转基因植物在早期阶段显示延缓的茎延长但是在生命周期的末尾达到类似的高度(图4b)。当所述植物从营养阶段转入生殖阶段时观察到基因型之间的最大茎高差异。在基因型之间莲座叶和长角的数目以及种子的生产率未显示显著的差异。

实施例4表达HAHB1的转基因植物比其野生型对应物更耐受低温

考虑到一些HD-Zip蛋白质在非生物性胁迫响应中的已知作用，以及我们发现HAHB1的转录水平由低温上调，我们研究了当其在不同发育阶段经历寒冷或冷冻温度时具有构建体35S:HAHB1的转基因植物的行为。

为测试冷冻温度下的行为，将处于营养阶段的植物在-8℃放置7小时然后放置在正常条件的培养室中以允许它们恢复。图5显示获得的结果。与非转化植物的仅仅20％相比，57～85％(取决于株系)的表达HAHB1的转基因植物幸免于所述处理。严重胁迫影响所有基因型的叶片，但是转基因植物在几天的恢复后变得健康而WT植物则不。

如上面提到的，低温导致对光合作用和呼吸作用的抑制以及对蛋白质生物合成的抑制并导致蛋白质降解。碳水化合物运输也被抑制。作为共同的特性，所有这些作用共享膜功能性的损失。

为确定冷冻处理后的膜健康，我们使用允许定量所致损伤的离子渗漏技术(见实验程序)。释放到培养基中的电解质是严重膜损伤的指示物而周围溶液中的电导率提供对此损伤的定量测量。在离心后从所述管的底部回收质外体提取液除非它们被叶绿素污染。在这样的情况下(叶绿素污染)，丢弃所述提取液。如在上面的实验程序部分所述处理经历了不同时间范围的冷冻温度(-8℃)的植物，并且测量电导率。图5a显示在-8℃培育两小时后WT植物的膜稳定性比转基因植物的膜稳定性更低。这至少部分地解释了观察到的基因型之间在这些条件下存活的差异。

关于膜脂的组成，在经历了寒冷温度的植物中在基因型之间没有检测到不包含和饱和脂肪酸关系的差异(数据未示)，这表明观察到的耐冻性不是膜脂变化的结果。寒冷也引起对光合作用的抑制。在营养阶段和生殖阶段两者中，测量在经历了这些条件的植物中的叶绿素浓度。图6显示在两个阶段的转基因植物中叶绿素含量保持稳定而非转化植物逐渐失去此色素含量，这表明转基因植物更好地耐受不利温度。重要的是注意在延长的寒冷条件中拟南芥植物几乎停止其发育并且给相对死亡植物的幸存者计数来作为耐受的参数变得不可能。

实施例5表达HAHB1的转基因植物比其野生型对应物更耐受干旱和盐胁迫

当用上述的高盐浓度给向日葵植物浇水时HAHB1的转录物水平增加。为测试此基因在植物中是否参与对此不利条件的响应，我们用增加浓度的NaCl灌溉所述植物并观察它们的行为。

在这些条件下的膜稳定性是为测试植物行为而选择的参数之一。所获得的结果显示在图7a中。与转化的个体的膜电导率相比野生型基因型的膜电导率在所述处理期间显著增加，这表明膜稳定性因此减小。NaCl浓度越大，基因型之间的差异越显著。

在用400mM NaCl灌溉两天后的照片中可以观察到对植物的损害(图7b)。

同样地，在转化和非转化植物中也测试了干旱耐受(图8)。如在实验部分所述，所述处理是严格的。HAHB1转基因植物更好地耐受干旱条件并且此耐受与不同独立株系中HAHB1转基因的表达水平相关。

实施例6HAHB1启动子区域的分离和表征

使用之前通过PCR使用两个基于所述编码序列的寡核苷酸在基因组DNA上分离的cDNA的5′-内含子作为探针从BACs基因组文库分离相当于HAHB1的启动子区域的1060bp片段。在此启动子区域内通过PLACE识别出两个作为低温响应元件的箱。

克隆此片段以致其可操作地与GUS报告基因相连(即GUS基因的表达在HAHB1启动子的转录控制下)并且，在单独的构建体中，与HAHB1cDNA相连，如在上面的实验程序部分所述。使用两种构建体转化拟南芥植物并且一旦鉴定出各自的纯合株系，分析它们如在图9和10中所示，图9和图10表明GUS的表达模式由HAHB1启动子指导。如可见，在正常生长条件下GUS表达在拟南芥幼苗的维管***中以及在成年植物(25日龄和40日龄)的分生组织区域中。

实施例7具有构建体promHAHB1:HAHB1的植物的表型特性

制备、选择并在正常条件下种植并且观察具有构建体promHAHB1:HAHB1的转基因植物。与其野生型对应物相比没有检测到显著的外形、形态或颜色差异(即这些转基因植物在形态学上与野生型对应物不能区分)，见图(11a)。关于以茎高测量的生长曲线，在生命周期中，没有检测到显著的差异，这表明在其自身诱导型启动子的控制下，所述基因在植物发育的早期阶段不产生发育延迟，如对具有组成型35S:HAHB1构建体的植物观察到的(图11b)。

实施例8用构建体promHAHB1:HAHB1转化的植物更耐受冷冻条件

为测试在其自身启动子的控制下表达HAHB1的转基因植物是否比野生型植物更好的耐受冷冻条件，使所述植物经历之后的驯化：4℃下10天到-8℃下6小时然后4℃下2天然后在正常温度中以允许它们在6天的时间内恢复。转基因基因型幸存者的％从67至86％变化而在此测定中非转化植物的平均存活率是40％。每个基因型用16株植物来进行所述测定。图12显示在此类实验中获得的结果。

实施例9HAHB1通过诱导编码防冻蛋白质的基因给予转基因植物低温耐受

本文上面呈现的结果表明HAHB1给予对若干非生物性胁迫因子的耐受。为阐明在此响应中涉及的分子和生理机制，因为此基因编码转录因子并且它能够因此调节不同的转导信号通路，我们使用提取自两种基因型的RNA来进行比较转基因植物和野生型植物的转录组的微阵列分析。

对获得的数据的简单分析使得之前在表达HAHB1的转基因植物中与非生物性胁迫相关的若干基因的上调可见。在这些基因中，最相关的是涉及细胞壁合成、病原体响应基因(即PR编码基因)和β-1，3葡聚糖酶基因的那些。葡聚糖酶、几丁质酶和类甜蛋白(thaumatin-like protein)已经被描述为当植物经历低温时像防冻蛋白质那样发挥功能。冷冻温度导致增长的冰晶在细胞内和细胞外形成，并且晶体分别是造成植物机械损伤(内部晶体)和脱水(外部晶体)的原因，并且能够导致植物死亡。已经在几个界的生物中发现并且表征防冻蛋白质(AFP)，所述生物包括鱼、一些昆虫、陆地节肢动物、细菌、真菌和植物。它们已经被从植物的质外体区域纯化并且它们通过将自己定位于正在形成的冰晶上来发挥功能。通过此方式，冰晶采用不能够增长的双棱锥形。其中这些蛋白质行使防冻功能的第二种方式是通过防止再结晶(从小的晶体形成更大的晶体)。此外，Tomczak等人(2003)证明防冻蛋白质能够直接与膜相互作用，因此抑制渗漏。因此，并且不希望受限于机械的理由，在HAHB1转基因植物中观察到的增加的膜稳定性能够至少部分地由这些蛋白质的作用来解释。

因此，为了分析基因型之间的潜在差异我们分离了质外体蛋白质。我们没有在生长在正常条件(图13A)或在16小时(图13B)或10天(图12C)的驯化期间的转基因植物和野生型植物之间观察到很大的差异，但是在SDS-PAGE中我们能够鉴定出据我们所知之前还未被描述的拟南芥中被分泌到细胞质外体的至少五个条带(图13C)。给这些多肽测序并且它们中的三个分别与PR2、PR5和一个未知蛋白质的序列匹配。不幸的是，另外两个没有产生清晰的序列并且它们在转基因植物中的浓度显得比在野生型个体中的浓度更低。我们可以推定这些未鉴定的条带可能是冰成核蛋白质，所述冰成核蛋白质的表达在HAHB1转基因植物中受到抑制。惊人地，当植物，转基因和野生型两者，经历-8℃的冷冻条件时，基因型之间观察到的蛋白质模式明显不同。具有35S:HAHB1构建体的转基因植物展示更高的质外体蛋白质浓度(在WT提取液中是25μg蛋白质/g组织相比在转基因植物中是50μg蛋白质/g组织)以及具有23kDa近似分子量的另外的条带，这表明与它们非转化的对应物相比在面对不利条件时更快的响应(图13D)。这种更快的响应能够至少部分地是造成此基因型中观察到的耐受的原因。

因为已知能够在230nm在洗出液中测量冬黑麦质外体中的防冻活性(Griffith等人，1992；DeVries等人，1986)，所以用分光光度计在230和280nm测量色谱洗出液。如从图14可知，相应于转基因基因型的谱图(profile)不同于野生型基因型的谱图。

根据Griffith和Yaish(2004)，低温和干旱引发取决于乙烯的转导信号通路，导致具有防冻活性的蛋白质的表达，而，如果诱导不是通过暴露于低温或干旱而是由SA、ABA或嗜冷病原体如雪霉(snow mold)产生的，则诱导的信号转导通路导致具有抗病原体活性的蛋白质的表达。考虑文献中的这些报道，与非转化植物相比，我们分析了在用SA、ABA、干旱、低温或乙烯处理或不处理的具有构建体promHAHB1:HAHB1的转基因植物中编码推定的来源于PR家族的防冻蛋白质的三个基因的转录物水平。

图15图示此实验，其中在不同胁迫或非胁迫条件下定量编码拟南芥PR4(At3g04720)、几丁质酶(PR3，At3g12500)和PR2的基因的转录物水平。如从图中可知，在对照条件下在转基因植物中表达的PR4比在野生型植物中多4～15倍。在暴露于干旱、低温或ACC后，这些水平在所有的基因型中增加，而当用SA或ABA处理所述植物时，基础水平轻微减小(图15)。

PR3，也被称为几丁质酶-B，在转基因基因型中比在对照中表达的更高的多，并且它显著地受到SA存在的诱导。当应用ABA时，与对照条件相比没有观察到变化，而其他处理(干旱、ACC和4℃)造成此基因转录物水平的降低。另一方面，在正常条件下与野生型植物相比PR2在转基因植物中没有被诱导，但是在存在ABA或SA或在低温中时其被诱导，而用ACC处理或暴露于干旱则使其受到抑制。合起来，这些结果能够表明此基因可能具有在耐低温性和对病原体的响应中的双重功能。

实施例10存在于表达HAHB1的转基因植物中的质外体防冻蛋白质是造成观察到的耐冻性的原因

在拟南芥或向日葵中的防冻机制没有被很好的研究。考虑到本文获得的结果，其表明一些推定的防冻蛋白质的转录物水平在表达HAHB1的转基因植物中增加以及与未驯化植物相比在驯化植物中的质外体蛋白质模式是不同的，我们研究了这些蛋白质在转基因植物和野生型植物中的防冻活性。遵从在实验部分中所述的技术用质外体蛋白质进行再结晶测定。如从图16可知，转基因驯化植物质外体蛋白质抑制小冰晶排列为更大冰晶而野生型提取液不显示此抑制作用。在所述转基因株系中，在获得此功能方面株系A似乎最有效。

另一方面，选择在微阵列中鉴定为呈现推定的防冻活性的一些基因以便获得转基因植物并且随后在冷冻条件下评估它们的行为。分析所选的这些基因中编码PR2和β-1，3-葡聚糖酶的两个。通过PCR用特异的寡核苷酸使用拟南芥基因组DNA分离所述基因。将它们克隆到pBI 121.3中并用于转化拟南芥。在通过PCR验证后通过卡那霉素抗性和所述基因的***来选择转基因植物。在正常生长条件下以及当所述植物经历冷冻时分析五个独立F2株系(非纯合)。图17和18显示既不表达PR2又不表达葡聚糖酶的植物在正常生长条件下展示差别的表现型，而两个基因似乎给予转基因植物耐冻性。然而，当表达葡聚糖酶的植物在严重冷冻条件下展示50％的存活率(与WT植物仅仅8％的存活相比；图17)时，PR2植物显示较低的程度(17％对8％，图18)，这表明很可能虽然两个基因在由HAHB1给予的耐冻性中都起作用但是不是以同样的比例。除了用杂合株系进行的实验以外，我们还用纯合株系进行了实验。

为确证陈述为以下的假说，即诱导的类PR蛋白质是造成由表达HAHB1的植物呈现的防冻活性的原因，我们获得独立表达这些基因中的每个的转基因植物。通过PCR用特异的寡核苷酸使用拟南芥基因组DNA分离所选择的三个编码PR2、PR4和β-1，3-葡聚糖酶的基因并且将其克隆到pBI 121.3中。使用所述构建体转化拟南芥并且通过PCR确认所述基因的正确***。在正常生长条件下以及当所述植物经历冷冻温度时分析五个独立纯合株系。我们显示既不表达PR2又不表达GLUC又不表达PR4的植物在正常生长条件下展示差别的表现型，但是在冷冻条件中所有这些基因似乎给予转基因植物耐冻性。然而，当表达GLUC的植物在严重冷冻条件下展示62％的存活率(与WT植物仅仅14％的存活相比)时，PR2植物显示较低的程度(42％对14％)，这表明很可能虽然两个基因都参与由HAHB1给予的耐冻性但是不是以同样的比例(见图32)。所述转基因植物还显示增加的干旱抗性(见图31至32)。相比在对照中，以经处理的提取液的电导率测量的膜稳定性在转基因基因型中更高，因此表明此生理机制至少部分地是造成给予的耐受的原因。

实施例11拟南芥和向日葵展示保守的机制

考虑到所述微阵列数据和由HAHB1给予的耐冻性两者，我们想知道与在冬黑麦的情况中所描述的涉及AFP的那些类似的事件是否发生在这些植物中。为了回答这个问题我们从驯化的和非驯化的向日葵植物分离了质外体蛋白质并用SDS-PAGE分析它们。图19显示作为驯化天数函数的所述蛋白质模式的时程。如可见，在正常条件(驯化实验的0时刻)下一些条带出现在向日葵质外体中。这是惊人的结果因为在拟南芥中在同样的条件下没有检测到蛋白质。在所述驯化过程期间，新的蛋白质条带出现而原有的一些蛋白质减少或消失。我们没有确认每个条带对应于哪个蛋白，并且由于还未获得向日葵基因组序列所以这不是容易的。然而，所述实验表明诱导AFP和抑制冰成核蛋白质的机制正在发生。

另一方面，使用已知的EST和基因序列，我们已经能够鉴定一些由HAHB1诱导的可以是与在拟南芥微阵列中鉴定出的那些同源的序列。根据此鉴定我们设计了特异的寡核苷酸以便在瞬时转化的向日葵叶片中量化这些基因(见实验部分)。分析编码一个推定的几丁质酶(登录号TC18434)、两个与来自拟南芥的ZATlO和SAG21同源的推定的转录因子(所述向日葵基因的登录号分别是TC16546和TC19654)和一个类DREB(登录号TC23839)转录因子的四个基因。相比在对照中，所有这些基因在过表达HAHB1的向日葵盘中展示更高的转录物水平。因为所述拟南芥同源基因在转基因植物中也被诱导，所以此结果表明在两个物种中存在由HD-Zip转录因子HAHB1控制的保守的作用机制。

实施例12亚家族HD-Zip I的成员的蛋白质结构域的功能

我们使用标准技术和算法分析了HD-Zip I家族成员的C端和N端结构并且找到共有序列基序。

例如，我们分析了N端的序列标志以在HD-Zip和LZ结构域中找到共有序列。用于比对的拟南芥序列的标识号是：AT5G53980.1、AT3G01470.1、AT4G40060.1、AT2G22430.1、AT5G65310.1、AT1G69780.1、AT1G26960.1、AT5G15150.1、AT3G01220.1、AT4G36740.1、AT2G18550.1、AT5G66700.1、AT5G03790.1、AT3G61890.1、AT2G46680.1。因此鉴定共有序列。

我们还使用标准技术和生物信息学分析了C端序列以找到共有序列。用于产生序列标志的蛋白质的标识号是：BAA05625.1、BAA05623.1、XP_002276889.1、CAN62385.1、CAO48425.1、EEF42166.1、XP_002311597.1、XP_002315797.1、AAT40488.1、AAT40518.2、AF011556_l、ABL63116.1、AAD14502.1(全部来自之前的基因标识号)、HAHB-1(来自向日葵)和ATHB13、ATHB23(来自拟南芥)。

使用对属于不同物种的这15个蛋白质(与HAHB1的C端最同源的)以及HAHB1的C端进行的比对以获得2个最保守区域的2个共有序列，一个位于开头(N端)，而另一个位于C端。在整个羧基端区域中，有两个保守结构域，一个位于所述区域的5′而另一个位于所述区域的3′。这两个基序之间的氨基酸是不保守的。

我们还构建了将一个蛋白质的HD-Zip结构域与另一个的羧基端结构域融合的嵌合蛋白质。我们制备的所述构建体示意性地显示在图22中。我们用这些构建体转化拟南芥植物，获得纯合株系并分析表现型，尤其是关于由wt蛋白质和HAHB1给予的特性，例如，与HAHB4的已知特性和作用相比(见Dezar等人，2005a和b，Manavella等人2006，Manavella等人2008a、b和c。Cabello等人2007；以及WO2004/099365)。

用构建体H4CI(包含HAHB4的HD-Zip和HAHB1的CI)转化的植物展示由HAHB4给予的叶片和花序形态学表现型(紧密的)，而用H4CICII(包含HAHB4的HD-Zip和HAHB1的整个羧基端)转化的植物展示由HAHB1给予的叶片形态学表现型(锯齿形叶片以及相等的莲座叶数目)。

关于在黄化幼苗中的乙烯敏感度，H1WCT(缺少其整个羧基端的HAHB1)植物和H1C1(缺少CII的HAHB1)植物的表现与HAHB4植物一样(它们不呈现三重响应，Manavella等人，2006)。成年植物中的乙烯敏感度测定显示H4CII(包含HAHB4的HD-Zip和HAHB1的CII)植物和HAHB4植物的表现相似(低衰老诱导)而HAHB1、WT和H4-H1(H4CICII)快速进入衰老阶段(见图33)。

HAHB1转化体，与拟南芥ATHB13转化体一样，当在4％蔗糖中生长时显示圆形的子叶。在此种测定中H4CI、HAHB4和WT不改变它们的形态学而H4-H1(H4CICII)和HAHB1展示所述的表现型。

用H4-H1(H4CICII)转化的植物展示与HAHB1植物同样的形态学。HAHB4和HAHB1两者显得比WT更耐受干旱。HAHB4植物比HAHB1转基因更具耐受性。

在寒冷测定中，使用HAHB4植物(不耐受的)作为内部对照，H4CI基因型的表现似乎与HAHB1基因型一样(耐受的)。

这些结果确认所述羧基端要为由HAHB1执行的与由属于相同亚家族的HAHB4诱导的那些相比不同的功能负责。

实施例14在拟南芥中过表达ATHB13

通过RT-PCR使用分离自21日龄植物的RNA来扩增所述cDNA。使用两个特别设计的寡核苷酸来进行PCR并且将其克隆到事先用BamH1和XbaI限制酶切的pBI 121.3载体中。一旦鉴定出阳性克隆，用所述构建体转化土壤杆菌细胞并且通过植物浸渍法使用这些土壤杆菌转化植物。通过卡那霉素抗性和之后用两个寡核苷酸验证的所述基因的***来选择转基因植物，一个与35S匹配(以区别来自内源基因的***)而一个与cDNA匹配。一旦鉴定出纯合株系，使转基因植物经历与HAHB1植物同样的处理，并使用适当的对照。

实施例15用35S:HAHB1转化的向日葵、大豆和烟草叶盘过表达推定与低温响应相关的基因

考虑到所述微阵列数据和由HAHB1给予的耐冻性两者，我们想知道与在冬黑麦的情况中所描述的涉及AFP的那些类似的事件是否发生在其他植物物种中。为了回答这个问题，使用已知的EST和基因序列，我们已经能够在向日葵、烟草和大豆中鉴定一些与在如由HAHB1诱导的拟南芥微阵列中鉴定的那些同源的序列。根据此鉴定我们设计了特异的寡核苷酸以便在用35S:HAHB1和35S:ATHB13两者瞬时转化的向日葵、烟草和大豆的叶片中量化这些基因。如对向日葵组织描述的那样进行向日葵、大豆和烟草叶盘的瞬时转化(Manavella和Chan，2009)。对于每个构建体，分析来源于不同植物的六个盘并且重复所述实验至少两次。作为渗透测试的对照，通过组织化学测定来测量GUS报告基因在这些实验中的表达。

在向日葵中，分析编码一个推定的几丁质酶(登录号TC18434)、两个与拟南芥ZAT10和SAG21同源的推定的转录因子(所述向日葵基因的登录号分别是TC16546和TC19654)以及一个类DREB(登录号TC23839)转录因子的四个基因。

在瞬时转化的大豆的叶盘中量化与拟南芥葡聚糖酶、PR2和PR4同源的三个基因的表达。当用35S:HAHB1或35:ATHB13进行转化时它们都显示它们水平的显著增加；然而当使用所述第二个构建体时PR2水平增加的程度较小。在烟草叶盘中进行的所述实验显示类似的结果除在所述转化的盘中诱导较低外。

因为所述拟南芥同源基因在转基因植物中也被诱导，所以此结果表明在这些物种中存在由HD-Zip转录因子、HAHB1和其同系物控制的保守的作用机制。

由HAHB1/ATHB13调停的所述防冻机制似乎在其他植物物种如烟草和大豆之间是保守的。瞬时转化来自这些植物的叶片诱导HAHB1目标同系物的表达，这表明在这些物种中的同系物基因执行同样类型的调节，并且很可能给予相似的耐受表现型。

实施例16在拟南芥中表达HAHB1给予增加的对假单胞菌侵染的耐受用假单胞菌侵染

将丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae spp.)分离的克隆接种到补充有利福平的LB培养基中并且28℃培养过夜。5min、4500rpm离心所述培养物(2ml)并且用无菌水漂洗所述细胞沉淀三次并最终悬浮在(1/50)10mM MgCl₂、15μl/l Triton X-100中。将稀释的细菌悬液喷涂在如在图例中标明的来自不同基因型的4周龄拟南芥植物上。用尼龙覆盖所述托盘并且在侵染2天后给所述植物拍照。

基本上如由Kato等人(2007)描述的那样进行伊文思蓝染色。用0.1％伊文思蓝真空渗透切下的叶两次5min。之后应用真空用蒸馏水将所述叶片漂洗三次(每次10min)直到它们完全脱色然后在显微镜上观察并拍照。

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E.，Mattsson J.，Svenson M.，Borkird C，Engstrδm P.1994.Expression patterns of novel genes encoding homeodomain leucine-zipperproteins in Arabidopsis thaliana(拟南芥中编码同源异型结构域亮氨酸拉链蛋白质的新基因的表达模式).Plant MoI Biol.(植物分子生物学)26：145-154.

Sukumaran N.P.，Weiser CJ.1972.Freezing Injury in Potato Leaves(马铃薯叶片中的冷冻损伤)，Plant Physiol(植物生理学).50：564-567

Thomashow M.E.1999.Plant cold acclimation：freezing tolerance genes andregulatory mechanisms(植物低温驯化：耐冻性基因和调节机制).Annu.Rev.Plant Biol.(植物生物学年鉴)，50：571-599.

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序列表信息

序列表信息

HAHB1启动子-SEQ ID.1

gtcgagctcgtctcgtaaaatgttcgagtcagctccaattaaatcatgtcggcttgttatattttttttaatttatttttgatattttttacatatatttataacataaaaaacaaaataaaaataaaaattacacatatatctatatgtattatttttctaaaattttaaatagcgaaagacatattaaaagtattatatgtataattttgtttagcttcccatatttttatatgttattaattaattaaacttaaaatgttaacactttaacacctcttacatactttttagttcaatacatttaaaattaaaattaatctatatgcaataaaataattcaagcaggcttgcaagctcacgagtcgagccatgcctggctcgagctcgactcatttacaaatcgagccaccaagccgactcgtttataaccgagttttttttagccgagtttttttcaagcgaacttcaaacaagtcacgcgcttttaattaacacattctagtctaaagaagataattgaaagagaaagtagatataagtaaaaggagtagccaaagatataaatttagggtctaaacaacctaatattgtttaattttttttaaataaactagtttttttttaccgattatctgtgttatatgtcttagtttgacatgataagttatcataattacttgtagtatttttatatcagaaatatacgttggagaattaaattttatcctgatcgtcaattgacaagaacaaaaatcaacatctcatggttttttactaatttatatgattaaagatatatggttgtaagaaaaagaacaatgtacatcaaatggtgaaatttgaatatttgatagtaacgtaatccattgtgtatttcttattattttatcattttcccaaggtgtgtcatatatagtgtctccattctttctatagcacaatatccttcacctccctctctctctctctctctctaaaaatgatgatgagacgacaaagatcgaattc

HAHB1 mRNA-SEQ.ID.2

uugaaauucugagaaaagccacauaaucaaagcuaaagaggugguuuaaacagcugAUGACUUGCACUGGAAUGGCUUUCUUCUCCUCCAAUUUCAUGUUACAAUCCUCCCAAGAAGAUGACCAUCAUGCCCCUACAUCUCUCUCUCCAAUCCUCCCACCUUGCAGUACCACCACUCAAGAUUUCAGUGG

CUGCUUUCUUGGGAAAAAGAUCUAUGUCUUCUUACUCAGGUUUGAACAACAACAACAUGGAUGGAUGUGAUCAAGAAGGGAACAUGAAUGGAGAAGAUGAGUUAUCAGAUGAUGGAUCACAGCUUCUUGCAGGAGAGAAAAAGAGGAGAUUAAACAUGGAACAAGUGAAGACACUUGAGAGAAACUUUGAGUUAGGAAAUAAGCUUGAACCUGAGAGGAAAAUGCAACUUGCAAGAGCACUUGGACUACAACCAAGACAGAUUGCUAUAUGGUUUCAAAACAGAAGAGCUAGAUGGAAAACUAAACAGUUGGAAAAAGACUAUGAUGCCCUCAAGAGACAGUUUGAAGCUGUUAAAGCUGAGAAUGAUUCACUCCAAUCUCAAAAUCAUAAACUUCAUGCU

GAUAAUGGCACUAAAAAAUAGGGAGCCAGCAGAACUAAUCAACCUCAACAUAAAAGAAACAGAAGGAUCUUGCAGCAACCGAAGCGAAAACAGCUCUGAAAUCAAACUAGACAUCUCAAGAACACCGGCUACCGAUAGCCCUUUAUCAUCACACCAUCAACACCAACACCAGCCAAUACCUAAUCUUUUUCCAUCGUCGAAUAUCGAUAGGCCUAAUUCGAAUAACAUUGUGGCGCAUCAACUUUUCCACAAUUCGUCAUCAAGGCCGGCAGAUCAUCAACUUCAUUGCCACAAACUCGAUCAAUCGAAUGCCAUUAAAGAAGAAUGUUUUAGCACAAUGUUUGUUGGUAUGGAUGAUCAAUCAGGGUUUUGGCCAUGGUUGGAACAACCACAAUUCAAUUGAuggaaucaagaagcaaaaaagcaaaagaaaacgguacccgauucgccuucuuggcuuugguuugauuauauuaaagauggagaucaucaaucuguuuguucucuaagcuuuaaauucuuguuuuuugguacuuaaauuaauagaguaaaaauuagaagaaaaaacguauuauuauuuuaaauucaagauuaguguuu

编码序列：大写字母

5′和3′非翻译区：小写字母

来自第一和第二内含子的旁侧核苷酸：下划线和粗体

内含子1-SEQ ID.3

aattaactcaccttaactaagttacttatgacaacatctctctcatagatcttgatgcagcttgcattcatgagttgtgatgtacaactcattcatgcattagggtttcagttttttcaaagttttttttttattttttcttctgtttcaagatcatgatgatgagttgtgctgaacacttgaacagctcattgatgcattagggtttgttttagtttcaagttctttcttttctttcattttcatgcactaaatccatatgggcttgaagaaagtttgaatctttatatgttagttgatgatcttgatgcaggt

内含子2-SEQ ID.4

gtaatattagtttgattgtttattgcatctatcaatcattagattctactctttacttgatcacacagaaagtaactaaaccttttttcctaatgataacaatatttgttttgcaaatctaatggcaatcaaataaaagtttctggtaagcagccatgatctatttatttttcactatttgagtaagtttaaaagttgcatttatcctcactaattatatacaacactaaaataatcattaaactgactgttataattactttccgtaaacggtatgccaaaacttaaaatgattaacaattttataagaatggaaagtaaaatcattacactatttcccatattagtcatgaccaaagtttgtttctttctgaagggcaaaagggtcaatatgcttatatgcagcatgggcaaaagaagtagagtgtatatcaaaattcatatctttattttcttttcaaagtttaggtaacaaaaagaagaaattataaacgagtttgttacaattccacaagtacatgaagaaacaaaatttgttagtatttttattttccatgtttttagtaacttccatatcaatttagcactagaagataactttttttaggactcggtaaaccatacaagtagggtcatactttatcgtttatccattaatgtatatccataaattcactgattatgcggtatttcctttgttacactgtcttgaacaagtattagtacatgtagtttcttaaagattgtttaatcaaccaaaaagattgaaactttgcag

HAHB1蛋白质-SEQ ID.5

MTCTGMAFFSSNFMLQSSQEDDHHAPTSLSPILPPCSTTTQDFSGAAFLGKRSMSSYSGLNNNNMDGCDQEGNMNGEDELSDDGSQLLAGEKKRRLNMEQVKTLERNFELGNKLEPERKMQLARALGLQPRQIAIWFQNRRARWKTKQLEKDYDALKRQFEAVKAENDSLQSQNHKLHAEIMALKNREPAELINLNIKETEGSCSNRSENSSEIKLDISRTPATDSPLSSHHQHQHQPIPNLFPSSNIDRPNSNNIVAHQLFHNSSSRPADHQLHCHKLDQSNAIKEECFSTMFVGMDDQSGFWPWLEQPQFN

HAHB1 cDNA-SEQ ID.6

ttgaaattctgagaaaagccacataatcaaagctaaagaggtggtttaaacagctgATGACTTGCACTGGAATGGCTTTCTTCTCCTCCAATTTCATGTTACAATCCTCCCAAGAAGATGACCATCATGCCCCTACATCTCTCTCTCCAATCCTCCCACCTTGCAQTACCACCACTCAAGATTTCAGTGG

CTGCTTTCTTGGGAAAAAGATCTATGTCTTCTTACTCAGGTTTGAACAACAACAACATQGATGGATGTGATCAAGAAGGGAACATGAATQGAGAAGATGAGTTATCAGATGATGGATCACAGCTTCTTGCAGGAGAGAAAAAGAGGAGATTAAACATGGAACAAGTGAAGACACTTGAGAGAAACTTTGAGTTAGGAAATAAGCTTGAACCTGAGAGGAAAATGCAACTTGCAAGAGCACTTGGACTACAACCAAGACAGATTGCTATATGGTTTCAAAACAGAAGAGCTAGATGGAAAACTAAACAGTTGGAAAAAGACTATGATGCCCTCAAGAGACAGTTTGAAGCTGTTAAAGCTGAGAATGATTCACTCCAATCTCAAAATCATAAACTTCATGCT

GATAATGGCACTAAAAAATAGGGAGCCAGCAGAACTAATCAACCTCAACATAAAAGAAACAGAAGGATCTTGCAGCAACCGAAGCGAAAACAGCTCTGAAATCAAACTAGACATCTCAGAACACCGGCTACCGATAGCCCTTTATCATCACACCATCAACACCAACACCAGCCAATACCTAATCTTTTTCCATCGTCGAATATCGATAGGCCTAATTCGAATAACATTGTGGCGCATCAACTTTTCCACAATTCGTCATCAAGGCCGGCAGATCATCAACTTCATTGCCACAAACTCGATCAATCGAATGCCATTAAAGAAGAATGTTTTAGCACAATGTTTGTTGGTATGGATGATCAATCAGGGTTTTGGCCATGGTTGGAACAACCACAATTCAATTGAtggaatcaagaagcaaaaaagcaaaagaaaacggtacccgatcgcctcttggcggtttgattatattaaagaggagatcacaatctgtttgtctcaagctttaaattctgtttttggtacttaaattaatagagtaaaaattagaagaaaaaacgtattattattttaaattcaagattagtgttt

编码序列：大写字母

5′和3′非翻译区：小写字母

来自第一和第二内含子的旁侧核苷酸：下划线和粗体

HAHB1基因序列-SEQ ID.7

gtcgagctcgtctcgtaaaatgttcgagtcagctccaattaaatcatgtcggcttgttatattttttttaatttatttttgatattttttacatatatttataacataaaaaacaaaataaaaataaaaattacacatatatctatatgtattatttttctaaaattttaaatagcgaaagacatattaaaagtattatatgtataattttgtttagcttcccatatttttatatgttattaattaattaaacttaaaatgttaacactttaacacctcttacatactttttagttcaatacatttaaaattaaaattaatctatatgcaataaaataattcaagcaggcttgcaagctcacgagtcgagccatgcctggctcgagctcgactcatttacaaatcgagccaccaagccgactcgtttataaccgagttttttttagccgagtttttttcaagcgaacttcaaacaagtcacgcgcttttaattaacacattctagtctaaagaagataattgaaagagaaagtagatataagtaaaaggagtagccaaagatataaatttagggtctaaacaacctaatattgtttaattttttttaaataaactagtttttttttaccgattatctgtgttatatgtcttagtttgacatgataagttatcataattacttgtagtatttttatatcagaaatatacgttggagaattaaattttatcctgatcgtcaattgacaagaacaaaaatcaacatctcatggttttttactaatttatatgattaaagatatatggttgtaagaaaaagaacaatgtacatcaaatggtgaaatttgaatatttgatagtaacgtaatccattgtgtatttcttattattttatcattttcccaaggtgtgtcatatatagtgtctccattctttctatagcacaatatccttcacctccctctctctctctctctctctaaaaatgatgatgagacgacaaagatcgaattcttgaaattctgagaaaagccacataatcaaagctaaagaggtggtttaaac agctgATGACTTGCACTGGAATGGCTTTCTTCTCCTCCAATTTCATGTTACAATCCTCCCAAGAAGATGACCATCATGCCCCTACATCTCTCTCTCCAATCCTCCCACCTTGCAGTACCACCACTCAAGATTTCAGTGGT

GCTGCTTTCTTGGGAAAAAGATCTATGTCTTCTTACTCAGGTTTGAACAACAACAACATGGATGGATGTGATCAAGAAGGGAACATGAATGGAGAAGATGAGTTATCAGATGATGGATCACAGCTTCTTGCAGGAGAGAAAAAGAGGGAGATTAAACATGGAACAAGTGAAGACACTTGAGAGAAACTTTGAGTTAGGAAATAAGCTTGAACCTGAGAGGAAAATGCAACTTGCAAGAGCACTTGGACTACAACCAAGACAGATTGCTATATGGTTTCAAAACAGAAGAGCTAGATGGAAAACTAAACAGTTGGAAAAAGACTATGATGCCCTCAAGAGACAGTTTGAAGCTGTTAAAGCTGAGAATGATTCACTCCAATCTCAAAATCATAAACTTCATGCTG

AGATAATGGCACTAAAAAATAGGGAGCCAGCAGAACTAATCAACCTCAACATAAAAGAAACAGAAGGATCTTGCAGCAACCGAAGCGAAAACAGCTCTGAAATCAAACTAGACATCTCAAGAACACCGGCTACCGATAGCCCTTTATCATCACACCATCAACACCAACACCAGCCAATACCTAATCTTTTTCCATCGTCGAATATCGATAGGCCTAATTCGAATAACATTGTGGCGCATCAACTTTTCCACAATTCGTCATCAAGGCCGGCAGATCATCAACTTCATTGCCACAAACTCGATCAATCGAATGCCATTAAAGAAGAATGTTTTAGCACAATGTTTGTTGGTATGGATGATCAATCAGGGTTTTGGCCATGGTTGGAACAACCACAATTCAATTGAtggaatcaagaagcaaaaaagcaaa agaaaacggtacccgattcgccttcttggctttggtttgattatattaaagatggagat catcaatctgtttgttctctaagctttaaattcttgttttttggtacttaaattaatag agtaaaaattagaagaaaaaacgtattattattttaaattcaagattagtgttt

编码序列：大写字母

启动子区域：小写字母

5′和3′非翻译区：下划线的小写字母

第一和第二内含子：粗体小写字母

HAHB1的C端SEQ ID NO.8

LINLNIKETEGSCSNRSENSSEIKLDISRTPATDSPLSSHHQHQHQPIPNLFPSSNIDRPNSNNIVAHQLFHNSSSRPADHQLHCHKLDQSNAIKEECFSTMFVGMDDQSGFWPWLEQPQFN

HAHB1C端基序I(CI)SEQ ID NO.9

LINLNIKETEGSCSNRSENSSEIKLDISRTPATDS

HAHB1C端基序II(CII)SEQ ID NO.10

IKEECFSTMFVGMDDQSGFWPWLEQPQFN

与亮氨酸拉链相邻的保守区域的共有序列(CI，34个氨基酸)SEQ ID NO.11

SINLNKETEGSCSNRSENSSDIKLDISRTPAIDS

定位于C末端的第二保守区域的共有序列(CII，29个氨基酸)SEQ ID NO.12

VKEESLSNMFCGIDDQSGFWPWLEQQHFN

HAHB1的N端SEQ ID NO.13

MTCTGMAFFSSNFMLQSSQEDDHHAPTSLSPILPPCSTTTQDFSGAAFLGKRSMSSYSGLNNNNMDGCDQEGNMNGEDELSDDGSQLLAGE

N端同源异型结构域共有序列SEQ ID NO.14

KKRRLTDEQVKALEKSFELENKLEPERKVQLARELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQ

用于微阵列确认

SEQ ID NO.64：ATHB13

ACCAGAAGTGGATAGTCAGGCCGATACATTTCACATCTCTCTCTCTTTTGTTTTTCCTCTTCTTCTTTTTTTCCATTTGATTTCAAACTCTCACACAAAGAGCTTCAGATTTATAAGACCATGATAATGGCTTTAAGACAAAGATTGGCAAGAAGAAAAAACTAAAGAGAAACGACCAAAATCTCAAGCAAACAGTACTAACTTCTGTTGCAAAACAGAAGAAGATGTCTTGTAATAATGGAATGTCTTTTTTCCCTTCAAATTTCATGATCCAAACCTCTTACGAAGATGATCATCCTCATCAATCTCCATCTCTTGCTCCTCTTCTTCCTTCTTGCTCTCTACCTCAAGATCTCCATGGTATATATACATAAACTTCCACACACATCTCCTCTGTTTTCTCTCTATCTCTTTCTAATGCTCTGTTCTGTTCTGTTTCAGGATTTGCTTCGTTTCTAGGTAAGAGATCTCCAATGGAAGGGTGTTGTGATTTAGAAACAGGGAACAATATGAATGGAGAAGAGGATTATTCAGATGATGGGTCACAAATGGGAGAGAAGAAGAGGAGATTGAACATGGAACAAGTGAAGACACTAGAGAAGAACTTTGAGCTTGGAAACAAACTTGAACCAGAGAGGAAAATGCAGCTAGCTCGTGCCTTAGGTTTGCAACCAAGACAGATCGCGATTTGGTTTCAAAATCGAAGAGCTCGTTGGAAAACAAAGCAGCTAGAGAAAGATTATGATACTCTTAAACGACAGTTTGATACACTTAAAGCTGAAAATGATCTTCTTCAAACTCATAATCAGAAACTCCAAGCTGAGGTAATTAATCTCATAAATTAACAAAAAAAATCAATAGTGTTATTTTTTTTTGGGTTAATGATCAATAATTACAGTTATTTTCCATCTAAAGGATGATTTTTTTCTTTTTAAAAAAGGTTAAAAATTATATTTCTGGTTTATAATTATTTGGATCAGGAGTTGCTTTCAGGTAGGGTTAAAAAACTGGACATGATTCATGACTTTTCAGACATCATTATCTCTTTTTTTCTTCACTCTTGTCTGGAAAGAGATCTGAAAACAATAGTTTCTTTATGCTTATCACATTGTACAGTAACTCTGTTTATGTTTAAAATTTTGTCTTTAATTACGCAGATAATGGGATTAAAAAACAGAGAACAAACAGAATCAATAAATCTAAACAAAGAAACTGAAGGATCTTGCAGTAACAGAAGTGATAACAGTTCAGATAATCTCAGACTAGATATCTCAACTGCGCCGCCATCAAACGACAGTACATTAACCGGTGGCCACCCACCGCCACCACAGACAGTTGGTCGACACTTCTTCCCACCGTCGCCAGCCACCGCAACGACAACTACTACAACAATGCAGTTCTTTCAAAACTCATCTTCAGGACAGAGTATGGTTAAAGAAGAGAATAGTATCAGTAACATGTTCTGTGCAATGGATGACCATTCTGGTTTTTGGCCATGGCTTGATCAGCAACAGTACAATTGAAATTGGTCTCCTGTTTTTTTTGTTTTTGTTTTTAAAAAAATTTATATTTTTTTTTTTTGTATTTGGAATTTTGATCAGAAGAACCCATGCATGTTTTCAAAAACTGGAATCTATATCATTAGCTCACTTTGAAATCTGCAACCAAACACCACTGAGGTTTTTTGTTTACTTTTTGAGTAAATGAGATGTAAAAAAATGGGTAATATCCATTATATTATATAAAAAATAATATCATTATGGCCCAACATTTTTCTGTATGGAGAAAAATAAAATAAATTGTATATT

此序列对应于如在TAIR数据库(www.Arabidopsis.org)中定义的未成熟mRNA(包括内含子和未翻译的3’和5’)。

SEQ ID NO.65葡聚糖酶

ctactaaaaaaattgtaagtacatacatatcaatgttaatttgtatataaggagctaag aacaaacccaattaggcaactagcaattgctaaaacacgtaagatctcaaat

accacgttattcctccttattgctctattcatcacaaccatcctcaacccaacaagt

ggagaatcagtaggtgtatgctatggaatgatggggaacaaccttccttctcaatcagacacaatcgctctctttagacaaaacaacatccgacgtgttagactctacgatccaaaccaagccgctttaaacgctcttagaaacacgggtatcgaagtcatcatcggcgttccaaacaccgatcttcgttcactcactaacccttcttccgctagatcatggctccaaaacaacgtcctcaactattaccccgccgttagcttcaagtacatcgccgtaggtaacgaagtatctccgtcgaacggcggtgatgttgtgctccctgccatgcgtaacgtttacgatgctctaagaggtgcaaatcttcaagatcgtattaaagtttctaccgccattgatatgactttgattggaaactctttccctccttcctccggagagtttcgtggtgacgttagatggtatatcgatcccgtcatcgggt

ttcttacgagtacgaactcagcgttactagccaacatctatccttacttcagctacgttgacaatccacgtgacatatctctctcttacgctctcttcacttctccttccgtcgtcgtatgggacggctctcgtggctaccaaaacctctttgacgctttacttgacgttgtttactctgccgttgaacgctcaggcggtggatctctcccagtggttgtttccgagagcggatggccttctaacggtggaaacgccgcgagtttcgataacgcgcgaagctttttacacgaatcttgcgtcgcgtgtgagagagaacagaggaacaccgaagagacctggaagaggagtggaaacgtatttgttcgctatgtttgatgagaatcaaaagagtcctgagatcgagaagaattttggtttgttttttcctaataaacaaccaaaatttccgatcacattctctgccgcgagagacg gtacggcggttgagtgatgattttatatgctgagatttatgtgaataattgggagattatcccataaaaggttccaaataaagacaaatttcaaataaaacctgttagtccaagttaaattaaatactcggctttgttttggtccacgttagacttggtaaagtcatgcaatatttttatttgatat

ATG标记为粗体的大写字母

内含子是粗体

用于克隆的寡核苷酸，下划线

SEQ ID NO.66 PR2

atatcatttttcacagaatcatagaaaaatcaagaaa

tctgaatcaaggagcttagcctcaccaccaatgttgatgattcttctcagccttgtaatagcttccttcttcaaccacacag

ctggacaaatcggagtatgctacgggatgctaggcgataccttgccaagtccatcggacgttgtggctctttacaaacaacaaaacatccagcgaatgcggctctacggccctgacccaggcgctcttgccgctctccgtggctctgacatcgagctcatcctcgacgttcccagttcagatcttgaacgtctcgcctccagtcaaacggaggccgacaagtgggttcaagaaaacgttcagagctacagagatggtgtcagattccggtacatcaacgttggaaatgaggtgaaaccctcagttggggggtttctcttacaagcaatgcagaacatcgagaacgcggtttctggagcagggcttgaagtcaaggtctcaacagctatagccactgacaccaccactgatacgtctcctccgtctcaaggaaggttcagggatgagtataagagctttctcgaaccagtgataggtttcttggcaagcaagcaatctcccttgctcgtgaatctctacccttacttcagctacatgggagacacggccaacatccatctagactacgctctgttcaccgcccagtccactgttgataacgatccagggtactcataccaaaacctattcgacgcaaatctcgactcggtttatgcagcattggagaaatcagggggcggatcgttggaaatcgtggtgtcggagaccggttggcccacagagggagcagtcgggacgagtgtggaaaacgcaaagacttatgttaacaatttgatacaacatgtgaagaatggatcaccgagaaggccagggaaagctatagagacttatatattcgctatgttcgatgagaataagaaggaaccaacgtatgagaagttttggggactgtttcatccagatcgacagtctaagtatgaagttaatttcaactaatccttagagacttgtgggctttttatgtaagcgtatttaaaaattgggaacttgttgtagtaataaggaataattaatgcgctttcagcgtgtagtatgttgttatttttaaggttataaatgagctgcaagcataaataaggaaaaaaaatagcatgggcctataggcccaataataaaacaagcttgctt

ATG标记为粗体的大写字母

内含子是粗体

用于克隆的寡核苷酸，下划线

SEQ ID NO.67

编码PR4(At3g04720)的基因的基因组序列。

下划线的是用于从基因组DNA扩增此基因的寡核苷酸的序列

agaccaccaagaaaacaaagacttatcgatcatgaagatcagacttagcataaccatcatacttttatcatacacagtggctacggtggccggacaacaatgcggtcgtcaaggcggtggtgaacttgtcccggaacatctgctgcagtcagtaggttactgtggtaccaccgcggactactgttctccgaccaacaactgtcagagcaattgttggggaagtgggcctagcggaccaggggagagcgcgtcgaacgtacgcgccacctaccatttctataatccggcgcagaataattgggatttgagagccgtgagtgcttattgctccacgtgggatgctgataagccgtacgcatggcggagcaagtatggctggaccgccttctgcgggccggcaggacctcgtggtcaagcttcttgcggcaagtgtttaagggtaagttaattaattatctttttctcaaatctttatataagtatgtttgtgcaaaaggagatcatatagaaagtgttggaattaagacgaatacaagataaaatttgttaccatttaccaacgtcaacgtgttagtgaaatatttcaaaagatgtatagccggtaaaaattgtgattaaccggtgggtataaatggattcaggtgaagaacacaagaacaaatgctgcagtaactgtgagaatagtggaccaatgcagcaacggaggcttggatttggatgtagcaatgttcaatcaaatagacaccgatggttttggctatcaacaaggccatctcattgttgactaccaatttgtcgactgtggcaatgagctcattgggcagcctgattccagaaacatgcttgtttcggccattgatcgcgtttgatattatgtaatgattttgaggtcaatatcgatcggtctacataaaaataataaagaccgctatatatgtattgtcgagggatatatgtttcgtatcaataaggaaattttaaatattattatcatt

用于在烟草和大豆中定量推定的目标的寡核苷酸

GMPR2 gi|210143170|dbj|AK285952.1|大豆cDNA，克隆：GMFL01-19-B17

GmPR2qF

5′CCTTCTTCTGGTGGAACTGC 3′SEQ ID No.68

GmPR2qR

5′ATAGGAGAAAAGAGCCCCCA 3′SEQ ID No.69

NTPR2 gi|194719370|gb|EU867448.1|烟草碱性β-1，3葡聚糖酶基因，完整cds

NtPR2qF

5′CTGGTTTGGGAAACAACATCAA 3′SEQ ID No.70

NtPR2qR

5′AATCTGGCCTGGATTACCAGAA 3′SEQ ID No.71

GMPR4 gi|210142121|dbj|AK246040.1|Glycine max cDNA，clone：GMFL01-49-I17

GmPR4qF

5′ACAGGAACAGGAGCAAACACAA 3′SEQ ID No.72

GmPR4qR

5′CATTCCCACAATCCACAAACTG 3′SEQ ID No.73

NTPR4 gi|632733|gb|S72452.1|烟草病原体和损伤诱导的抗真菌蛋白CBP20(CBP20)mRNA，完整cds

NtPR4qF

5′TTTGGCATGGAGGAGGAAGTAT 3′SEQ ID No.74

NtPR4qR

5′TCCACGATTCTCACTGTGGTCT 3′SEQ  ID No.75

GM-葡聚糖酶gi|38640794|gb|AY461847.1|大豆内-1，3-β-葡聚糖酶mRNA，完整cds

GmGlucqF

5′GAGAAAGTAGGGGCACCAAATG 3′SEQ ID No.76

GmGlucqR

5′TTCTGGTTTCCATCAAACATGG 3′SEQ ID No.77

GM延伸因子(用作内对照)

GmEFlaqF

5′TGAAACAGATGATTTGCTGCTGTA 3′SEQ ID No.78

GmEFlaqR

5′CAATCATGTTGTCTCCCTCAAAAC 3′SEQ ID No.79

Nt肌动蛋白(用作内对照)

NtActqF

5′CTGATGGACAGGTTATCACCATTG 3′SEQ ID No.80

NtActqR

5′TAATGCGGTAATTTCCTTGCTCAT 3′SEQ ID No.81

Claims (54)

1.转基因植物，所述转基因植物表达编码SEQ ID NO.5的蛋白质或所述蛋白质的功能部分的转基因。

2.权利要求1中定义的转基因植物，其中所述植物已经用载体转化，所述载体包含SEQ ID No.2、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7的核酸序列或编码SEQ ID No.8的核酸。

3.权利要求1或2中定义的转基因植物，其中与野生型植物相比所述植物显示增强的胁迫耐性。

4.权利要求1至3中任一项定义的转基因植物，其中所述植物显示增强的耐冻性、增强的耐低温性、增强的耐寒性、增强的耐旱性、增强的对高盐条件的耐受性和/或增强的病原体抗性。

5.用于产生胁迫耐受植物或增强胁迫耐性的方法，所述方法包括用SEQ ID No.2、6或7的核酸序列、其功能部分或功能变体转化植物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述功能部分是编码SEQ ID No.8的核酸序列。

7.根据权利要求5或6的方法，其中所述胁迫耐性选自耐冻性、增强的耐低温性、增强的耐寒性、增强的耐旱性、增强的对高盐条件的耐受性和/或增强的病原体抗性。

8.权利要求7中定义的方法，所述方法包括用编码如在SEQ ID NO.64中定义的ATHB13的核酸序列转化植物。

9.可以通过权利要求5至7中任一项定义的方法获得的植物或通过权利要求5至7中任一项定义的方法获得的植物。

10.分离的核酸序列，所述分离的核酸序列由SEQ ID No.8、9、10或13组成。

11.分离的嵌合核酸构建体，所述分离的嵌合核酸构建体包括编码HDZip蛋白质亚家族I的N端序列或包含其共有基序或其部分的序列的核酸序列，所述核酸序列可操作地与编码包含HAHB1的C端的序列或包含其共有基序或其部分的序列的核酸序列相连。

12.由权利要求11的基因构建体编码的多肽。

13.权利要求12的多肽，其中所述C端序列包含SEQ ID NO.8、9、10、11或12。

14.权利要求11至13中任一项的多肽，其中所述N端序列包含与SEQID NO.14的共有序列具有同源性的序列。

15.权利要求14的多肽，其中所述同源性至少是80％，优选地至少是90％，更优选地至少是95％。

16.权利要求12至15中任一项的多肽，其中HD Zip蛋白质亚家族I的N端序列可操作地与包含与如在SEQ ID NO.11中定义的C端共有基序和/或如在SEQ ID NO.12中定义的C端共有基序具有同源性的序列的序列相连。

17.权利要求16的多肽，其中所述同源性至少是80％，优选地至少是90％，更优选地至少是95％。

18.权利要求12至17中任一项的多肽，其中所述N端是HAHB4的N端。

19.权利要求11的基因构建体或权利要求12至18中任一项的多肽，其中所述基因构建体或多肽能够在植物中给予胁迫耐性。

20.用于在植物中给予胁迫耐性的方法，所述方法包括在植物中引入和表达权利要求11中定义的基因构建体或权利要求12至18中任一项定义的多肽。

21.用于鉴定当被引入植物中时给予胁迫耐性的核酸序列的方法，所述方法包括使用核酸序列来探查文库中的植物基因组或植物基因组克隆，所述核酸序列包括SEQ.ID.NO：1、2、6、7的序列或其部分或编码与SEQ.ID.NO.11、12或14的序列具有同源性的序列的序列，或编码SEQ.ID.NO：8或13的全部或选定部分的核酸或编码SEQ.ID.NO：5的全部或选定部分的核酸。

22.可以通过权利要求21的方法获得的分离的核酸序列或通过权利要求21的方法获得的分离的核酸序列。

23.与如在SEQ ID NO.6或7中定义的HAHB1序列具有同源性的核酸序列，其中当被引入植物并在植物中表达时所述基因序列能够给予胁迫耐性。

24.权利要求23中定义的核酸序列，其中所述序列显示与包含SEQ IDNO.6或7的HAHB1序列至少80％的同源性，优选地至少90％的同源性，更优选地至少95％的同源性。

25.权利要求23或24中定义的核酸序列，其中所述序列编码包含与如在SEQ ID NO.14中定义的N端同源异型结构域共有基序具有同源性的序列的序列。

26.权利要求23至25中定义的核酸序列，其中所述序列编码包含与如在SEQ ID NO.11中定义的C端共有基序和/或如在SEQ ID NO.12中定义的C端共有基序具有同源性的序列的序列。

27.权利要求25或26中定义的核酸序列，其中所述同源性至少是80％，优选地至少是90％，更优选地至少是95％。

28.用于产生胁迫耐受植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用权利要求22至27中任一项的核酸序列转化植物。

29.用于产生胁迫耐受植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码PR2的核酸序列转化植物。

30.用于产生胁迫耐受植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码gluc的核酸序列转化植物。

31.用于产生胁迫耐受植物或增强植物胁迫耐性的方法，所述方法包括用编码PR4的核酸序列转化植物。

32.权利要求29至权利要求31中任一项的方法，其中所述耐受是耐冻性。

33.分离的核酸序列，所述分离的核酸序列包含SEQ ID.No.1的核酸序列、其功能片段或功能变体。

34.分离的核酸序列，所述分离的核酸序列包含SEQ ID.No.7的核酸序列。

35.分离的核酸序列，所述分离的核酸序列包含SEQ ID.No.2的核酸序列。

36.分离的多肽序列，所述分离的多肽序列包含SEQ ID.No.5的序列。

37.包含基因构建体的载体，所述基因构建体包含权利要求34的序列、其功能部分或功能变体。

38.包含基因构建体的载体，所述基因构建体包含权利要求34或35的序列或SEQ ID No.6的核酸序列、其功能部分或功能变体。

39.包含基因构建体的载体，所述基因构建体包含表达SEQ ID NO.5的蛋白质、其功能部分或功能变体的序列。

40.根据权利要求38或39的载体，其中所述序列可操作地与启动子序列相连。

41.根据权利要求40的载体，其中所述启动子调节所述基因的组成型表达。

42.根据权利要求41的载体，其中所述启动子是35S启动子。

43.根据权利要求42的载体，其中所述启动子是天然HAHB1启动子。

44.根据权利要求43的载体，其中所述启动子包含SEQ ID.No.1的核酸序列、其功能片段或功能变体。

45.用权利要求37至44中任一项定义的载体转化的宿主细胞。

46.表达SEQ ID NO.5的蛋白质、其功能部分或功能变体的宿主细胞。

47.根据权利要求45或46的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。

48.用权利要求37至44中任一项定义的载体转化的转基因植物。

49.SEQ ID No.2、6或7的核酸序列、其功能部分、功能变体或权利要求37至44中任一项定义的载体在给予植物增强的胁迫耐性中的用途。

50.根据权利要求49的用途，其中所述胁迫耐性选自耐冻性、增强的耐低温性、增强的耐寒性、增强的耐旱性和/或增强的对高盐条件的耐受性。

51.用于在植物中诱导防冻蛋白质(AFP)产生的方法，所述方法包括用SEQ ID No.2、6或7的核酸序列、其功能部分、功能变体或用权利要求37至45中任一项定义的载体转化植物。

52.根据权利要求521的方法，其中所述防冻蛋白质选自PR2、PR4或葡聚糖酶。

53.如在SEQ ID No.1中定义的序列作为胁迫诱导型启动子的用途。

54.用于在植物中给予胁迫诱导的基因表达的方法，其中所述方法包括用表达盒转化植物，所述表达盒包含可操作地与用于表达的基因序列相连的SEQ ID No.1的核酸序列、其功能片段或功能变体。

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