CN102428176A - 淀粉酶多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽，更具体地为淀粉酶多肽和编码它们的核酸，以及它们的用途，例如在食品或饲料产品生产中作为非麦芽生成性外切淀粉酶。

Description

淀粉酶多肽
发明领域
本发明涉及多肽，特别是淀粉酶多肽和编码它们的核酸，及其用途，例如在食品或饲料产品生产中作为非麦芽生成性外切淀粉酶。
发明背景
改进的淀粉酶可减轻某些方法中内在的问题，例如在植物淀粉的转换中或烘焙中。
烘焙后数天在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，这引起面包硬度增加并引起面包陈化。当面包陈化时，面包失去面包心的柔软性和面包心水分。作为结果，面包心变得弹性更小并且面包产生皮革似的外皮。
支链淀粉侧链的酶促水解(例如，通过淀粉酶)可减少结晶并增加抗陈化。结晶取决于支链淀粉侧链的长度：侧链越长，结晶越多。大多数淀粉颗粒是由两种聚合物的混合物构成的：支链淀粉和直链淀粉，其中大约75％为支链淀粉。支链淀粉是非常大的分支的分子，其由(1-4)连接相连的α-D-吡喃葡萄糖基单元的链组成，其中所述链通过α-D-(1-6)连接附着以形成分支。直链淀粉是(1-4)连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的线性的链，具有少数α-D-(1-6)分支。
含淀粉的面包产品(例如白面包、由低麸黑麦粉和小麦粉制备的面包以及面包卷(roll))的烘焙是通过在180℃至250℃的范围内在烤箱中烘焙面包生面团15至60分钟而实现的。在烘焙过程中，陡的温度梯度(200℃至120℃)在外层生面团占优势，而在此形成烘焙产品的外皮。然而，由于蒸汽，面包心中的温度在烘焙过程结束时仅为约100℃。超过约85℃的温度，可发生酶失活并且酶将不具有抗陈化特性。因此，只有热稳定的淀粉酶能够在烘焙过程中有效地修饰淀粉。
内切淀粉酶活性通过由于分支糊精的累积而产生粘性的或胶粘的面包心，可负面地影响最终面包产品的品质。优选外切淀粉酶活性，因为其实现了引起陈化延缓的所需的淀粉修饰，具有更少的与内切淀粉酶活性相关的负面影响。减少内切淀粉酶活性可引起更好的外切特异性，这可减少分支糊精并产生更高品质的面包。
将植物淀粉(特别是玉米淀粉)转化为乙醇是快速扩展的工业。麦芽四糖(G4或DP4)糖浆是源自酶促处理淀粉的许多商业上重要的产品之一。将植物淀粉(特别是玉米淀粉)转化为麦芽四糖和更低的糖(例如葡萄糖或麦芽糖)是快速扩展的工业。
当前的方法由引起葡萄糖或麦芽糖产生的两个相继的酶催化步骤组成。然后可使用酵母来将葡萄糖发酵为乙醇。
第一个酶催化步骤是淀粉熔解。通常，通过快速加热至85℃或更高而对淀粉悬浮物进行凝胶化。使用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)来将粘性熔解物降解为麦芽糊精。α-淀粉酶是催化内部α-1，4-D-糖苷键的随机剪切的内切水解酶。当α-淀粉酶分解淀粉时，粘性减小。因为熔解通常是在高温下进行的，在此步骤中优选的是热稳定的α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的种的α-淀粉酶。
以此方式生产的麦芽糊精通常不能被酵母发酵以形成醇。因此需要第二个酶催化的糖化步骤来分解麦芽糊精。葡糖淀粉酶和/或麦芽生成性α-淀粉酶通常被用于催化熔解后形成的麦芽糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶(例如支链淀粉酶)可被用于辅助糖化。糖化通常在升高的温度、在酸性条件下(例如60℃，pH 4.3)发生。
G4(也称为DP4)糖浆与蔗糖糖浆相比具有许多有利的特性。例如，在食物中用G4糖浆部分地替代蔗糖减少食物的甜度而不影响其味道或风味。由于其更低的葡萄糖和麦芽糖含量，G4糖浆在食物中具有高保水性并显示出更少的有害的美拉德反应产物。G4糖浆还比蔗糖具有更高的粘性，因而改进食物质地。G4糖浆比蔗糖或高果糖糖浆更少地降低水的冰点，因此G4糖浆可更好地控制冷冻食物的冰点。消化后，G4糖浆还比蔗糖更少地影响渗透压。总之，这些品质使得G4糖浆理想地适于作为食物和医疗产品中的成分。G4糖浆也可用于其它的工业。例如，G4糖浆赋予光泽并可被有利地用作纸张浆料。参见，例如Kimura等人，“Maltotetraose，a new saccharide of tertiary property，”Starch 42：151-57(1990)。
用于生产乙醇的酵母之一是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。酿酒酵母含有α-葡糖苷酶，其被显示利用单糖、二糖和三糖作为底物，Yoon等人(Carbohydrate Res.338：1127-32(2003))。可通过Mg2+补给和过表达AGT1通透酶(Stambuck等人，Lett.Appl.Microbiol.43：370-76(2006))、过表达MTT1和MTT1alt以增加麦芽三糖摄取(Dietvorst等人，Yeast 22：775-88(2005))、或在细胞表面上表达麦芽糖酶MAL32(Dietvorst等人，Yeast 24：27-38(2007))来改善酿酒酵母利用三糖的能力。可以省略糖化步骤，如果熔解步骤产生了足够水平的单糖、二糖或三糖并且酿酒酵母或其经遗传修饰的变体被用于发酵步骤。
嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)表达形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60；形成G4的淀粉酶；G4-淀粉酶)。已确定了编码PS4的嗜糖假单胞菌基因的核苷酸序列(Zhou等人，“Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene fromPseudomonas saccharophila，”FEBS Lett.255：37-41(1989)；GenBankAcc.No.X16732)。PS4是作为具有N末端21个残基信号肽的前体蛋白表达的。如SEQ ID NO：10中所显示的，PS4的成熟形式含有530个氨基酸残基，其在N末端具有催化结构域而在C末端具有淀粉结合结构域。PS4显示内切和外切α-淀粉酶活性。内切α-淀粉酶活性可用于降低凝胶化淀粉的粘性，而外切α-淀粉酶活性可用于将麦芽糊精分解成更小的糖。
发明概述
本发明涉及多肽，特别是淀粉酶多肽和编码它们的核酸，及其用途，例如在食品生产中作为非-麦芽生成性外切淀粉酶。本发明的淀粉酶被工程化以具有更多有益的品质。具体地，本发明的淀粉酶显示出改变的外切特异型和/或改变的热稳定性。特别地，所述多肽衍生自具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性(特别是葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)活性)的多肽。一方面，本申请中所定义的多肽与SEQ ID NO：1的淀粉酶相比具有改进的抗陈化效果。另一方面，本申请中所定义的多肽与SEQ ID NO：1的淀粉酶相比具有改进的热稳定性。
提供了如权利要求中所列的变体多肽。另一方面，提供了所述变体多肽的用途，如权利要求中所列的，包括用于和用作食物添加剂、食品、烘焙产品、改进剂组合物、饲料产品(包括动物饲料)等。另一方面，提供了如权利要求中所列的编码和涉及变体多肽的核酸。权利要求中还列出了用于生产此类变体多肽的方法，以及其它的方面。
附图说明
所附的图被并入并作为本说明书的一部分且阐释了各种实施方式。
图1显示了与用包含SEQ ID NO：1的组合物烘焙的面包相比，用pMS1776(SEQ ID NO：12)，pMS2020(SEQ ID NO：14)，pMS2022(SEQ ID NO：15)和pMS2062(SEQ ID NO：16)烘焙的面包的硬度发展。
图2显示了与用包含SEQ ID NO：1和Novamyl 1500的组合物烘焙的面包相比，用pMS1776(SEQ ID NO：12)、pMS1934(SEQ ID NO：13)、pMS2022(SEQ ID NO：15)和pMS2062(SEQ ID NO：16)烘焙的面包的硬度发展。
发明详述
根据此详细描述，适用下列简称和定义。应当注意如本申请中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多个所述酶，而提及“制剂”包括指的是一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的等同物，等等。
一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列具有：
a)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：88或205，和/或
b)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：16，48，97，105，235，240，248，266，311，347，350，362，364，369，393，395，396，400，401，403，412或409，和/或
c)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列一个或多个氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D，392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G或399C/H，和/或
d)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：44，96，204，354或377，和/或
e)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代：392S；
参考如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有：与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：88或205和/或包含一个或多个下列氨基酸取代：42K，235H/K/R，240E，392K/D/E/Y或409E，参考如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
本发明还包括了下述多肽的应用：其与本申请中所定义的氨基酸序列或与具有本申请中所定义的特定特性的多肽有一定程度的序列同一性或序列同源性。本发明特别包括与SEQ ID NO：1(如下文所定义的)或其同源物具有一定程度的序列同一性的肽。在此，术语“同源物”指与主体氨基酸序列或主体核苷酸序列有序列同一性的实体，其中所述主体氨基酸序列优选为SEQ ID NO：1且所述主体核苷酸序列优选为SEQ ID NO：52。
一方面，所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应当提供和/或编码这样的多肽：其保持了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10的多肽的功能活性和/或提高了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10的多肽的活性，优选SEQ ID NO：1的多肽的活性。
在当前的情境中，同源序列包括这样的氨基酸序列：其可与主体序列至少65％，70％，75％，78％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一。通常，所述同源物与主体氨基酸序列将包括相同的活性位点等。虽然也可在相似性方面考虑同源性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，在本发明的情境中优选按照序列同一性来表述同源性。
可通过眼睛，或更经常是借助容易获得的序列比较程序来进行序列同一性比较。这些商业可得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多个序列，其最好地反映出可能导致两个或更多个序列之间的差异的进化事件。因此，这些算法以评分***运行，所述评分***奖励同一的或相似的氨基酸的比对而惩罚缺口的***、缺口延伸和不相似氨基酸的比对。所述比较算法的评分***包括：
i)每次***缺口时指定罚分(缺口罚分)，
ii)每次现存的缺口延伸一个额外的位置时指定罚分(延伸罚分)，
iii)对于同一的氨基酸的比对指定高分，和
iv)对于非同一的氨基酸的比对指定可变的分。
大多数比对程序允许修饰缺口惩罚。然而，当使用此类软件进行序列比较时，优选的是使用默认的值。
对于非同一的氨基酸的比对给出的得分是根据评分矩阵(也称作取代矩阵)指定的。在所述取代矩阵中提供的得分所反映的事实是：进化过程中一个氨基酸被另一个所取代的可能性是变化的并且其取决于将被取代的氨基酸的物理/化学性质。例如，与被疏水性氨基酸所取代相比，极性氨基酸被另一个极性氨基酸所取代的可能性更大。因此，所述评分矩阵对于同一的氨基酸将指定最高的得分，对于非同一但相似的氨基酸将指定更低的得分，而对于非同一且不相似的氨基酸将指定甚至更低的得分。最常用的评分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff等人(1978)，Jones等人(1992))、BLOSUM矩阵(Henikoff和Henikoff(1992))和Gonnet矩阵(Gonnet等人(1992))。
适合于进行此类比对的计算机程序包括但不限于Vector NTI(Invitrogen Corp.)和ClustalV，ClustalW以及ClustalW2程序(HigginsDG&Sharp PM(1988)，Higgins等人(1992)，Thompson等人(1994)，Larkin等人(2007))。由www.expasy.org的ExPASy蛋白质组服务器可获得汇集的不同比对工具。可进行序列比对的软件的另一个实例是BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，其可由国家生物技术信息中心的网页(目前可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov找到)获得，并且被首先描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215；403-410。
一旦软件产生出了比对，就可能计算％相似性和％序列同一性。所述软件通常将其作为序列比较的一部分进行并生成数字的结果。
在一个实施方式中，优选使用ClustalW软件来进行序列比对。优选地，对于两两比对，使用下列参数而用ClustalW进行比对：
  取代矩阵：   Gonnet 250
  缺口开始惩罚：   20
  缺口延伸惩罚：   0.2
  缺口结束惩罚：   无
例如，可如下在因特网上获得ClustalW2：在EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk上的欧洲生物信息研究所，在工具-序列分析-ClustalW2之下。目前，ClustalW2工具的确切地址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。
在另一个实施方式中，优选使用Vector NTI(Invitrogen)中的程序Align X来进行序列比对。在一个实施方式中，以下列默认设置使用Exp10：
缺口开始惩罚：10
缺口延伸惩罚：0.05
缺口分离惩罚范围：8
评分矩阵：blosum62mt2
因此，本发明还包括本申请中所定义的蛋白质或多肽的任何氨基酸序列的(特别是如下文中所定义的SEQ ID NO：1的或SEQ ID NO：2，4，6，8或10的)变体、同源物和衍生物的用途。
SEQ ID NO：1的序列，特别是其变体、同源物和衍生物序列也可具有氨基酸残基的缺失、***或取代，所述缺失、***或取代产生沉默改变并产生功能上等价的物质。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代，只要保留物质的二级结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有具有相似亲水性值的不带电极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明还包括可发生的保守取代(在本申请中取代和替代均用于指现存氨基酸残基与备选残基的交换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可发生非保守的取代，即从一类残基到另一类或备选地涉及包括非天然的氨基酸，例鸟氨酸(此后称作Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(此后称作B)、正亮氨酸鸟氨酸(此后称作O)、pyriylalanine、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
可进行的保守取代在例如下列组中：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)，大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸)。
替代也可通过非天然氨基酸进行，包括：α*和α-双取代的*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤族衍生物，例如三氟醚酪氨酸*，p-Cl-苯丙氨酸*，p-Br-苯丙氨酸*，p-I-苯丙氨酸*，L-烯丙甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，p-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟脯氨酸#，L-硫杂脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。记号*用于上文中的讨论的目的(涉及同源或非保守取代)以表示衍生物的疏水性质，而#用于表示衍生物的亲水性质，#*表示两亲特征。
变体氨基酸序列可包括可***序列的任何两个氨基酸残基之间的合适的间隔基团，其包括烷基(例如甲基、乙基或丙基)以及氨基酸间隔子(例如甘氨酸或β-丙氨酸残基)。本领域技术人员将很好地理解其它的变化形式，包括以类肽形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免疑问，“类肽形式”用于指这样的变体氨基酸残基：其中α-碳取代基团在残基的氮原子上而不是在α-碳上。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人(1992)，Horwell DC.(1995)。
在一个实施方式中，所述变体多肽是嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)淀粉酶(PS4)变体，其具有SEQ ID NO：1中所示的序列以及具有与所述序列至少65％，至少70％，至少75％，至少78％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性。
一方面，优选地用于本发明中的序列是纯化的形式。术语“纯化的”指的是给定的组分以高水平存在。希望的是，所述组分是组合物中存在的主要活性组分。
定义
除非另外定义，本申请中所使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员一般所理解的具有相同的含义。下文中提供了下述术语。
“淀粉酶”特别指这样的酶：其能够催化淀粉的降解。内切作用的淀粉酶活性以随机的方式减切淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷连接。相反，外切作用的淀粉分解活性从底物的非还原末端减切淀粉分子。当“内切作用的淀粉酶活性”、“内切活性”、“内切比活性”和“内切特异性”指权利要求中所定义的变体多肽时，这些术语是同义词。对于用于外切活性的相应术语也是如此。
“形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶；EC 3.2.1.60；形成G4的淀粉酶；G4-淀粉酶和葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶”可互换地使用。
在当前的情境中，“PS4”用于表示来自嗜糖假单胞菌的麦芽四糖水解酶。
“变体”指多肽或核酸。术语“变体”可与术语“突变体”互换地使用。变体包括分别在氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位置的***、取代、易位、截短和/或倒位。用语“变体多肽”、“多肽”、“变体”和“变体酶”指这样的多肽/蛋白质：其具有从SEQ ID NO：1的氨基酸序列被修饰的氨基酸序列。所述变体多肽包括与SEQ ID NO：1具有一定百分比(例如65％，66％，68％，70％，72％，74％，76％，78％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)的序列同一性的多肽。如本申请中所使用的，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”指所述变体多肽所基于的酶和多肽，例如SEQ ID NO：1。“亲本核酸”指编码亲本多肽的核酸序列。“变体”的信号序列可以与野生型PS4的信号序列相同(例如SEQ ID NO：11)或可以不同。变体可被表示为含有异源多肽的融合蛋白。例如，所述变体可包含另一个蛋白质的信号肽或被设计为帮助鉴别或纯化所表达的融合蛋白的序列，例如His-Tag序列。
为了描述本公开所预期包含的各种变体，将使用下列命名以方便引用。当取代包括数字和字母时(例如，141P)，其指的是{根据编号***的位置/取代的氨基酸}。因此，例如，将位置141的氨基酸取代为脯氨酸被称为141P。当取代包括字母、数字和字母时，例如A141P，那么其指的是{原始的氨基酸/根据编号***的位置/取代的氨基酸}。因此，例如用脯氨酸取代位置141处丙氨酸被称为A141P。
当某个位置可能有两个或更多个取代时，其将被指定为连续的字母，所述字母可任选地被斜杠标记“/”分开，例如，G303ED或G303E/D。
本申请中所指的位置和氨基酸取代是参照SEQ ID NO：1的相应位置和相应氨基酸列出的。在另一个序列中的等同位置可以通过如下找到：将所述序列与SEQ ID NO：1比对以发现具有最高的同一性百分比的比对，然后确定哪个氨基酸对应于SEQ ID NO：1的特定位置的氨基酸。此种比对和使用一个序列作为第一参照对于本领域技术人员来说只是例行事件。
“变体核酸”可包括的序列互补于能够与本申请中所呈现的核苷酸序列(特别是SEQ ID NO：52)杂交的序列。例如，变体序列互补于能够在严紧条件下与本申请中呈现的核苷酸序列(特别是SEQ IDNO：52(pMS 382DNA))杂交的序列，所述严紧条件为例如，50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)。更特别地，术语变体包括的序列互补于能够在高度严紧条件下与本申请中呈现的核苷酸序列(特别是SEQ ID NO：52(pMS 382DNA))杂交的序列，所述高度严紧条件为例如65℃和0.1X SSC。变体核酸的解链温度(Tm)可以比野生型核酸的Tm低约1、2或3℃。所述变体核酸包括与编码SEQ ID NO：1的核酸具有一定百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸。
如本申请中所使用的，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程包括转录和翻译。
“分离的”是指序列至少基本上不含在自然界中被发现且与所述序列天然缔合的至少一种其它组分，例如基因组序列。
“纯化的”是指材料处于相对纯的状态，例如至少约90％纯、至少约95％纯、或至少约98％纯。
“热稳定的”指酶在暴露于升高的温度后保持活性。酶的热稳定性可通过其半衰期(t1/2)被测量，其中半衰期时丧失一半的酶活性。半衰期值是在确定的条件下通过测量残留的淀粉酶活性而计算的。为了确定酶的半衰期，将样品加热至测试温度1-10分钟，并且使用用于淀粉酶活性的标准测定(例如Betamyl
Figure BDA0000109684100000121
测定(Megazyme，爱尔兰))来测量活性。
如本申请中所使用的，“最优pH”是指在淀粉酶活性的标准测定中，在一系列pH中测量的、本申请中所公开的变体多肽展现活性的pH。
如本申请中所使用的，“多肽”与术语“氨基酸序列”、“酶”、“肽”和/或“蛋白质”可互换地使用。如本申请中所使用的，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组的、合成的或重组来源的并且可以是双链的或单链的，不论其代表有义链还是反义链。如本申请中所使用的，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。
“同源物”是指与主体氨基酸序列和主体核苷酸序列具有一定程度的同一性或“同源性”的实体。“同源序列”包括与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分比同一性是指，比对时，当比较两个序列时相同的碱基或氨基酸残基的百分比。当与主体序列相比，取代、缺失或添加了氨基酸时氨基酸序列是不同一的。通常是关于主体蛋白质的成熟序列(即，例如去除了信号序列之后)来测量百分比序列同一性。通常，同源物将包含与主体氨基酸序列相同的活性位点残基。同源物还保持淀粉酶活性，虽然同源物可具有不同于野生型PS4的酶促特性。
如本申请中所使用的，“杂交”包括核酸的链通过碱基配对与互补链结合的过程，以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。变体核酸可作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物存在。如本申请中所使用的，“共聚物”是指包含核糖核苷和脱氧核糖核苷的单一核酸链。变体核酸可以是经密码子-优化的以进一步增加表达。
如本申请中所使用的，“合成的”化合物是由体外化学或酶促合成产生的。其包括但不限于以用于宿主生物体(例如酵母细胞宿主或其它所选择的表达宿主)的最佳密码子构成的变体核酸。
如本申请中所使用的，“转化的细胞”包括通过使用重组DNA技术而被转化的细胞(包括细菌和真菌细胞)。转化通常通过向细胞中***一个或多个核苷酸序列而发生。所***的核苷酸序列可以是异源的核苷酸序列，即对于待转化的细胞而言不是天然的序列，例如融合蛋白。
如本申请中所使用的，“可操作地连接”指所描述的组分所处的关系允许它们以其所欲的方式行使功能。例如，与编码序列可操作地连接的调控序列被连接的方式使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
如本申请中所使用的，术语“淀粉”指包含植物(例如玉米)的复杂多糖碳水化合物的任何材料，其包含具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数。术语“颗粒淀粉”是指生的(即未烹调的)淀粉例如，未经历凝胶化的淀粉。
术语“熔解”是指淀粉转化中凝胶化的淀粉被水解以提供低分子量可溶性糊精的阶段。如本申请中所使用的，术语“糖化”是指将淀粉酶促转化为葡萄糖。术语“聚合程度”(DP)是指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。
如本申请中所使用的，术语“干固体含量”(ds)是指基于干重百分比的、浆体的总固体。术语“浆体”指含有不可溶固体的水性混合物。
用语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生化试剂生产中，微生物(例如产生乙醇的微生物)和至少一种酶(例如PS4或其变体)在相同的方法步骤中存在过程。SSF是指同时将颗粒淀粉底物水解为糖和将糖发酵为醇，例如在相同的反应容器中。
如本申请中所使用的，“产乙醇性微生物”是指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。
1.2.缩写
除非另外指明，应用下列缩写：
Figure BDA0000109684100000141
Figure BDA0000109684100000151
2.SEQ ID NO：1的多肽变体
一方面，提供了相对于SEQ ID NO：1在一个或多个位置具有取代的多肽，所述取代产生改变的特性，其可以是改变的外切特异性、内切特异性或改变的热稳定性、或改变的操作特性的任意组合。为了方便，此类变体多肽在本文中也被称作“变体多肽”，“多肽变体”或“变体”。一方面，如本申请中所定义的多肽与SEQ ID NO：1的淀粉酶相比具有改进的抗陈化效果。另一方面，本申请中所定义的多肽与SEQID NO：1的淀粉酶相比具有改进的热稳定性。在非常优选的实施方式中，它们具有更高的热稳定性、或更高的外切淀粉酶活性或更高的pH稳定性、或其任意组合的附加优势。
一方面，本申请中所定义的变体显示出酶活性。一方面，所述变体多肽包含淀粉酶活性。另一方面，所述变体多肽包含外切淀粉酶活性。另一方面，变体多肽显示出非麦芽生成性外切淀粉酶活性。一方面，如本申请中所定义的变体是嗜糖假单胞菌α-淀粉酶(PS4)的可衍生形式。一方面，如本申请中所定义的变体是形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶，也称作EC 3.2.1.60；形成G4的淀粉酶；G4-淀粉酶或葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶。
本申请还提供了包含本文中所定义的所述变体多肽(例如具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的那些)的组合物，包括食物添加剂、食品、烘焙产品、改进剂组合物、饲料产品包括动物饲料等，以及制备和使用所述多肽和组合物的方法。
如上文所述，变体多肽可包含一个或多个改进的操作特性，优选改进的烘焙特性。因此，所述变体多肽使得经如此处理的食品具有下列的一项或多项(优选全部)：更低的硬度、更高的弹力、更高的粘结性、更低的破碎性或更高的可折叠性。所述变体多肽显示出的所述改进的操作或烘焙特性在下文中进一步详细描述。
此外，提供了用所述多肽处理食品，特别是生面团和烘焙产品，从而所述食品显示出如上文所列的需要的品质。
此外还提供了本申请中所描述的变体和包含这些变体的组合物的其它用途，例如用于制备去污剂、作为甜味剂、糖浆等。组合物包括所述多肽以及至少一种其它的组分。特别地，提供了包含所述多肽的食物或饲料添加剂。
提供了包含本文中所定义的变体多肽的分离的和/或纯化的多肽。在一个实施方式中，所述变体多肽是多肽的成熟形式(SEQ ID NO：1)，其中切除了21个氨基酸的前导序列，从而使多肽的N-末端以天冬氨酸(D)残基开始。一方面，所述变体包括C-末端淀粉结合结构域。淀粉结合结构域的代表性的氨基酸序列包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成。其它的变体包括其中相对于SEQ ID NO：1添加或缺失了1-约25个氨基酸残基的变体。一方面，所述变体具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列，其中1-约25之间任意数目的氨基酸被取代了。另一方面，所述变体具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中3-12之间任意数目的氨基酸被取代了。另一方面，所述变体具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中5-9之间任意数目的氨基酸被取代了。
一方面至少两个，另一方面至少三个、再一方面至少五个SEQ IDNO：1的氨基酸被取代了。
另一方面，所述多肽变体的长度为390-540个氨基酸。另一方面，所述多肽变体的长度为410-440个氨基酸。另一方面，所述多肽变体的长度为420-435个氨基酸。另一方面，所述多肽变体的长度为429-430个氨基酸。
一方面，本发明涉及具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有：
a)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：88或205，和/或
b)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：16，48，97，105，235，240，248，266，311，347，350，362，364，369，393，395，396，400，401，403，412或409，和/或
c)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代的一个或多个：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D，392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G或399C/H，和/或
d)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：44，96，204，354或377，和/或
e)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代：392S
其中氨基酸取代是相对于SEQ ID NO：1的相应氨基酸，而位置是参考SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
另一方面，本文中所定义的多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：88，205，235，240，248，266，311，377或409和/或一个或多个下列氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。另一方面，本文中所定义的多肽包含一个或多个在下列位置的氨基酸取代：88，205，235，240，311或409和/或一个或多个下列氨基酸取代：42K/N/I/H/F，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。另一方面，本文中所定义的多肽至少在四个、五个或全部下列位置中包含氨基酸取代：88，205，235，240，311或409和/或具有至少一个或两个下列氨基酸取代：42K/N/I/H/F，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。另一方面，本文中所定义的多肽还包含一个或多个下列氨基酸33Y，34N，70D，121F，134R，141P，146G，157L，161A，178F，179T，223E/S/K/A，229P，307K，309P和334P。另一方面，本文中所定义的多肽还具有下列氨基酸33Y，34N，70D，121F，134R，141P，146G，157L，161A，178F，179T，229P，307K，309P和334P。另一方面，本文中所定义的多肽至少具有一个权利要求1的a)中的氨基酸取代并且还包括一个或多个在下列位置的氨基酸取代：44，96，204，354或377。另一方面，本文中所定义的多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％的序列同一性。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸34Q。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸42K/F/H/I/N/A/V。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸42K/F/H/I/N。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸42K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置88包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸88L/Y/K。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸88L。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸88Y。另一方面，本文中所定义的多肽在位置205包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸205L/K/M/N/Q/R/V/Y。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸205L/K/M/N/Q/R/V。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸205L。另一方面，本文中所定义的多肽在位置235包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸235H/K/R/Q/S。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸235H/K/R/Q。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸235H/K/R。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸235R。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸235H。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸235K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置240包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸240E/H/M/D/S。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸240E/H/M/D。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸240E。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸272D。另一方面，本文中所定义的多肽在位置311包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸311P。另一方面，本文中所定义的多肽在位置409包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸409H/Q/T/E。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸409E。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸100Q/K/N/R。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸100Q。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T/G。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392D/E/K/Y。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392D。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392E。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392K。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸392Y。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸中的两者235R和311P。另一方面，本文中所定义的多肽在位置16包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸16/A/E/K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置48包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸48/C/L。另一方面，本文中所定义的多肽在位置97包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽在位置105包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸105/N/R。另一方面，本文中所定义的多肽在位置248包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽在位置266包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽在位置347包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸347/C/D/H/K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置350包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸350E/H/N。另一方面，本文中所定义的多肽在位置354包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸354D/E。另一方面，本文中所定义的多肽在位置362包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸362E/H/P。另一方面，本文中所定义的多肽在位置364包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸364E/K/NQ。另一方面，本文中所定义的多肽在位置369包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸369I/N。另一方面，本文中所定义的多肽在位置377包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽在位置393包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸393D/E/K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置395包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸395C/E/K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置396包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸396D/E。另一方面，本文中所定义的多肽在位置399包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸399C/H。另一方面，本文中所定义的多肽在位置400包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸400S/W。另一方面，本文中所定义的多肽在位置401包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸401D/K。另一方面，本文中所定义的多肽在位置403包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸403E/T/V。另一方面，本文中所定义的多肽在位置412包含氨基酸取代。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸412D/N。另一方面，本文中所定义的多肽还包含一个或多个下列氨基酸121F，134R，141P，229P或307K。另一方面，本文中所定义的多肽具有一个或多个下列氨基酸42K，88L，205L，235R，240E，272D，311P，392D或409E。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸42K，88L，235R，311P，392D和223S，223K或223A。另一方面，本文中所定义的多肽还包含选自下列的一个或多个272D，409E，205L和240E。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸中的至少四个、五个、六个、七个或八个：42K，88L，205L，235R，240E，272D，311P，392D或409E。另一方面，本文中所定义的多肽具有氨基酸223A/K/S。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸42K，88L，223S，235R，311P和392D。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸42K，88L，223K，235R，272D，311P和392D。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸42K，88L，223S，235R，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸42K，88L，205L，223S，235R，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸42K，88L，205L，223K，240E，235R，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽具有下列氨基酸42K，88L，205L，223A，T235R，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽在N末端具有一个或多个氨基酸。一方面，本文中所定义的多肽在N末端具有氨基酸M。另一方面，本文中所定义的多肽在下列位置包含一个或多个氨基酸取代：88，205，235或409和/或一个或多个下列氨基酸取代：42K，34Q，100Q，223A/S，240E，311P，392D或409E，参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。另一方面，本文中所定义的多肽包含一个或多个下列氨基酸取代：42K，34Q，88K/L/Y，100Q，205L，223A/S/K，235K/H/Q/R，240E/D，248H，266T，311P，377D/E/P，392K/D/Y或409E。另一方面，本文中所定义的多肽包含一个或多个下列氨基酸取代：34Q，42K，88L，100Q，205L，223A/S/K，235K/R，240E，311P，392D或409E。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：235R和311P。另一方面，本文中所定义的多肽包含氨基酸取代42K。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K和223S。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K，223S和392D。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，223A，235R，311P和392D。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，205L，223S，235R，240E，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，205L，223K，235R，240E，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，205L，223S，235R，311P和392D。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：34Q，42K，88L，205L，223K，235R，240E，311P，392D和409E。另一方面，本文中所定义的多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，100Q，205L，223K，235R，240E，311P，392D和409E。
如本文中所定义的多肽的代表性实施方式包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。如本文中所定义的多肽的其它代表性实施方式包含选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17。如本文中所定义的多肽的其它代表性实施方式具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。如本文中所定义的多肽的其它代表性实施方式具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17和任选地一个或多个N末端的氨基酸。
一方面，如本申请中所定义的多肽在相应于位置13-26处包含序列HGGDEIILQFHWN(SEQ ID NO：37)，所述位置是参照如SEQ IDNO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置49-66处包含序列DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD-X4-SSW(SEQ ID NO：38)，其中X1为S或T，X2为M或L，X3为V或P以及X4是任意天然存在的氨基酸残基，优选L-氨基酸，所述位置是参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置79-85处包含序列GGEGYFW(SEQ ID NO：39)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置114-117处包含序列VPNH(SEQ ID NO：40)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置150-154处包含序列CDDGD(SEQ ID NO：41)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置187-197处包含序列AGGFRFDFVRG(SEQ ID NO：42)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置256-259处包含序列FALK(SEQ ID NO：43)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置282-294处包含序列WREVAVTFVDNHD(SEQ ID NO：44)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置296-300处包含序列GYSPG(SEQ ID NO：45)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置304-306处包含序列GQH(SEQ ID NO：46)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置318-322处包含序列AYAYI(SEQ ID NO：47)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置325-329处包含序列SPGTP(SEQ ID NO：48)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置331-333处包含序列VYW(SEQ ID NO：49)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
一方面，本文中所定义的多肽在相应于位置335-340处包含序列HMYDWG(SEQ ID NO：50)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
另一方面，本文中所定义的多肽变体具有序列SEQ ID NO：1，其中1-约25之间任意数目的氨基酸被取代了。本文中所定义的具有一个或数个氨基酸取代的多肽变体的代表性实例如下面的表A所示：
Figure BDA0000109684100000241
Figure BDA0000109684100000251
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10的氨基酸序列相比，本文中所定义的多肽变体可具有改变的热稳定性，改变的内切淀粉酶活性，改变的外切淀粉酶活性和/或改变的外切与内切淀粉酶活性比率。一方面，与SEQ ID NO：1的淀粉酶相比，本文中所定义的多肽具有改进的抗陈化效果。另一方面，与SEQ ID NO：1的淀粉酶相比，本文中所定义的多肽具有改进的热稳定性。
与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比，本文中所定义的多肽变体可具有至多25，23，21，19，17，15，13，11，9，8，7，6，5个氨基酸缺失、添加、***或取代。
本公开还涉及具有包含如本文中进一步定义的取代的SEQ IDNO：2，4，6或8的每一个G4-淀粉酶骨架。
还提供了编码上述多肽变体的核酸。在一个实施方式中，编码本文所定义的多肽变体的核酸是这样的核苷酸序列：其编码包含SEQ IDNO：1的残基1-429的氨基酸序列的蛋白，如SEQ ID NO：52中所示。例如核苷酸序列SEQ ID NO：3编码具有SEQ ID NO：2的G4淀粉酶骨架。如本领域技术人员熟知的，遗传密码是简并的，意味着在某些情况下多个密码子可编码相同的氨基酸。核酸可包括编码多肽变体的基因组DNA，mRNA和cDNA。
2.1.多肽变体表征
酶变体可由下列表征：其核酸和一级多肽序列、其三围结构建模和/或其比活性。本文中所定义的多肽变体的其它特征包括例如稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。可利用本领域技术人员已知的标准测定来评估表达水平和酶活性。另一方面，变体显示出了相对于具有SEQ ID NO：1的多肽改进的性能特征，例如在高温(例如65-85℃)下改进的稳定性。一方面，本文中所定义的多肽变体对用于熔解或需要升高的温度的其它过程(例如烘焙)是有利的。例如，热稳定的本文中所定义的多肽变体可在约55℃至约85℃或更高的温度下降解淀粉。
表达特征指当变体在特定的宿主细胞中产生时，所述变体改变的表达水平。表达通常涉及在一定量的时间中，使用本领域已知的标准技术可从发酵培养液中回收的活性变体的量。表达也可涉及在宿主细胞内产生的、或由宿主细胞分泌的变体的量或速度。表达也可涉及编码变体酶的mRNA的翻译速度。
提供了与编码本文中所定义的任意多肽变体的核酸互补的核酸。此外，提供了能够与所述补体杂交的核酸。在另一个实施方式中，用于本文中所描述的方法和组合物中的序列是合成的序列。其包括但不限于以用于在宿主生物体(例如酵母)中表达的最佳密码子构成的序列。
3.本文中所定义的多肽变体的生产
本文所提供的多肽变体可根据本领域公知的程序被合成地生产或通过在宿主细胞中重组表达生产。所表达的本文中所定义的变体多肽任选地在使用之前是经分离的。在另一个实施方式中，本文中所定义的多肽变体是在表达后经纯化的。例如，在下列中描述了遗传修饰和重组生产多肽变体的方法：美国专利Nos.7,371,552，7,166,453；6,890,572和6,667,065；和美国公开的申请Nos.2007/0141693；2007/0072270；2007/0020731；2007/0020727；2006/0073583；2006/0019347；2006/0018997；2006/0008890；2006/0008888和2005/0137111。在本申请中通过引用而并入这些公开中的相关教导，包括编码多肽的多核苷酸序列、引物、载体、选择方法、宿主细胞、经表达的多肽变体的纯化和重构，以及对本文中所定义的多肽变体的表征(包括有用的缓冲剂、pH范围、Ca2+浓度、底物浓度和用于酶促测定的酶浓度)。
在另一个实施方式中，合适的宿主细胞包括***，选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，短芽孢杆菌(B.brevis)，嗜热芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)，环状芽孢杆菌(B.circulans)，灿烂芽胞杆菌(B.lautus)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性细菌，其中所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌(Pseudomonas)物种。一方面，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(B.subtilus)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。在一个实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌，并且工程化所表达的蛋白以包含枯草芽孢杆菌信号序列，如下文中进一步详细列出的。一方面，宿主细胞表达如权利要求中所示的多核苷酸。
在一些实施方式中，宿主细胞经遗传修饰以表达本文中所定义的多肽变体，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的多肽具有至少约78％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在一些实施方式中，编码本文中所定义的多肽变体的多核苷酸将具有编码SEQ ID NO：1的蛋白的核酸序列或与编码SEQ ID NO：1的蛋白的核酸具有至少约78％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列与SEQ ID NO：52的核酸具有至少约78％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
3.1.载体
一方面，本发明涉及包含多核苷酸的载体。本发明的一方面涉及包含所述载体的细菌细胞。在一些实施方式中，在包含与编码序列可操作地连接的调控序列的表达载体中，将包含编码变体的核酸的DNA构建体转运至宿主细胞。所述载体可以是可被整合到真菌宿主细胞基因组中并在引入了宿主细胞时能被复制的任何载体。密苏里大学的FGSC菌株目录列出了合适的载体。合适的表达和/或整合载体的其它实例在下列中提供：Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；Bennett等人，MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)，pp.396-428；和美国专利No.5,874,276。示例性的载体包括pFB6，pBR322，PUC18，pUC100和pENTR/D，pDONTM201，pDONRTM221，pENTRTM，pGEM
Figure BDA0000109684100000281
3Z和pGEM
Figure BDA0000109684100000282
4Z。用于细菌细胞的示例包括pBR322和pUC19，其允许在大肠杆菌中复制；以及例如pE194，其允许在芽孢杆菌中复制。
在一些实施方式中，编码变体的核酸与合适的启动子可操作地连接，这允许在宿主细胞中转录。所述启动子可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1，cbh2，egl1和egl2启动子。在一个实施方式中，所述启动子是对于宿主细胞天然的启动子。例如，当宿主为嗜糖假单胞菌时，启动子为天然的嗜糖假单胞菌启动子。“可诱导的启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。在另一个实施方式中，启动子是异源于宿主细胞的启动子。
在一些实施方式中，编码序列与编码信号序列的DNA序列可操作地连接。代表性的信号肽是SEQ ID NO：11，其为PS4前体的天然信号序列。在其它实施方式中，用编码来自嗜糖假单胞菌之外的其它物种的信号序列的核苷酸序列替代编码信号序列的DNA。在这种实施方式中，编码信号序列的多核苷酸在编码所述多肽的多核苷酸的立即上游并符合读框。所述信号序列可选自与宿主细胞相同的物种。在一个非限制性实例中，信号序列为来自芽孢杆菌属的种的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase；EC 2.4.1.19)信号序列，且本文中所公开的变体多肽在枯草芽孢杆菌宿主细胞中表达。可在所述信号序列的N末端添加甲硫氨酸残基。
在其它的实施方式中，包含在待引入真菌宿主细胞中的DNA构建体或载体中的信号序列和启动子序列源自相同的来源。在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。在一个实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施方式中，终止序列与宿主细胞同源。
在一些实施方式中，表达载体包括选择性标记物。合适的选择性标记物的实例包括赋予对于抗微生物试剂抗性的那些，例如潮霉素或腐草霉素。营养选择性标记物也是合适的，包括amdS，argB和pyr4。在一个实施方式中，选择性标记物为amdS基因，其编码乙酰胺酶；其允许经转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。使用构巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因作为选择性标记物被描述于Kelley等人，EMBO J.4：475-479(1985)和Penttila等人，Gene 61：155-164(1987)中。
包含具有编码变体的多核苷酸的DNA构建体的合适表达载体可以是能够在给定的宿主生物体中自主复制或能够整合到宿主DNA中的任何载体。在一些实施方式中，所述表达载体为质粒。在一些实施方式中，涉及了用于获得基因表达的两种类型的表达载体。第一种表达载体包含这样的DNA序列，其中启动子、编码区和终止子均来自待表达的基因。在一些实施方式中，通过删除不需要的DNA序列(例如编码C末端淀粉结合结构域的DNA)而获得基因截短，以使结构域在其自身的转录和翻译调控序列的控制下表达。第二种类型的表达载体是预装配的，并含有高水平转录所需的序列和选择性标记物。在一些实施方式中，基因的编码区或其部分被***此通用表达载体中，从而其在表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因或其部分被***强cbh1启动子的下游。
3.2.转化，表达和宿主细胞的培养
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括下列技术：例如转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染例如脂质转染介导的和DEAE-糊精介导的转染、用磷酸钙DNA沉淀物温育、用涂覆了DNA的微粒子弹高速轰击、和原生质体融合。一般的转化技术是本领域已知的。参见，例如Ausubel等人(1987)，见上，第9章；Sambrook等人(2001)，见上；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56(1989)。在木霉属(Trichoderma)中表达异源蛋白被描述于，例如美国专利No.6,022,725；美国专利No.6,268,328；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233(1991)；Harkki等人，BioTechnol.7：596-603(1989)；EP 244,234和EP 215,594中。在一个实施方式中，用载体***构建了遗传上稳定的转化体，其中编码变体的核酸被稳定地整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术纯化所述转化体。
在一个非限制性实例中，包括amdS标记物的稳定转化体通过其更快的生长速度以及在含有乙酰胺的固体培养基上形成具有光滑而非粗糙轮廓的圆形克隆而区别于不稳定的转化体。此外，在一些情况下，如下进一步进行稳定性的测试：在固体非选择性培养基上(例如缺少乙酰胺的培养基)培养转化体、从所述培养基中收获孢子和测定随后萌芽并在含有乙酰胺的选择性培养基上生长的孢子的百分比。可使用本领域已知的其它方法来选择转化体。
3.3.活性的鉴别
为了评估变体在宿主细胞中的表达，测定可测量所表达的蛋白，相应的mRNA或α-淀粉酶活性。例如，合适的测定包括Northern和Southern印记，RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)和原位杂交，使用适当标记的杂交探针。合适的测定还包括测量样品中的活性。变体外切活性的合适测定包括但不限于Betamyl
Figure BDA0000109684100000301
测定(Megazyme，爱尔兰)。变体内切活性的合适测定包括但不限于Phadebas蓝色测定(Pharmacia and Upjohn Diagnostics AB)。测定还包括在变体的存在下对所制备的熔解物的HPLC分析。HPLC可通过将DP-3及DP-4糖与测定中的其它组分分离而被用于测量淀粉酶活性。
改进的操作特性
本文所描述的变体多肽优选具有相比于SEQ ID NO：1改进的特性，例如下列中的任意一项或多项：改进的热稳定性、改进的pH稳定性或改进的外切特异性。本文所描述的变体多肽优选还具有改进的操作特性，从而经变体多肽处理的食品与用SEQ ID NO：1处理的食品相比具有下列的任一种或全部：更低的硬度、更高的弹力、更高的粘结性、更低的破碎性或更高的可折叠性。
不欲受任何特定理论所限，我们相信在特定位置的突变对于包含所述突变的多肽的特性具有单独的和累积的影响。
热稳定性和pH稳定性
优选地，所述变体多肽是热稳定的；优选地，其具有比SEQ IDNO：1更高的热稳定性。
在小麦和其它谷物中，支链淀粉中的外部侧链在DP 12-19的范围内。因此，支链淀粉侧链的酶促水解(例如通过所述具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的变体多肽)可显著降低其结晶趋势。
小麦和用于烘焙目的的其它谷物中的淀粉以淀粉颗粒的形式存在，其通常对淀粉酶的酶促攻击有抗性。因此，淀粉修饰主要限于受损的淀粉并且在生面团加工和起初的烘焙中进展非常缓慢直到在大约60℃时凝胶化开始。作为结果，只有具有高度热稳定性的淀粉酶能够在烘焙过程中有效地修饰淀粉。并且通常淀粉酶的效率随着增加的热稳定性而增加。这是因为，酶的热稳定性越高，其在烘焙过程中有活性的时间越长并因此其将提供的抗陈化效果越多。
因此，通过在将淀粉加工为食品的任何阶段(例如在烘焙成为面包之前、之中或之后)将本文所述的变体多肽加入淀粉中而使用所述变体多肽可延迟或阻碍或减慢凝沉。此种应用在下文中进一步详细描述。
如本申请中所使用的，术语“热稳定的”涉及酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。优选地，变体多肽能够在约55℃至约80℃或更高的温度下降解淀粉。合适地，酶在暴露于至多约95℃的温度后保持其活性。
酶(例如非麦芽生成性外切淀粉酶)的热稳定性是通过其半衰期测量的。因此，相对于亲本酶，本文所描述的变体多肽的半衰期优选延长了10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多，优选在55℃至约95℃或更高的升高的温度下，优选在约80℃时。
如此处所使用的，半衰期(t1/2)是在一定的热条件下酶活性的一半失活的时间(以分钟计)。在优选的实施方式中，半衰期是在80℃测定的。优选地，在80℃或更高的温度将样品加热1-10分钟。然后通过本文描述的任何方法，通过测量残余的淀粉酶活性来计算半衰期值。优选地，半衰期测定是如实施例中更加详细的描述而进行的。
优选地，本文所描述的变体多肽在烘焙过程中是有活性的并且在淀粉颗粒凝胶化的过程之中和之后水解淀粉，所述凝胶化在温度为约55℃时开始。非麦芽生成性外切淀粉酶越为热稳定，其能够有活性的时间越长，并且因此其将提供更多的抗陈化效果。然而，在超过约85℃的温度的烘焙过程中，可以发生酶的失活。如果发生这种情况，非麦芽生成性外切淀粉酶可能逐渐失活从而烘焙过程之后在最终的面包中基本上没有活性。因此，优选地，适于所述应用的非麦芽生成性外切淀粉酶具有的最佳温度在50℃以上和98℃以下。
本文所描述的变体多肽的热稳定性可通过利用蛋白质工程化而被改进以变得更加热稳定，并因此更适于本文所描述的应用；因此，我们涵盖了通过蛋白质工程化经修饰而变得更加热稳定的变体多肽的用途。
优选地，所述变体多肽是pH稳定的；更优选地，其比SEQ ID NO：1具有更高的pH稳定性。如本申请中所使用的，术语“pH稳定的”涉及酶在广泛的pH范围内保持活性的能力。优选地，变体多肽能够在约5至约10.5的pH中降解淀粉。在一个实施方式中，可通过在特定的pH条件下测量酶的半衰期而测定pH稳定性的程度。在另一个实施方式中，可通过在特定的pH条件下测量酶的活性或比活性来测定pH稳定性的程度。所述特定的pH条件可以是从pH5至pH10.5的任何pH。
因此，当在相同的条件下与SEQ ID NO：1比较时，所述变体多肽可具有更长的半衰期或更高的活性(取决于测定)。当在相同的pH条件下与SEQ ID NO：1比较时，变体多肽可具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更长的半衰期。备选地或此外，当在相同的pH条件下与SEQ ID NO：1比较时，他们可具有此种更高的活性。
外切特异性
已知一些非麦芽生成性外切淀粉酶可具有某种程度的内切淀粉酶活性。在某些情况中，此类活性可能需要被减少或消除，因为内切淀粉酶活性可能通过分支糊精的累积而产生粘性的或胶粘的面包心从而负面地影响最终面包产品的品质。
外切特异性通常可通过测定总淀粉酶活性与总的内切淀粉酶活性的比例而测量。在本文中，这一比例被称作“外切特异性指数”。在优选的实施方式中，如果酶具有20或更高的外切特异性指数(即其总淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)是其内切淀粉酶活性的20倍或更高)，那么所述酶被认为是外切淀粉酶。在非常优选的实施方式中，外切淀粉酶的外切特异性指数为30或更高，40或更高，50或更高，60或更高，70或更高，80或更高，90或更高，或者100或更高。在非常优选的实施方式中，外切特异性指数为150或更高、200或更高、300或更高、400或更高、500或更高或者600或更高。
总淀粉酶活性和内切淀粉酶活性可通过本领域已知的任何手段测量。例如，总淀粉酶活性可通过测定从淀粉底物上释放的还原端总数而测量。备选地，在实施例中进一步详述了使用Betamyl测定，并且为了方便，如实施例中所测定的淀粉酶活性在表中以“Betamyl单位”的方式描述。
内切淀粉酶活性可通过使用Phadebas试剂盒(Pharmacia andUpjohn)被测定。这利用的是蓝色标记的交联淀粉(用偶氮染料标记的)；只有淀粉分子中的内部切割释放标记，而外部切割做不到。可通过分光光度测定法测量染料的释放。因此，Phadebas试剂盒测量内切淀粉酶活性，并且为了方便，所述测定的结果在本文中被称为“Phadebas单位”。
因此，在非常优选的实施方式中，外切特异性参数被表述为Betamyl单位/Phadebas单位，也称作“B/Phad”。
也可根据现有技术中描述的方法测定外切特异性，例如在我们的国际专利公布号WO99/50399中。其介由内切淀粉酶活性与外切淀粉酶活性之间的比例测量外切特异性。因此，在优选的方面，本文描述的变体多肽将具有小于0.5的内切淀粉酶单位(EAU)/外切淀粉酶活性单位。优选地适于根据本发明使用的非麦芽生成性外切淀粉酶具有小于0.05EAU/外切淀粉酶活性单位，且更优选地少于0.01EAU/外切淀粉酶活性单位。
本文所描述的变体多肽将优选地具有外切特异性，例如由外切特异性指数所测量的，如上文所述，其与它们是外切淀粉酶相一致。此外，当与SEQ ID NO：1相比时，它们优选地具有更高的或增加的外切特异性。因此，例如，当与SEQ ID NO：1相比时，优选地在相同的条件下，所述变体多肽可具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更高的外切特异性指数。当与SEQ ID NO：1相比时，优选地在相同的条件下，它们可具有的为1.5x或更高，2x或更高，5x或更高，10x或更高，50x或更高，100x或更高。
3.4.用于纯化变体的方法
通常，在细胞培养物中生产的变体被分泌到培养基中并且可被纯化或分离，例如通过从细胞培养基中去除不需要的组分。在一些情况下，可从细胞裂解物中回收变体。在此种情况中，使用本领域技术人员常规采用的技术从产生酶的细胞中纯化所述酶。实例包括但不限于例如亲和层析、离子交换层析法包括高分辨率离子交换、疏水相互作用层析、两相分配、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅树脂或阳离子交换树脂上的层析例如DEAE、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀法和利用Sephadex G-75的凝胶过滤。
4.变体的组合物和用途
通过上文描述的方法产生和纯化的多肽变体可用于各种工业应用。在一个实施方式中，本文中所定义的多肽变体可用于淀粉转化过程，特别是在淀粉(例如玉米淀粉、小麦淀粉或大麦淀粉)的熔解过程中。所需的终产物可以是通过淀粉底物的酶促转化可以产生的任何产物。例如，所需的产物可以是富含可用于发酵的糖(特别是麦芽三糖、葡萄糖和/或麦芽糖)的糖浆。然后可将终产物直接用于发酵过程中以产生用于燃料或饮用(即饮用酒精)的醇。本领域技术人员了解可用于生产乙醇或其它发酵终产物的各种发酵条件。特别有用的是能够发酵麦芽三糖和/或更不复杂的糖的微生物，例如酿酒酵母或其经遗传修饰的变体。对于发酵麦芽三糖特别有用的合适的经遗传改变的酿酒酵母变体包括表达AGT1通透酶的变体(Stambuck等人，Lett.Appl.Microbiol.43：370-76(2006))、表达MTT1和MTT1alt的变体(Dietvorst等人，Yeast 22：775-88(2005))或表达MAL32的变体(Dietvorst等人，Yeast 24：27-38(2007))。所述多肽变体也可用于食物制备的组合物和方法中，其中需要在高温下表达淀粉酶活性的酶。
使用特定多肽变体的需求将取决于所述多肽变体相对于特定应用的要求所展现出的总体特性。一般而言，可用于淀粉转化过程的多肽变体与野生型PS4或SEQ ID NO：1相比具有大量的内切淀粉酶活性，和/或与野生型PS4或SEQ ID NO：1相比具有更低的外切比内切淀粉酶活性。此类多肽变体特别可用于熔解过程中，当其单独使用或与其它淀粉酶变体结合使用时，复杂分支糖的内部剪切降低底物的粘性。然而，预期某些可用于熔解的一些多肽变体与野生型PS4相比，具有相当或甚至更低的内切淀粉酶活性。取决于应用，有用的多肽变体包括比野生型PS4或SEQ ID NO：1多肽具有更多或更少的外切淀粉酶活性的那些。组合物可包括一种淀粉酶变体或淀粉酶变体的组合，其中每一种可展示出不同组的特性。
4.1.淀粉底物的制备
本领域技术人员了解可用于制备用于本文公开的方法中的淀粉底物的可得方法。例如，可以从块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷获得有用的淀粉底物。更具体地，颗粒淀粉来自产生大量淀粉的植物。例如，颗粒淀粉可获得自玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉(tapioca)、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。玉米含有大约60-68％的淀粉；大麦含有大约55-65％的淀粉；小米含有大约75-80％的淀粉；小麦含有大约60-65％的淀粉；以及精米含有70-72％的淀粉。特别涉及的淀粉底物为玉米淀粉、小麦淀粉和大麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，并且包括谷物固体，例如核、麸和/或穗轴。淀粉可以是高度精制的生淀粉或来自淀粉精制过程的原料。各种淀粉也是商业上可得的。例如，玉米淀粉可从Cerestar，Sigma和Katayama Chemical Industry Co.(日本)获得；小麦淀粉可从Sigma获得；甘薯淀粉可从Wako Pure Chemical Industry Co.(日本)获得；以及马铃薯淀粉可从Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(日本)获得。
在本发明的实施方式中麦芽糊精可用作淀粉底物。麦芽糊精包含具有约20或更少的右旋糖(葡萄糖)单元的淀粉水解产物。典型的商业麦芽糊精含有多糖的混合物，所述多糖包括约3个至约19个相连的右旋糖单元。麦芽糊精被FDA定义为具有少于20右旋糖等价(DE)的产品。它们通常被认为是对于人类消费而言安全的(GRAS)食物成分。右旋糖等价(DE)是与100的右旋糖(葡萄糖)标准相比还原力的量度。DE越高，淀粉解聚的程度越大从而产生越小的平均聚合物(多糖)大小，并且甜度越高。特别有用的麦芽糊精是获得自玉米淀粉的MALTRINM040，其可获得自Grain Processing Corp.(Muscatine，Iowa)：DE 4.0-7.0；体密度0.51g/cc；所测量的水含量为6.38％按重量。
淀粉底物可以是来自研磨的全谷粒的粗制淀粉，其含有非淀粉级分，例如胚芽残余物和纤维。研磨可包括湿研磨或干研磨。在湿研磨中，将全谷粒浸泡在水或稀释的酸中以将谷粒分离成为其组成部分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、核纤维。湿研磨有效地分离胚芽与粉(即淀粉颗粒与蛋白质)并且特别适于生产糖浆。在干研磨中，不将谷粒分级成为其组成部分而将全谷磨碎为细粉并加工。因此除了淀粉之外，干研磨的谷粒将包含大量的非淀粉碳水化合物。大多数乙醇来自干研磨。备选地，待加工的淀粉可以为高度精制的淀粉品质，例如至少约90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯。
4.2.淀粉的糖化、凝胶化和熔解
如本申请中所使用的，术语“熔解”或“液化”是指这样的过程，其中淀粉被转化为粘性更小且链更短的糊精。所述过程涉及与加入本文所述的多肽变体同时或在其之后的淀粉凝胶化。如本文所述的热稳定的多肽变体优选地用于此应用。任选地可加入其它诱导熔解的酶。
在一些实施方式中，如上文所述制备的淀粉或麦芽糊精底物用水成浆。淀粉或麦芽糊***体可含有的淀粉(作为干固体的重量百分比)为约10-55％，约20-45％，约30-45％，约30-40％或任选地约30-35％。通常供应的α-淀粉酶(例如细菌α-淀粉酶，包括芽孢杆菌α-淀粉酶)为例如约1500个单位/kg淀粉干物质。为了优化α-淀粉酶稳定性和活性，浆体的pH可被调节至用于多肽变体的最佳pH。可加入其它的α-淀粉酶，并且可能需要不同的最佳条件。可通过在随后的反应步骤中降低pH或通过从浆体中去除钙而使熔解后保留在浆体中的细菌α-淀粉酶失活。
淀粉浆体和多肽变体可被连续地泵过喷射式煮浆锅，其从约85℃被蒸汽加热直至105℃。在这些条件下，凝胶化发生得非常快，并且酶活性与显著的剪切力相结合而开始水解淀粉底物。在喷射式煮浆锅中停留的时间非常短。部分凝胶化的淀粉可被通入一系列保持在约85-105℃的保留管并保持约5分钟，以完成凝胶化过程。这些槽可含有挡板以阻止反混。如本申请中所使用的，术语“次级熔解”指初级熔解之后的熔解步骤，这是当允许浆体冷却至室温时。此冷却步骤可以为约30分钟至约180分钟，例如约90分钟至120分钟。
本文中所定义的多肽变体可以约0.01至约1.0kg/MTDS被加入通过上述过程获得的熔解的淀粉中或麦芽糊***体中。1kg/MTDS＝0.1％按重量溶解的固体。在一个实施方式中，本文所定义的多肽可以基于溶解的固体约0.001％按重量至约0.01％按重量范围内的处理水平被加入熔解的淀粉或麦芽糊***体中。在典型的实施方式中，本文所定义的多肽可以基于溶解的固体约0.0025％按重量至约0.01％按重量范围内的处理水平被加入熔解的淀粉或麦芽糊***体中。在一个实施方式中，本文中所定义的多肽是被固定的，并且熔解的淀粉或麦芽糊精底物通过所述经固定的本文所定义的多肽且在连续的反应中被转化为产物。在此实施方式中，可用其它的酶(例如支链淀粉酶)来固定本文中所定义的多肽。
麦芽四糖的产生还可包括用异淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶或其任意组合接触熔解的淀粉或其它的麦芽糊精来源。
还提供制备糖(例如麦芽四糖)浆的方法，包括向淀粉熔解物中加入本文所定义的多肽变体或包含所述变体的组合物以及糖化所述淀粉熔解物以形成糖浆。可基于溶解的固体以约0.001％按重量至约0.1％按重量的范围将本文中所定义的多肽变体加入淀粉熔解物中。在一个实施方式中，基于溶解的固体以约0.0025％按重量至约0.01％按重量的范围将所述变体加入淀粉熔解物中。在本文中，浓度的单位也表述为多肽变体(kg)/干固体(公吨)(MTDS)，其中1kg/MTDS＝0.1％按重量溶解的固体。熔解的淀粉溶液可以是为约20-35％w/w干固体的熔解的淀粉的浆体。淀粉可获得自玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。可在约55℃至约65℃(例如约60℃至约65℃)糖化所述淀粉熔解物。可在约pH 5.0至约pH 7.0糖化所述淀粉熔解物。可与所述多肽变体一起向淀粉熔解物中加入支链淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶或其任意组合。在一个实施方式中，可发酵所述糖浆以生产乙醇。通过所述方法生产的糖浆可包含基于总糖含量至少约40％，约45％，约50％，约55％或约60％按重量的麦芽四糖。
另一方面，提供了制备糖浆的方法，包括向颗粒淀粉中加入本文中所定义的多肽变体和α-淀粉酶并水解颗粒淀粉以形成糖浆。在一个实施方式中，所述颗粒淀粉熔解物是由α-淀粉酶产生的。在一个实施方式中，所述颗粒淀粉熔解物是酸产生的熔解物。在一个实施方式中，基于溶解的固体以约0.001％按重量至约0.1％按重量的范围将本文中所定义的多肽变体加入颗粒淀粉中。在另一个实施方式中，基于溶解的固体以约0.0025％按重量至约0.01％按重量的范围将本文中所定义的多肽变体加入颗粒淀粉中。颗粒淀粉可获得自来自玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯的淀粉。
在特别的实施方式中，在55℃至65℃(例如60℃至65℃)糖化所述颗粒淀粉。在另一个实施方式中，在pH 5.0至pH 7.0糖化所述颗粒淀粉。预期的是，所述方法还可包括发酵糖浆以产生乙醇。
在一个实施方式中，所述方法包括将具有脱支活性的酶加入颗粒淀粉中的步骤。所述具有脱支活性的酶可包括但不限于异淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶、新型支链淀粉酶(neopullulanase)或其任意组合。还预期的是，所述方法可任选地包括向颗粒淀粉中加入蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、果胶裂解酶或其任意组合的其它步骤。
在一个实施方式中，糖浆基于总糖含量包括至少35％按重量的麦芽四糖。备选地，糖浆基于总糖含量包括至少45％按重量的麦芽四糖。在另一个实施方式中，糖浆基于总糖含量包括至少50％按重量的麦芽四糖。在另一个实施方式中，糖浆基于总糖含量包括45％按重量至60％按重量的麦芽四糖。
预期的是，本文的方法中所定义的多肽变体可以是经固定的。
另一方面，提供了用于制备IMO的方法，其包括向淀粉熔解物或颗粒淀粉形式的淀粉中加入a)本文中所定义的多肽变体、b)α-淀粉酶和c)转葡糖苷酶，以及糖化所述淀粉以形成IMO。还预期的是IMO可以至少30，至少40和/或至少45的IMO数形成。在一个实施方式中，淀粉是从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯中获得的。
另一方面，提供了用于制备IMO的方法，其包括向淀粉熔解物或颗粒淀粉形式的淀粉中加入a)多肽变体、b)α-淀粉酶和c)转葡糖苷酶，以及糖化所述淀粉以形成IMO。可使用任何数目的转葡糖苷酶(TG)，例如转葡糖苷酶L-500
Figure BDA0000109684100000401
(Danisco US Inc.，Genencor Division)。
预期的是IMO可以至少30，至少40和/或至少45的IMO数形成。在一个实施方式中，淀粉是从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯中获得的。
4.3.发酵过程
将通常来自酵母属的种(Saccharomyces spp.)的酵母加入醪液中并且发酵24-96小时，例如通常为35-60小时。温度在约26-34℃之间，通常为约32℃，且pH为约pH 3-6，通常在约pH 4-5左右。
在一个实施方式中，在封闭的***中使用批次发酵过程，其中培养基的组成在发酵开始时设置并且在发酵过程中不改变。在发酵开始时，用所需的微生物接种培养基。在这种方法中，允许发酵发生而不向***中加入任何组分。通常，批次发酵在碳源的加入方面适格作为“批次”，并且常常尝试控制一些因素，例如pH和氧浓度。批次***的代谢物和生物质组成持续地变化，直至发酵终止的时候。在批次培养物中，细胞经过静态延迟期而发展到高生长对数期并最后到稳定期，此时生长速度减少或停止。如果不经处理，稳定期的细胞最终死亡。一般而言，对数期的细胞负责产品生产的大部分。
对于标准批次***的适当变化是“补料批次发酵”***。在典型批次***的这种变化中，随着发酵的进行将底物递增地加入。当分解代谢物阻抑有可能抑制细胞的代谢时以及当希望在培养基中含有有限量的底物时，补料批次***是有用的。在补料批次***中测量实际的底物浓度是困难的并且因此其是基于可测量因子的变化而估测的，所述因子为例如pH、溶解的氧和废气(例如CO2)的分压。批次和补料批次发酵是本领域中常见和公知的。
连续发酵是开放的***，其中向生物反应器中连续加入限定的发酵培养基，并且同时移除等量的条件培养基用于加工。连续发酵通常使培养物保持为持续的高密度，其中细胞主要处于对数期生长中。连续发酵允许调节影响细胞生长和/或产品浓度的一个或多个因子。例如，在一个实施方式中，将限制性营养物(例如碳源或氮源)保持为固定的比率，而允许调节所有其它参数。在其它的***中，可连续改变影响生长的许多因子，而使细胞浓度(通过培养基浑浊度测量)保持恒定。连续***力求保持稳态生长条件。因此，由于培养基被抽出造成的细胞损失应该抗衡了发酵中的细胞生长速度。调节用于连续发酵过程的营养物和生长因子的方法，以及用于使产品形成速度最大化的技术是微生物工业领域中公知的。
发酵之后，将醪液蒸馏以提取乙醇。根据本公开的方法所获得的乙醇可被用作，例如染料乙醇，饮用乙醇(即可饮用的中性酒精)或工业乙醇。来自发酵的剩余物是谷粒，其通常被用于动物饲料，以液体形式或是干燥的。关于如何进行熔解、糖化、发酵、蒸馏和回收乙醇的进一步细节是本领域技术人员公知的。根据本公开的方法，糖化和发酵可同时进行或分别进行。
5.用于烘焙和食物制备的组合物和方法
一方面提供了组合物，包括食物添加剂、食品、烘焙产品、改进剂组合物、饲料产品包括动物饲料等，所述组合物包含本文中所述的改变的变体，例如具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的那些；还提供了制备和使用所述多肽和所述组合物的方法。
如上文所述，本文所述的变体多肽可包含一个或多个改进的操作特性，优选改进的烘焙特性。因此，本文所述的变体多肽可使得经所述处理的食品具有下列的一项或多项(优选全部)：更低的硬度、更高的弹力、更高的粘结性、更低的破碎性或更高的可折叠性。在下文中进一步详述本文所述的变体多肽所展现的改进的操作或烘焙特性。一方面，提供了这样的变体，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比其半衰期(t1/2)(优选地在60℃)增加了15％或更多，优选50％或更多，最优选100％或更多。
一方面，提供了本文所述的变体，其中经所述变体处理的食品与经SEQ ID NO：1的氨基酸序列处理的食品相比具有下述任意一项或多项(优选全部)特性：(a)更低的硬度；(b)更高的弹力；(c)更高的粘结性；(d)更低的破碎性和(e)更高的可折叠性。
一方面，提供了本文所述的变体，其中与经SEQ ID NO：1的氨基酸序列处理的食品相比，所述食品的弹力、粘结性或可折叠性独立地增加了15％或更多、优选50％或更多、最优选100％或更多。
一方面，提供了本文所述的变体，其中与经SEQ ID NO：1的氨基酸序列处理的食品相比，经所述变体处理的食品的弹力、粘结性和可折叠性中的每一项都增加了。
一方面，提供了本文所述的变体，其中相对于经SEQ ID NO：1的氨基酸序列处理的食品，所述食品的硬度或破碎性独立地减少了15％或更多、优选50％或更多、最优选100％或更多。
一方面，提供了本文所述的变体，其中与经SEQ ID NO：1的氨基酸序列处理的食品相比，经所述多肽处理的食品的硬度和破碎性中的每一项都减少了。
一方面，提供了本文所述的变体，其包含如权利要求中所示的多肽的至少20个残基的片段，其中所述多肽具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性。
一方面，本文所述的变体具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性。可通过US 6,667,065中描述的方法可测定的活性，在此将US 6,667,065通过引用而并入。
一方面，提供了用所述多肽处理食品(特别是生面团和烘焙产品)从而使得所述食品展现出上文所述的所需品质。
一方面，提供了用于处理淀粉的方法，其包括用本文所述的变体接触淀粉和允许所述多肽从淀粉生成一个或多个线性产物。一方面，提供了用本文所述的变体制备食品或饲料产品的用途。一方面，提供了制备食品或饲料产品的方法，其包括将本文所述的变体与食物或饲料成分相混合。一方面，提供了用途或方法，其中食品包括生面团或生面团产品，优选经加工的生面团产品。一方面，提供了用途或方法，其中食品为烘焙食品。一方面，提供了制备烘焙产品的方法，其包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中加入本文所述的变体；和(c)在步骤(b)的过程中或之后向淀粉介质施热以生产烘焙产品。一方面，提供了通过权利要求中所定义的方法获得的食品、饲料产品、生面团产品或烘焙产品。
一方面，提供了本文所述的变体在生面团产品中用于延迟或减少所述生面团产品的陈化(优选有害的凝沉)的用途。
一方面，提供了本文所述的变体在生面团产品中用于改进所述生面团产品的下列任意一项或多项的用途：硬度、弹力、粘结性、破碎性或可折叠性。
一方面，提供了本文所述的变体的组合，其连同下列任意一种或多种：
(a)来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽生成性α-淀粉酶，也称为葡聚糖1，4-α-麦芽水解酶(EC 3.2.1.133)，或具有麦芽生成性α-淀粉酶活性的其变体、同源物或突变体；
(b)来自例如芽孢杆菌属、曲霉属(Aspergillus sp.)、嗜热真菌属(Thermomyces sp.)或木霉属(Trichoderma sp.)的烘焙木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；
(c)来自解淀粉芽孢杆菌或曲霉属的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，或具有α-淀粉酶活性的其变体、同源物或突变体；和
(d)脂肪酶，例如来自异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)的糖脂肪酶。
与亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)相比，本文所述的变体优选包含一个或多个改进的操作特性。所述改进的操作特性在优选的实施方式中可包括改进的烘焙特性。
因此，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ IDNOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体一方面使得经变体多肽处理的食品具有改进的操作(或优选烘焙)特性。所述操作或烘焙特性可选自：硬度、弹力、粘结性、破碎性和可折叠性。
可通过本领域已知的任何手段测试这些操作特性。例如，可通过使用例如质地分析仪由质地谱分析来分析面包切片而测定硬度、弹力和粘结性，如例如实施例11中所描述的。
硬度
与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体一方面使得经变体多肽处理的食品具有更低的硬度。
在优选的实施方式中，硬度与食品的柔软性反相关；因此，更高的柔软性可反映更低的硬度，反之亦然。
可通过实施例11中所示的“硬度评价方案”来测量硬度。
一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多的更低的硬度。与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，经本文所述的变体多肽处理的食品可具有1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更多的更低的硬度。
弹力
一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有更高的弹力。
可通过实施例11中所示的“弹力评价方案”测量弹力。
因此一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多的更高的弹力。与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，经变体多肽处理的食品可具有1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更多的更高的弹力。
粘结性
一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有更高的粘结性。
可通过实施例11中所示的“粘结性评价方案”来测量粘结性。
因此一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经本文所公开的变体多肽处理的食品具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多的更高的粘结性。与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，用变体多肽处理的食品可具有1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更多的更高的粘结性。
破碎性
一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有更低的破碎性。
可通过实施例13中所示的“破碎性评价方案”来测量破碎性。
因此一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多的更低的破碎性。与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，经变体多肽处理的食品可具有1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更多的更低的破碎性。
可折叠性
一方面，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有更高的可折叠性。
优选地，通过实施例14中所示的“可折叠性评价方案”来测量可折叠性。
因此，与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ IDNOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，本文所述的变体使得经变体多肽处理的食品具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多的更高的可折叠性。与经亲本多肽或野生型多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ IDNOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的食品相比，经变体多肽处理的食品可具有1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更多的更高的可折叠性。
一方面，提供了本文所描述的变体多肽与木聚糖酶相结合用于改进可折叠性的用途。
此外，提供了制备食品的方法，所述方法包括：(a)获得非麦芽生成性外切淀粉酶；(b)在所述非麦芽生成性外切淀粉酶的如本文所示的任意一个或多个位置引入突变；(c)将所产生的多肽与食物成分相混合。
可使用变体多肽来增加烘焙产品(例如面包)的体积。虽然不欲受任何特定理论所限，我们相信这是由于作为淀粉酶缩短直链淀粉分子的结果而在加热(例如烘焙)过程中生面团粘性的减少引起的。这使得由发酵产生的二氧化碳以更小的妨碍而增加面包的大小。
因此，与未经如此处理或经亲本多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQID NOs：2，4，6，8或10的多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽)处理的产品相比，包含变体多肽或经变体多肽处理的食品的体积扩大了。换言之，所述食品具有更大体积的空气/食品体积。备选地或此外，经本文所述的变体多肽处理的食品具有更低的密度或重量(或质量)/体积比率。在特别优选的实施方式中，所述变体多肽被用于增加面包的体积。体积增加或扩展是有益的，因为其减少了食物的胶粘性或淀粉性。消费者优选清淡的食物，并且消费者的体验提高了。在优选的实施方式中，使用变体多肽使体积增加10％，20％，30％40％，50％或更多。
本文所述的变体多肽和核酸可被用作食物或用于食物的制备。特别地，它们可被加入食物中，即作为食物添加剂。术语“食物”意在包括经制备的食物以及食物成分(例如面粉)。在优选的方面，食物是用于人类消费的。食物可以是溶液或固体的形式-取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
变体多肽和核酸可被用作食物成分。如本申请中所使用的，术语“食物成分”包括被加入或可被加入功能性食物或食料中的制剂，并且包括可以低水平在各种需要例如酸化或乳化的产品中使用的制剂。食物成分可以是溶液或固体的形式-取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
本文所公开的变体多肽和核酸可以是或可以被加至食物补充剂。本文公开的变体多肽和核酸可以是或可以被加至功能性食物。如本申请中所使用的，术语“功能性食物”指不仅能够提供营养效果和/或味道的满足，还能够向消费者递送其它有益效果的食物。虽然对于功能性食物没有法律定义，大多数关注此领域的方面都同意的是，它们是作为具有特定健康效果而面市的食物。
变体多肽还可被用于制造食品或食料。典型的食料包括乳产品、肉产品、禽产品、鱼产品和生面团产品。生面团产品可以是任何经加工的生面团产品，包括油炸的、深度油炸的、烤的、烘焙的、蒸的和煮的生面团，例如馒头和米糕。在非常优选的实施方式中，食品是烘焙产品。
优选地，食料是烘焙产品。典型的烘焙(烘烤的)产品包括面包-例如面包块、面包卷、果子面包、面包圈、披萨饼底等，点心、脆饼、玉米饼、蛋糕、小饼、饼干、脆饼干等。
所述食品优选地受益于本文所述的变体多肽的一个或多个改进的操作或烘焙特性。所述改进的操作或烘焙特性可选自：改进的硬度、改进的弹力、改进的粘结性、改进的破碎性和改进的可折叠性。
另一方面，提供了修饰包含非麦芽生成性外切淀粉酶的食物添加剂的方法，所述方法包括在本文中所示的非麦芽生成性外切淀粉酶的任意一个或多个位置引入突变。相同的方法可被用于修饰食物成分、或食物补充剂、食品或食料。
一方面，提供了能够延迟淀粉介质(例如淀粉凝胶)陈化的变体多肽的用途。所述变体多肽特别是能够延迟淀粉的有害的凝沉。
大多数淀粉颗粒是由两种聚合物的混合物组成的：基本上为线性的直链淀粉和高度分支的支链淀粉。支链淀粉是非常大的、分支的分子，其由通过(1-4)连接相连的α-D-吡喃葡萄糖基单元的链组成，其中所述链通过α-D-(1-6)连接附着以形成分支。支链淀粉存在于所有的天然淀粉中，构成约75％的最常见的淀粉。直链淀粉基本上是(1-4)连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的线性的链，具有少数α-D-(1-6)分支。大多数淀粉含有约25％直链淀粉。
在水的存在下被加热的淀粉颗粒经历被称作凝胶化的有序-无序相的转换，其中通过膨胀的颗粒摄取液体。凝胶化温度对于不同的淀粉是变化的。在新鲜烘焙的面包冷却后，直链淀粉级分在数小时内凝沉以形成网络。这一过程是有益的，在于其创造了具有低硬度和改进的切片特性的所需面包心结构。在烘焙后的若干天中，在凝胶化的淀粉颗粒内发生更逐渐的支链淀粉的结晶。人们相信，在此过程中支链淀粉强化了其中包埋了淀粉颗粒的直链淀粉网络。这种强化产生增加的面包心硬度。这种强化是面包陈化的主要原因之一。
已知烘焙产品的品质在存储过程中逐渐恶化。作为淀粉重结晶的结果(也称作凝沉)，面包心的保水能力被改变，对于感官和膳食特性具有重要意义。面包心失去柔软性和弹性并变得硬和易碎。面包心硬度的增加通常被用作面包陈化过程的量度。
支链淀粉有害凝沉的速度取决于支链淀粉侧链的长度。因此，支链淀粉侧链的酶促水解(例如通过本文所述的具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的变体多肽)可显著降低其结晶倾向。
因此，一方面通过在将淀粉加工为食品的任何阶段(例如在烘焙成为面包之前、之中或之后)将本文所述的变体多肽加入淀粉中而使用所述变体多肽可延迟或阻碍或减慢凝沉。此种应用在下文中进一步详细描述。
一方面，提供了改进非麦芽生成性外切淀粉酶防止生面团产品陈化(优选有害凝沉)的能力的方法，所述方法包括在本文所示的非麦芽生成性外切淀粉酶的任意一个或多个位置处引入突变。
为了评价变体多肽(例如本文所述的具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的变体)的抗陈化效果，可在烘焙后1、3和7天介由Instron 4301通用食物质地分析仪或本领域已知的类似设备测量面包心硬度。
在本领域中传统上使用的并用于评价变体多肽(例如具有外切淀粉酶活性的变体)对于淀粉凝沉的效果的另一种方法基于DSC(差示扫描量热法)。此处，测量的是含有或没有酶(对照)而烘焙的面包心或来自模式***生面团的面包心中凝沉的支链淀粉的熔化焓。所应用的DSC设备可以是从20至95℃以10℃/分钟的温度梯度运行的Mettler-Toledo DSC 820。为了制备样品，称取10-20mg面包心并转移到Mettler-Toledo铝锅中，然后将其密封。
模式***生面团可含有标准小麦粉和最佳量的水或缓冲剂，含有或不含有多肽变体。将它们在10g或50g的布拉班德粉质仪中分别混合6或7分钟。将生面团样品置于有盖的玻璃试管中(15*0.8cm)。使这些试管在水浴中经受烘焙过程，以33℃下30分钟的温育开始，然后以1.1℃/分钟的梯度从33℃加热至95℃，最后在95℃温育5分钟。随后，在DSC分析之前，将试管在20℃存储于恒温器中。
在一个实施方式中，本文所述的变体与对照相比具有降低的熔化焓。在另一个实施方式中，变体具有10％或更多的降低的熔化焓。在另一方面，与对照相比时，它们具有20％或更多，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多的降低的熔化焓。
一方面，提供了变体多肽在食品(特别是淀粉产品)制备中的用途。所述方法包括通过向淀粉介质中加入非麦芽生成性外切淀粉酶(例如变体多肽)而形成淀粉产品。如果所述淀粉介质为生面团，那么通过将面粉、水和非麦芽生成性外切淀粉酶(其为本文所述的变体多肽)以及任选地其它可能的成分和添加剂混合在一起而制备生面团。
术语“淀粉”应被认为是指淀粉本身或其组分，特别是支链淀粉。术语“淀粉介质”指包含淀粉的任何合适的介质。术语“淀粉产品”指含有淀粉、基于淀粉或源自淀粉的任何产品。优选地，所述淀粉产品含有或基于或源自由小麦面粉获得的淀粉。术语“面粉”，如本申请中所使用的，同义于小麦或其它谷粒的细磨粉。然而，优选地，此术语指获得自小麦本身而非来自另一种谷物的面粉。因此，除非另有表述，如本申请中所使用的，提及“小麦面粉”时优选是指小麦面粉本身以及存在于介质(例如生面团)中的小麦面粉。
优选的面粉是小麦面粉或黑麦粉或小麦和黑麦粉的混合。然而，也涉及包含源自其它谷物类型的面粉的生面团，所述其它谷物为例如稻、玉米、大麦和蜀黍。优选地，所述淀粉产品为烘焙产品。更优选地，所述淀粉产品为面包产品。甚至更优选地，所述淀粉产品为烘焙的含淀粉的面包产品。术语“烘焙的含淀粉的面包产品”是指任何基于生面团的烘焙产品，所述生面团可通过在形成生面团的条件下混合面粉、水和发酵剂而获得。当然可向生面团混合物中加入其它组分。
因此，如果淀粉产品是烘焙的含淀粉的面包产品，那么所述方法包括在形成面团的条件下(以任何合适的顺序)混合面粉、水和发酵剂，并且进一步添加本文所述的变体多肽，任选地以预混料的形式。发酵剂可以是化学发酵剂(例如碳酸氢钠)或酿酒酵母(面包酵母)的任何菌株。
本文所述的变体多肽可与任何生面团成分(包括水)或生面团成分混合物或任何添加剂或添加剂混合物一起加入。可通过烘焙工业或任何制备基于面粉生面团的产品的其它工业中常见的任何常规生面团制备方法来制备生面团。
烘焙含淀粉的面包产品(例如白面包、由低麸黑麦粉和小麦面粉制成的面包、面包卷等)通常是通过在180至250℃的温度范围内在烤箱中烘焙面包生面团约15至60分钟实现的。在烘焙过程中，陡的温度梯度(200℃至120℃)在外层生面团占优势，而在此形成烘焙产品的特征性外皮。然而，由于蒸汽产生造成的热消耗，面包心中的温度在烘焙过程结束时仅为接近100℃。
还提供了制备面包产品的方法，其包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中加入本文所述的变体多肽；和(c)在步骤(b)的过程中或之后向淀粉介质施热以生产面包产品。还提供了用于制作面包产品的方法，其包括向淀粉介质中加入本文所述的变体多肽。
一方面，所述变体多肽可作为液体制备物或作为干燥粉状组合物被加入，所述液体制备物或干燥粉状组合物包含所述酶作为单一的活性组分或者与一种或多种其它的生面团成分或生面团添加剂相混合。
另一方面，提供了改进剂组合物，这包括面包改进组合物和生面团改进组合物。这些包含变体多肽，任选地以及其它成分或其它的酶或二者皆有。
一方面，提供了用于生面团的改进剂组合物，其中所述改进剂组合物包含任一项权利要求中所示的变体和至少一种其它的生面团成分或生面团添加剂。
一方面，提供了包含面粉和任一项权利要求中所示的变体的组合物。
另一方面，提供了所述面包和生面团改进组合物在烘焙中的用途。另一方面，提供了由所述面包改进组合物或生面团改进组合物获得的烘焙产品或生面团。另一方面，提供了由所述面包改进组合物或生面团改进组合物的应用所获得的烘焙产品或生面团。
可通过混合面粉、水、包含变体多肽(如上所述)和任选地其它成分和添加剂的生面团改进组合物而制备生面团。
所述生面团改进组合物可与任何生面团成分(包括面粉、水或任选的其它成分或添加剂)一起被加入。可在面粉或水或任选的其它成分和添加剂之前加入生面团改进组合物。可在面粉或水或任选的其它成分和添加剂之后加入生面团改进组合物。可通过烘焙工业或任何制备基于面粉生面团的产品的其它工业中常见的任何常规生面团制备方法来制备生面团。
生面团改进组合物可作为液体制备物或作为干粉组合物被加入，所述液体制备物或干粉组合物包含所述组分作为单一的活性组分或者与一种或多种其它的生面团成分或添加剂相混合。
所加入的变体多肽的量通常为这样的量：其使得在完成的生面团中存在50至100,000单位/kg面粉，优选100至50,000单位/kg面粉。优选地，所述量的范围为200至20,000单位/kg面粉。备选地，所加入的变体多肽的量使得在完成的生面团中基于面粉存在0.02-50ppm的酶(0.02-50mg酶/kg面粉)，优选0.2-10ppm。
在当前的情境中，1个单位的非麦芽生成性外切淀粉酶被定义为这样的酶量：如下文所述，当在50℃、在含有4ml 10mg/ml蜡质玉米淀粉(在50mM MES、2mM氯化钙，pH 6.0中)的试管中温育时，其释放的水解产物等于1μmol还原糖/分钟。
本文所述的生面团通常包含小麦粉或小麦面粉和/或其它类型的粉、面粉或淀粉，例如玉米面粉、玉米淀粉、玉米面粉、米粉、黑麦粉、黑麦面粉、燕麦面粉、燕麦粉、大豆粉、高粱粉、高粱面粉、马铃薯粉、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。生面团可以是新鲜的、冷冻的或部分烘焙的。
生面团可以是发酵的生面团或将被发酵的生面团。可以各种方式发酵生面团，例如通过加入化学发酵剂(例如碳酸氢钠)或通过加入酵素(发酵的生面团)，但是优选的是通过加入合适的酵母培养物来发酵生面团，所述培养物为例如酿酒酵母(面包酵母)的培养物，例如商业上可得的酿酒酵母菌株。
生面团可包含脂肪，例如颗粒状的脂肪或起酥油。生面团还可包含其它的乳化剂，例如甘油单酯或甘油二酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的聚甘油酯，单甘油乳酸酯，单甘油乙酸酯，聚氧乙烯硬脂酸酯或溶血卵磷脂。
还提供了包含面粉以及本文所述的组合的预混料。所述预混料可含有其它的生面团改进和/或面包改进添加剂，例如本文中提及的任何添加剂，包括酶。
为了进一步改进烘焙产品的特性并给予烘焙产品出众的品质，可将其它生面团成分和/或生面团添加剂掺入生面团中。通常，这种进一步加入的组分可包括生面团成分，例如盐、谷粒、脂肪和油、糖或甜味剂、膳食纤维、蛋白质来源(例如奶粉、谷蛋白、大豆或蛋)和生面团添加剂(例如乳化剂、其它的酶、水状胶质、调味剂、氧化剂、矿物质和维生素)。
乳化剂可用作生面团强化剂以及面包心柔软剂。作为生面团强化剂，乳化剂可以提供关于静置时间的耐受和在醒发过程中对于震动的耐受。此外，生面团强化剂将改进给定的生面团对于发酵时间的变化的耐受。大多数生面团强化剂还改进烤焙弹性，这是指从醒发物至烘焙物的体积的增加。最后，生面团强化剂将乳化配方混合物中存在的任何脂肪。
合适的乳化剂包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、可食用脂肪酸的甘油单酯和二甘油脂、可食用脂肪酸的单甘油乙酸酯和二甘油乙酸酯、可食用脂肪酸的单甘油乳酸酯和二甘油乳酸酯、可食用脂肪酸的单甘油柠檬酸酯和二甘油柠檬酸酯、可食用脂肪酸的单甘油双乙酰酒石酸酯和二甘油双乙酰酒石酸酯、可食用脂肪酸的蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸钠和硬脂酰-2-乳酸钙。
其它的生面团添加剂或成分可以与包括下列的任何生面团成分一起加入：面粉、水或任选的其它成分或添加剂，或者生面团改进组合物。所述其它的生面团添加剂或成分可在面粉、水、任选的其它成分和添加剂，或生面团改进组合物之前被加入。所述其它的生面团添加剂或成分可在面粉、水、任选的其它成分和添加剂、或生面团改进组合物之后被加入。
所述其它的生面团添加剂或成分可方便地为液体制备物。然而，所述其它的生面团添加剂或成分可方便地是干组合物的形式。
一方面，所述其它生面团添加剂或成分是生面团面粉组分的重量的至少1％。另一方面，所述其它的生面团添加剂或成分为至少2％，优选至少3％，优选至少4％，优选至少5％，优选至少6％。如果添加剂为脂肪，那么通常脂肪存在的量可以是1至5％，通常为1至3％，更典型地为约2％。
对于商业和家庭使用面粉来烘焙和生产食品而言，重要的是在面粉中保持适当水平的α-淀粉酶活性。过高水平的活性可引起粘性的和/或半熟的产品，因而是不能上市的。具有不足的α-淀粉酶活性的面粉可能不含有足够的糖用于适当的酵母功能，从而产生干燥、易碎的面包或烘焙产品。因此，本文所述的变体(以其自身或与另一种α-淀粉酶或另一种变体相组合)可被加入面粉中以提高面粉中内源性α-淀粉酶活性的水平。在这种实施方式中的变体在淀粉存在时、在例如约30-90℃，40-80℃，40-50℃，45-65℃或50-60℃的范围内可具有温度最佳值。在可溶性淀粉的1％溶液中，pH最佳值可以在例如pH 4.5至6.0之间。
谷粒(例如大麦、燕麦、小麦)以及植物组分(例如谷物、啤酒花和稻)也可用于酿造，既是在工业中也用于家庭酿造。酿造中所使用的组分可以是未麦芽化的或麦芽化的(即部分萌芽的)，从而引起酶(包括α-淀粉酶)水平的增加。为了成功的酿造，需要足够水平的α-淀粉酶活性以确保适当水平的糖用于发酵。因此可将变体(以其自身或与另一种α-淀粉酶相组合)加入用于酿造的组分中。
如本申请中所使用的，术语“面粉”是指经研磨的或磨碎的谷物谷粒。术语“面粉”也可指被磨碎或捣碎的西米或块茎产品。在一些实施方式中，面粉还可含有除了研磨的或捣碎的谷物或植物物质之外的组分。其它组分的实例(虽然不欲是限制性的)是发酵剂。谷物谷粒包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品包括木薯面粉、木薯粉和吉士粉。术语“面粉”还包括磨碎的玉米面粉、玉米粉、米粉、全谷粉、自发粉、木薯面粉、木薯粉、磨碎的稻、富集的花和吉士粉。
如本申请中所使用的，术语“原料”指压碎或破碎的谷粒和植物组分。例如，在啤酒生产中所使用的大麦被粗研或压碎以产生适于生产发酵用醪液的稠度的谷粒。如本申请中所使用的，术语“原料”包括压碎或粗研形式的任何前述类型的植物和谷粒。本文所述的方法可用于在面粉和原料两者中确定α-淀粉酶的活性水平。
可与本文所述的变体多肽结合使用一种或多种其它的酶。此种组合可例如被加入食物、生面团制备物、食料或淀粉组合物中。
烘焙淀粉酶可以来自真菌、细菌或植物。其可以是α-淀粉酶(EC3.2.1.1)。α-淀粉酶可以是来自曲霉属或木霉属(例如来自米曲霉(Aspergillus oryzae))的真菌α-淀粉酶。或者其可以是来自芽孢杆菌(例如解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌)的α-淀粉酶。或者其可以是植物β淀粉酶(EC 3.2.1.2)，例如来自大麦麦芽或大豆的β淀粉酶。或者其可以是用于抗陈化的外切淀粉酶，例如由嗜糖假单胞菌产生的非麦芽生成性外切淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麦芽四糖水解酶(SEQ ID NO：10)、或由嗜热脂肪芽孢杆菌产生的麦芽生成性淀粉酶(EC 3.2.1.133)，如下文中进一步描述的。
一方面，所述其它的淀粉酶为麦芽生成性α-淀粉酶。″麦芽生成性α-淀粉酶″(葡聚糖1，4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解为α构型的麦芽糖。来自芽孢杆菌的麦芽生成性α-淀粉酶(EP 120 693)是商业上可得的，商品名为Novamyl(Novozymes，丹麦)并且由于其减少淀粉凝沉的能力而被广泛用于烘焙工业中作为抗陈化剂。Novamyl在国际专利公布WO 91/04669中被详细描述。麦芽生成性α-淀粉酶Novamyl与环糊精葡聚糖转移酶(CGTases)共享数个特征，包括序列同源性(Henrissat B，Bairoch A；Biochem.J.，316，695-696(1996))和形成转糖基作用产物(Christophersen，C.，等人，1997，Starch，vol.50，No.1，39-45)。Novamyl可特别包括Novamyl 1500MG。其它描述Novamyl及其用途的文献包括Christophersen，C.，Pedersen，S.，和Christensen，T.，(1993)Method for production ofmaltose an a limit dextrin，the limit dextrin，and use of the limitdextrin，丹麦；和WO 95/10627。其在U.S.Pat.No.4,598,048和U.S.Pat.No.4,604,355中也被进一步描述了。抗陈化淀粉酶的优选的实例是外切淀粉酶，例如由嗜糖假单胞菌产生的非麦芽生成性外切淀粉酶或G4-淀粉酶(EC 3.2.1.60)，具有SEQ ID NO：1的麦芽四糖水解酶，或具有SEQ ID NO：51的由嗜热脂肪芽孢杆菌产生的麦芽生成性淀粉酶(EC 3.2.1.133)。
相对于没有酶的对照，抗陈化淀粉酶在烘焙后减少陈化并在烘焙后的第1天至第7天引起硬度增加的减少及弹力下降的减少。可通过进行烘焙试验和利用质地分析来测定硬度和弹力随时间的发展，而对抗陈化淀粉酶进行测定。实施例11中描述了质地分析。
其它的酶可选自例如，下列的任意组合：(a)Novamyl，或具有麦芽生成性α-淀粉酶活性的其变体、同源物或突变体；(b)木聚糖酶，例如GRINDAMYLTM POWERBake 900(Danisco A/S)；(c)细菌α-淀粉酶，例如Max-Life U4(Danisco A/S)；和(d)脂肪酶，例如GRINDAMYLTMPOWERBake 4050(Danisco A/S)。
在一个实施方式中，本文所述的变体多肽与至少一种选自下列的酶组合使用：氧化还原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂氧合酶。在一个实施方式中，所述组合物包含至少一种本文所述的变体多肽和来自芽孢杆菌的麦芽生成性淀粉酶(如WO91/04669中所公开的)。一个实施方式包括本文所述的变体多肽和面粉。
可加入生面团中的其它的酶包括氧化还原酶、水解酶、例如脂肪酶和酯酶，以及糖苷酶，例如α-淀粉酶、支链淀粉酶和木聚糖酶。氧化还原酶(例如葡糖氧化酶和己糖氧化酶)可被用于生面团强化和控制烘焙产品的体积，而可加入木聚糖酶和其它半纤维素酶以改进生面团操作特性、面包心硬度和面包体积。脂肪酶可用作生面团强化剂和面包心柔软剂，而α-淀粉酶和其它的淀粉水解酶可被掺入生面团中以控制面包体积和进一步减少面包心硬度。
可使用的其它的酶可选自：纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶、脂氧合酶。
本文所定义的变体还可被单独加入或与其它淀粉酶(包括其它淀粉酶变体)组合加入以防止或延迟陈化(即烘焙产品面包心的硬化)。抗陈化淀粉酶的量将通常在0.01-10mg酶蛋白/kg面粉的范围内，例如0.5mg/kg ds。其它可与本文所述的变体多肽组合使用的抗陈化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌的细菌内切淀粉酶。所述其它的淀粉酶可以是麦芽生成性α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌的。Novamyl
Figure BDA0000109684100000571
是来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的示例性的麦芽生成性α-淀粉酶并且被描述于Christophersen等人，Starch 50：39-45(1997)。抗陈化内切淀粉酶的其它实例包括源自芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌)的细菌α-淀粉酶。所述抗陈化淀粉酶可以是外切淀粉酶，例如β-淀粉酶，例如来自植物来源(例如大豆)，或来自微生物来源(例如芽孢杆菌)。
包含本文所述的变体多肽的烘焙组合物还可包含磷脂酶。所述磷脂酶可具有A1或A2活性以从磷脂上去除脂肪酸从而形成溶血磷脂。其可具有或可没有脂肪酶活性，即对于甘油三酯底物的活性。磷脂酶通常在30-90℃(例如30-70℃)的范围内具有温度最佳值。所加入的磷脂酶可以是动物来源的，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)、蛇毒或蜂毒。备选地，磷脂酶可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如属或种。磷脂酶的示例性来源包括曲霉属(Aspergillus)，黑曲霉(A.niger)；网柄菌属(Dictyostelium)，盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉菌属(Mucor)，爪哇毛霉菌(M.javanicus)，蜂毛霉菌(M.mucedo)，细孢毛霉(M.subtilissimus)；链孢霉属(Neurospora)，粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉菌属(Rhizomucor)，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉菌属(Rhizopus)，少根根霉菌(R.arrhizus)，日本根霉(R.japonicus)，匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，白腐核盘霉(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)，红色毛癣菌(T.rubrum)；Whetzelinia，W.sclerotiorum；芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，枯草芽孢杆菌；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，产气肠杆菌(E.aerogenes)，阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Etwinia)，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，大肠杆菌；克雷伯菌属(Klebsiella)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门菌属(Salmonella)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷菌属(Serratia)，S.liquefasciens，粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺菌属(Shigella)，弗氏志贺菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，S.violeceoruber；耶尔森菌属(Yersinia)，小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)；镰刀菌属(Fusarium)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(例如菌株DSM 2672)。
所加入的磷脂酶的量在烘焙后起初的阶段中改进面包的柔软性，特别是在最初的24小时中。磷脂酶的量将通常在约0.01-10mg酶蛋白/kg面粉的范围中，例如0.1-5mg/kg。磷脂酶活性通常将在约20-1000脂肪酶单位(LU)/kg面粉的范围内，其中脂肪酶单位被定义为以***胶作为乳化剂和三丁酸甘油酯作为底物，在30℃、pH 7.0时释放1μmol丁酸/分钟所需的酶的量。
生面团的组合物通常包含小麦粉或小麦面粉和/或其它类型的粉、面粉或淀粉，例如玉米面粉、玉米淀粉、黑麦粉、黑麦面粉、燕麦面粉、燕麦粉、大豆粉、高粱粉、高粱面粉、马铃薯粉、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。生面团可以是新鲜的、冷冻的或部分烘焙的。生面团可以是发酵的生面团或将被发酵的生面团。可以各种方式发酵生面团，例如通过加入化学发酵剂(例如碳酸氢钠)或通过加入酵素(发酵的生面团)。还可通过加入合适的酵母培养物来发酵生面团，所述培养物为例如酿酒酵母(面包酵母)的培养物，例如商业上可得的酿酒酵母菌株。
生面团还可包含其它常规的生面团成分，例如蛋白质(例如奶粉、谷蛋白和大豆)；蛋(例如全蛋、蛋黄或蛋白)；氧化剂，例如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸例如L-半胱氨酸；糖；或盐，例如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。生面团还可包含脂肪，例如甘油三酯，例如颗粒脂肪或起酥油。生面团还可包含乳化剂，例如甘油单酯或甘油二酯、单甘油双乙酰酒石酸酯和二甘油双乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、单甘油乳酸酯、单甘油乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或溶血卵磷脂。特别地，可不添加乳化剂而制备生面团。
任选地，可与抗陈化淀粉酶和磷脂酶一起使用其它的酶。所述其它的酶可以是第二种淀粉酶，例如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶；或者所述其它的酶可以是肽酶(特别是外切肽酶)、转谷酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、特别是戊聚糖酶(例如木聚糖酶)、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶(例如，WO 95/00636中所公开的蛋白质二硫键异构酶)、例如糖基转移酶、分支酶(1，4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或氧化还原酶，例如过氧化物酶、漆酶、葡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶或碳水化合物氧化酶。所述其它的酶可以是任意来源的，包括哺乳动物和植物，并且特别是微生物(细菌、酵母或真菌)来源的，并且可通过本领域中常规使用的技术获得。
木聚糖酶通常是微生物来源的，例如源自细菌或真菌，例如曲霉属菌株，特别是棘孢曲霉(A.aculeatus)，黑曲霉(A.niger)(参见WO 91/19782)，泡盛曲霉(A.awamori)(例如，WO 91/18977)或A.tubigensis(例如，WO 92/01793)；来自木霉属的菌株，例如瑞氏木霉(T.reesei)或来自腐质霉属(Humicola)的菌株，例如特异腐质霉(H.insolens)(例如，WO 92/17573)。Pentopan和Novozym 384
Figure BDA0000109684100000592
是由瑞氏木霉产生的商业上可得的木聚糖酶制备物。淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(例如AMG
Figure BDA0000109684100000593
)。其它有用的淀粉酶产品包括Grindamyl
Figure BDA0000109684100000594
A 1000或A 5000(可获得自Danisco，丹麦)和淀粉酶H或淀粉酶
Figure BDA0000109684100000596
P(可获得自Gist-Brocades，荷兰)。葡糖氧化酶可以是真菌葡糖氧化酶，特别是黑曲霉葡糖氧化酶(例如Gluzyme
Figure BDA0000109684100000601
)。示例性的蛋白酶是Neutrase
Figure BDA0000109684100000602
示例性的脂肪酶可源自嗜热真菌属(腐质霉属)、根毛霉属、念珠菌属(Candida)、曲霉属、根霉属(Rhizopus)或假单胞菌属的菌株，特别是来自米曲霉(Thermomyces lanuginosus)(Humicola lanuginosa)，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)，南极念珠菌(Candida antarctica)，黑曲霉，德氏根霉(Rhizopus delemar)或少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)或洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)。在特定的实施方式中，脂肪酶可以是例如WO 88/02775中所描述的源自南极念珠菌的脂肪酶A或脂肪酶B，或者脂肪酶可以例如源自EP 238,023中所描述的米赫根毛霉，或例如EP 305,216中所描述的Humicola lanuginosa，或例如EP 214,761和WO 89/01032中所描述的洋葱假单胞菌。
所述方法可用于任何种类的由生面团制备的烘焙产品，无论是柔软还是酥脆特征的，无论是白色、浅色还是深色类型。实例是面包，特别是白面包、全麦或黑麦面包，通常以面包块或面包卷的形式，例如但不限于法棍型面包、皮塔面包、玉米饼、蛋糕、煎饼、饼干、小点心、馅饼皮、薄脆饼干、馒头、披萨饼等。
在另一个实施方式中，本文所述的变体多肽可被用于预混料中，所述预混料包含面粉以及抗陈化淀粉酶、磷脂酶和磷脂。所述预混料可含有其它生面团改进和/或面包改进添加剂，例如上文提及的任何添加剂，包括酶。一方面，本文所述的变体多肽是包含抗陈化淀粉酶和磷脂酶的酶制备物的组分，用作烘焙添加剂。
所述酶制备物任选地是颗粒或成块粉末的形式。所述制备物可具有窄的粒径分布，其中超过95％(按重量)的颗粒在25至500μm的范围内。颗粒和成块粉末可通过常规方法制备，例如通过在流化床制粒机中将本文所述的变体多肽喷洒到载体上。所述载体可由具有合适粒径的颗粒核心组成。所述载体可以是可溶或不可溶的，例如盐(例如NaCl或硫酸钠)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米粗砾或大豆。
另一方面涉及包被包含本文所述的变体多肽的颗粒，即α-淀粉酶颗粒。为了制备经包被的α-淀粉酶颗粒，使酶与足够量的食物级脂接触以悬浮所有的α-淀粉酶颗粒。食物级脂，如本申请中所使用的，可以是不溶于水但可溶于非极性有机溶剂中的任何天然有机化合物，例如碳氢化合物或二乙基醚。合适的食物级脂包括但不限于甘油三酯，其为饱和或不饱和的脂肪或油的形式。构成饱和甘油三酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于酪的(源自乳脂)、棕榈油的(源自动物和植物脂肪)和/或硬脂的(源自动物和植物脂肪)。构成不饱和甘油三酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于棕榈油酸的(源自动物和植物脂肪)、油酸的(源自动物和植物脂肪)、亚麻油酸的(源自植物油)和/或亚麻酸的(源自亚麻籽油)。其它合适的食物级脂包括但不限于，衍生自上述甘油三酯的单甘油酯和甘油二酯、磷脂和糖酯。
食物级脂(特别是液体形式的)与粉末形式的α-淀粉酶颗粒接触的方式使得脂材料覆盖至少大多数(例如100％)的α-淀粉酶颗粒的表面的至少一部分。因此，每个α-淀粉酶颗粒独立地在液体中被包被。例如向全部或基本上全部的α-淀粉酶颗粒提供薄的、连续的液体包被膜。这可通过首先向容器中倒入一定量的液体，然后使α-淀粉酶颗粒浆化从而使脂质完全润湿每个α-淀粉酶颗粒的表面而实现。短时间的搅拌之后，回收在其表面上携带大量脂质的经包被的α-淀粉酶颗粒。需要的时候，可通过选择所使用的脂的类型和通过重复所述操作以构建更厚的膜来控制如此施于α-淀粉酶颗粒上的涂层的厚度。
可介由包装混合(packaged mix)来实现对所加载的递送媒介的储存、操作和掺入。所述包装混合可包含经包被的α-淀粉酶。然而，所述包装混合还可含有制造商或面包师所需的其它成分。当将经包被的α-淀粉酶掺入生面团中之后，面包师继续进行对于所述产品的正常生产过程。
包被α-淀粉酶颗粒的优势是双重的。首先，对于热不稳定的酶而言，食物级脂保护所述酶在烘焙过程中不被热变性。因此，虽然α-淀粉酶在醒发和烘焙阶段被稳定和保护，其在最终的烘焙产品中从保护性涂层中被释放，其在那里水解聚葡萄糖中的葡糖苷连接。所加载的递送媒介还提供向烘焙产品中缓释活性酶。也即，烘焙过程之后，以对抗因而降低陈化机制速度的速度从保护性涂层中持续释放活性α-淀粉酶。
一般地，施用于α-淀粉酶颗粒上的脂质的量可在α-淀粉酶总重量的几个百分比至所述重量的许多倍之间变化，取决于脂质的性质、其被施用于α-淀粉酶颗粒上的方式、待处理的生面团混合物的组成和所涉及的生面团混合操作的激烈性。
加入用于制备烘焙产品的成分中的所加载的递送媒介(即经脂质包被的酶)的量，为延长所述烘焙产品的存架期的有效量。面包师计算实现所期望的抗陈化效果将需要的如上所述制备的经包被的α-淀粉酶的量。基于被包被的酶的浓度和α-淀粉酶与特定面粉的比例计算所需的经包被的α-淀粉酶的量。已发现大范围的浓度是有效的，虽然如所讨论的，在抗陈化方面可观察到的改进并不线性地对应于α-淀粉酶的浓度，在某个最低水平之上α-淀粉酶浓度的大幅增加产生很小的进一步改进。实际用于特定烘焙生产中的α-淀粉酶浓度可以比所需的最小值高很多，从而为面包师提供一些保证以对抗面包师的无意测量不足错误。酶浓度的下限是由面包师所希望实现的最小抗陈化效果决定的。
用于制备烘焙产品的方法可包括：(a)制备脂涂覆的α-淀粉酶颗粒，其中基本上全部α-淀粉酶颗粒都是经涂覆的；(b)混合含有面粉的生面团；(c)在混合完成之前向所述生面团中加入所述脂涂覆的α-淀粉酶并且在从α-淀粉酶上去除脂涂层之前终止混合；(d)醒发所述生面团；和(e)烘焙所述生面团以提供烘焙产品，其中在混合、醒发和烘焙阶段α-淀粉酶是无活性的，而其在烘焙的产品中是有活性的。
可在混合循环过程中将经包被的α-淀粉酶加入生面团中，例如在接近混合循环结束的时候。在允许经包被的α-淀粉酶在整个生面团中充分分布的混合阶段中的时刻加入经包被的α-淀粉酶；然而，在保护性涂层从α-淀粉酶颗粒上被剥脱之前终结混合阶段。根据生面团的类型和体积、混合器的作用和速度，可能需要1-6分钟或更长的时间来将经包被的α-淀粉酶混合到生面团中，但是2-4分钟是平均值。因此，数个变量可确定准确的程序。首先，经包被的α-淀粉酶的量应具有的总体积足以允许经包被的α-淀粉酶被散布在整个生面团混合物中。如果经包被的α-淀粉酶的制备物是高度浓缩的，可能需要在将经包被的α-淀粉酶加入生面团中之前，向预混料中加入其它的油。配方和生产方法可能需要特别的修饰；然而，当面包生面团制剂中指定的油的25％被保留在生面团之外并被用作浓缩的经包被的α-淀粉酶的载体而在接近混合循环结束时被加入时，通常可以达到好的结果。在面包或其它烘焙产品中(特别是具有低脂肪含量的那些，例如法式面包)，干面粉重量的大约1％的经包被的α-淀粉酶混合物就足以使经包被的α-淀粉酶与生面团适当混合。合适百分比的范围是宽的，并且取决于个体面包师对制剂、完成的产品和生产方法的要求。第二，经包被的α-淀粉酶悬浮物应以足够的时间被加入混合物中以完全混合到生面团中，但是所述时间不会使得过度的机械作用将保护性脂涂层从经包被的α-淀粉酶颗粒上刮掉。
6.纺织品脱浆组合物及用途
还涉及的是利用本文所述的变体多肽来处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。一方面，提供了使纺织品脱浆的方法，其包括使本文所述的变体多肽与纺织品接触足够的时间以使纺织品脱浆。
织物处理方法是本领域中公知的(参见例如，美国专利No.6,077,316)。例如，一方面通过下述方法改进了织物的感觉和外观，所述方法包括使织物接触溶液中的本文所述的变体多肽。一方面，在压力下用所述溶液处理织物。
一方面，在纺织品编织的过程之中或之后、或在脱浆阶段中、或在一个或多个其它的织物处理步骤中施用本文所述的变体多肽。在纺织品的编织中，使线暴露于可观的机械应变。在机械织机上编织之前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织之中或之后施用本文所述的变体多肽以去除这些上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，本文所述的变体多肽可在进一步处理织物之前被用于去除浆涂层以确保均一和耐洗的结果。
本文所述的变体多肽可单独使用或与其它脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为去污剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。本文所述的变体多肽也可被用于在靛蓝牛仔织物和衣服上产生砂洗样子的组合物和方法。对于服装生产而言，所述织物可被裁剪和缝制成为服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，使棉更易于进行随后的酶促精整步骤。本文所公开的变体多肽可用于下列方法中：精整牛仔衣服(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整方法。
本发明的其它实施方式
1.具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有
a.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置处的一个或多个氨基酸取代：88或205，和/或
b.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：16，48，97，105，235，240，248，266，311，347，350，362，364，369，393，395，396，400，401，403，412或409，和/或
c.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含一个或多个下列氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D，392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G或399C/H，和/或
d.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：44，96，204，354或377，和/或
e.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代：392S，
其中氨基酸取代是相对于SEQ ID NO：1的相应氨基酸，而位置是参考SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
2.具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置处的一个或多个氨基酸取代：88或205和/或包含一个或多个下列氨基酸取代：42K，235H/K/R，240E，392K/D/E/Y或409E，其中氨基酸取代是相对于SEQ ID NO：1的相应氨基酸，而位置是参考SEQID NO：1所示的序列的位置编号。
3.根据实施方式1的多肽，其中所述多肽包含在下列位置处的一个或多个氨基酸取代：88，205，235，240，248，266，311，377或409和/或包含一个或多个下列氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
4.根据实施方式1和3中任一项的多肽，其中所述多肽包含在下列位置处的一个或多个氨基酸取代：88，205，235，240，311或409和/或包含一个或多个下列氨基酸取代：42K/N/I/H/F，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
5.根据实施方式1和3-4中任一项的多肽，其中所述多肽在四个、五个或全部下列位置中包含氨基酸取代：88，205，235，240，311或409和/或具有至少一个或两个下列氨基酸取代：42K/N/I/H/F，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
6.根据实施方式1-5中任一项的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个下列氨基酸：33Y，34N，70D，121F，134R，141P，146G，157L，161A，178F，179T，223E/S/K/A，229P，307K，309P或334P。
7.根据实施方式1-6中任一项的多肽，其中所述多肽还具有下列氨基酸：33Y，34N，70D，121F，134R，141P，146G，157L，161A，178F，179T，229P，307K，309P和334P。
8.根据实施方式1-6中任一项的多肽，其中所述多肽具有至少一个实施方式1的b)中的氨基酸取代并且还包含下列位置处的一个或多个氨基酸取代：44，96，204，354或377。
9.根据实施方式1-8中任一项的多肽，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％的序列同一性。
10.根据实施方式1-9中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸34Q。
11.根据实施方式1和2-10中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸42K/F/H/I/N/A/V。
12.根据实施方式1和2-10中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸42K/F/H/I/N。
13.根据实施方式1-12中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸42K。
14.根据实施方式1-13中任一项的多肽，其中所述多肽在位置88包含氨基酸取代。
15.根据实施方式1-14中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸88L/Y/K。
16.根据实施方式1-15中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸88L。
17.根据实施方式1-16中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸88Y。
18.根据实施方式1-17中任一项的多肽，其中所述多肽在位置205包含氨基酸取代。
19.根据实施方式1-18中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸205L/K/M/N/Q/R/V/Y。
20.根据实施方式1-19中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸205L/K/M/N/Q/R/V。
21.根据实施方式1-20中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸205L。
22.根据实施方式1和2-21中任一项的多肽，其中所述多肽在位置235包含氨基酸取代。
23.根据实施方式1和2-22中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235H/K/R/Q/S。
24.根据实施方式1和2-23中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235H/K/R/Q。
25.根据实施方式2或24的多肽，其中所多肽具有氨基酸235H/K/R。
26.根据实施方式2或25的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235R。
27.根据实施方式2或25的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235H。
28.根据实施方式2或25的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235K。
29.根据实施方式1和2-28中任一项的多肽，其中所述多肽在位置240包含氨基酸取代。
30.根据实施方式29的多肽，其中所述多肽具有氨基酸240E/H/M/D/S。
31.根据实施方式29的多肽，其中所述多肽具有氨基酸240E/H/M/D。
32.根据实施方式2或29的多肽，其中所述多肽具有氨基酸240E。
33.根据实施方式1-32中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸272D。
34.根据实施方式1-33中任一项的多肽，其中所述多肽在位置311包含氨基酸取代。
35.根据实施方式2或34的多肽，其中所述多肽具有氨基酸311P。
36.根据实施方式1和2-35中任一项的多肽，其中所述多肽在位置409包含氨基酸取代。
37.根据实施方式36的多肽，其中所述多肽具有氨基酸409H/Q/T/E。
38.根据实施方式2或37的多肽，其中所述多肽具有氨基酸409E。
39.根据实施方式1-38中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸100Q/K/N/R。
40.根据实施方式39的多肽，其中所述多肽具有氨基酸100Q。
41.根据实施方式1和2-39中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T/G。
42.根据实施方式41的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T。
43.根据实施方式2或41的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392D/E/K/Y。
44.根据实施方式43的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392D。
45.根据实施方式43的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392E。
46.根据实施方式43的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392K。
47.根据实施方式43的多肽，其中所述多肽具有氨基酸392Y。
48.根据实施方式1-47中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸中的两者：235R和311P。
49.根据实施方式1-48中任一项的多肽，其中所述多肽在位置16包含氨基酸取代。
50.根据实施方式49的多肽，其中所述多肽具有氨基酸16/A/E/K。
51.根据实施方式1-50中任一项的多肽，其中所述多肽在位置48包含氨基酸取代。
52.根据实施方式51的多肽，其中所述多肽具有氨基酸48/C/L。
53.根据实施方式1-52中任一项的多肽，其中所述多肽在位置97包含氨基酸取代。
54.根据实施方式1-53中任一项的多肽，其中所述多肽在位置105包含氨基酸取代。
55.根据实施方式54的多肽，其中所述多肽具有氨基酸105/N/R。
56.根据实施方式1-55中任一项的多肽，其中所述多肽在位置248包含氨基酸取代。
57.根据实施方式1-56中任一项的多肽，其中所述多肽在位置266包含氨基酸取代。
58.根据实施方式1-57中任一项的多肽，其中所述多肽在位置347包含氨基酸取代。
59.根据实施方式58的多肽，其中所述多肽具有氨基酸347/C/D/H/K。
60.根据实施方式1-59中任一项的多肽，其中所述多肽在位置350包含氨基酸取代。
61.根据实施方式60的多肽，其中所述多肽具有氨基酸350E/H/N。
62.根据实施方式1-61中任一项的多肽，其中所述多肽在位置354包含氨基酸取代。
63.根据实施方式62的多肽，其中所述多肽具有氨基酸354D/E。
64.根据实施方式1-63中任一项的多肽，其中所述多肽在位置362包含氨基酸取代。
65.根据实施方式64的多肽，其中所述多肽具有氨基酸362E/H/P。
66.根据实施方式1-65中任一项的多肽，其中所述多肽在位置364包含氨基酸取代。
67.根据实施方式66的多肽，其中所述多肽具有氨基酸364E/K/NQ。
68.根据实施方式1-67中任一项的多肽，其中所述多肽在位置369包含氨基酸取代。
69.根据实施方式68的多肽，其中所述多肽具有氨基酸369I/N。
70.根据实施方式1-69中任一项的多肽，其中所述多肽在位置377包含氨基酸取代。
71.根据实施方式1-70中任一项的多肽，其中所述多肽在位置393包含氨基酸取代。
72.根据实施方式71的多肽，其中所述多肽具有氨基酸393D/E/K。
73.根据实施方式1-72中任一项的多肽，其中所述多肽在位置395包含氨基酸取代。
74.根据实施方式73的多肽，其中所述多肽具有氨基酸395C/E/K。
75.根据实施方式1-74中任一项的多肽，其中所述多肽在位置396包含氨基酸取代。
76.根据实施方式75的多肽，其中所述多肽具有氨基酸396D/E。
77.根据实施方式1-76中任一项的多肽，其中所述多肽在位置399包含氨基酸取代。
78.根据实施方式77的多肽，其中所述多肽具有氨基酸399C/H。
79.根据实施方式1-78中任一项的多肽，其中所述多肽在位置400包含氨基酸取代。
80.根据实施方式79的多肽，其中所述多肽具有氨基酸400S/W。
81.据实施方式1-80中任一项的多肽，其中所述多肽在位置401包含氨基酸取代。
82.据实施方式81的多肽，其中所述多肽具有氨基酸401D/K。
83.根据实施方式1-82中任一项的多肽，其中所述多肽在位置403包含氨基酸取代。
84.根据实施方式83的多肽，其中所述多肽具有氨基酸403E/T/V。
85.根据实施方式1-84中任一项的多肽，其中所述多肽在位置412包含氨基酸取代。
86.根据实施方式85的多肽，其中所述多肽具有氨基酸412D/N。
87.根据实施方式1-86中任一项的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个下列氨基酸：121F，134R，141P，229P或307K。
88.根据实施方式1-87中任一项的多肽，其中所述多肽具有一个或多个下列氨基酸42K，88L，205L，235R，240E，272D，311P，392D和409E。
89.根据实施方式1-88中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸42K，88L，235R，311P，392D，以及223S，223K或者223A。
90.根据实施方式89的多肽，还包括选自下列的一个或多个：272D，409E，205L或240E。
91.根据实施方式1-90中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸中的至少四个、五个、六个、七个或八个：42K，88L，205L，235R，240E，272D，311P，392D或409E。
92.根据实施方式1-91中任一项的多肽，其中所述多肽具有氨基酸223A/K/S。
93.根据实施方式1-92中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸42K，88L，223S，235R，311P和392D。
94.根据实施方式1-93中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸42K，88L，223K，235R，272D，311P和392D。
95.根据实施方式1-94中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸42K，88L，223S，235R，311P，392D和409E。
96.根据实施方式1-95中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸42K，88L，205L，223S，235R，311P，392D和409E。
97.根据实施方式1-96中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸42K，88L，205L，223K，240E，235R，311P，392D和409E。
98.根据实施方式1-97中任一项的多肽，其中所述多肽具有下列氨基酸42K，88L，205L，223A，T235R，311P，392D和409E。
99.根据实施方式1-98中任一项的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。
100.根据实施方式1-99中任一项的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。
101.根据实施方式1-100中任一项的多肽，其具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，和任选地一个或多个在N末端的额外氨基酸。
102.根据实施方式101的多肽，其具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及任选地一个或多个在N末端的额外氨基酸。
103.根据实施方式101-102中任一项的多肽，其中所述一个或多个在N末端的额外氨基酸是一个M。
104.根据实施方式1-103中任一项的多肽，其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：88，205，235或409和/或一个或多个下列氨基酸取代：42K，34Q，100Q，223A/S，240E，311P，392D或409E，参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
105.根据实施方式1-104中任一项的多肽，其中所述多肽包含一个或多个下列氨基酸取代：42K，34Q，88K/L/Y，100Q，205L，223A/S/K，235K/H/Q/R，240E/D，248H，266T，311P，377D/E/P，392K/D/Y或409E。
106.根据实施方式1-105中任一项的多肽，其中所述多肽包含一个或多个下列氨基酸取代：34Q，42K，88L，100Q，205L，223A/S/K，235K/R，240E，311P，392D或409E。
107.根据实施方式106的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：235R和311P。
108.根据实施方式1-107中任一项的多肽，其中所述多肽包含氨基酸取代42K。
109.根据实施方式1-108中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K和223S。
110.根据实施方式1-109中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K，223S和392D。
111.根据实施方式1-110中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，223A，235R，311P和392D。
112.根据实施方式1-111中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，205L，223S，235R，240E，311P，392D和409E。
113.根据实施方式1-112中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，205L，223K，235R，240E，311P，392D和409E。
114.根据实施方式1-113中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，205L，223S，235R，311P和392D。
115.根据实施方式1-114中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：34Q，42K，88L，205L，223K，235R，240E，311P，392D和409E。
116.根据实施方式1-115中任一项的多肽，其中所述多肽包含下列氨基酸取代：42K，88L，100Q，205L，223K，235R，240E，311P，392D和409E。
117.根据实施方式1-116中任一项的多肽，还在C末端包含淀粉结合结构域。
118.根据实施方式117的多肽，其中所述淀粉结合结构域是SEQID NO：36的残基。
119.根据实施方式1-118中任一项的多肽，其具有在C-末端融合的连接子。
120.根据实施方式119的多肽，其中所述连接子是SEQ ID NO：35的残基。
121.根据实施方式1-120中任一项的多肽，其具有外切淀粉酶活性。
122.根据实施方式1-121中任一项的多肽，其具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性。
123.根据实施方式1-122中任一项的多肽，其中与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10相比，所述多肽显示出改进的热稳定性。
124.根据实施方式1-123中任一项的多肽，其中相对于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：10，其半衰期(t1/2)，优选地在60℃增加15％或更多、优选50％或更多、最优选100％或更多。
125.根据实施方式1-124中任一项的多肽，其中与经SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10处理的食品相比，经所述多肽处理的食品具有任意一项或多项、优选全部下列特性：(a)更低的硬度；(b)更高的弹力；(c)更高的粘结性；(d)更低的破碎性；和(e)更高的可折叠性。
126.根据实施方式1-125中任一项的多肽，其中相对于经SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：10处理的食品，经所述多肽处理的食品的弹力、粘结性或可折叠性独立地增加15％或更多，优选50％或更多，最优选100％或更多。
127.根据实施方式1-126中任一项的多肽，其中与经SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10处理的食品相比，经所述多肽处理的食品的弹力、粘结性和可折叠性中的每一项都增加了。
128.根据实施方式1-127中任一项的多肽，其中相对于经SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：10处理的食品，经所述多肽处理的食品的硬度或破碎性独立地减少15％或更多，优选50％或更多，最优选100％或更多。
129.根据实施方式1-128中任一项的多肽，其中与经SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10处理的食品相比，经所述多肽处理的食品的硬度和破碎性中的每一项都减少了。
130.实施方式1-129中任一项所述的多肽作为食物或饲料添加剂的用途。
131.处理淀粉的方法，包括用实施方式1-129中任一项中所述的多肽接触淀粉，和允许所述多肽从淀粉生成一个或多个线性产物。
132.实施方式1-129中任一项所述的多肽在制备食品或饲料产品中的用途。
133.制备食品或饲料产品的方法，包括将实施方式1-129中任一项所述的多肽与食物或饲料成分相混合。
134.根据实施方式130的用途，或根据实施方式133的方法，其中所述食品包括生面团或生面团产品，优选经加工的生面团产品。
135.根据实施方式130至133中任一项的用途或方法，其中所述食品为烘焙产品。
136.用于制作烘焙产品的方法，其包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中加入实施方式1-129中任一项所述的多肽；和(c)在步骤(b)的过程中或之后向淀粉介质施热以生产烘焙产品。
137.食品、饲料产品、生面团产品或烘焙产品，其是通过根据实施方式130至136中任一项所述的方法获得的。
138.用于生面团的改进剂组合物，其中所述改进剂组合物包含实施方式1-129中任一项所述的多肽，和至少一种其它的生面团成分或生面团添加剂。
139.组合物，其包含面粉和实施方式1-129中任一项所述的多肽。
140.实施方式1-129中任一项所述的多肽在生面团产品中的用途，用于延迟或减少所述生面团产品的陈化、优选有害凝沉。
141.实施方式1-129中任一项所述的多肽在生面团产品中的用途，用于改进所述生面团产品的下列任意一项或多项：硬度、弹力、粘结性、破碎性或可折叠性。
142.实施方式1-129中任一项所述的多肽以及下列任意一项或多项的组合：
a.来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽生成性α-淀粉酶，也称为葡聚糖1，4-α-麦芽水解酶(EC 3.2.1.133)，或具有麦芽生成性α-淀粉酶活性的其变体、同源物或突变体；
b.来自例如芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、曲霉属(Aspergillussp.)、嗜热真菌属(Thermomyces sp.)或木霉属(Trichoderma sp.)的烘焙木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；
c.来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqufaciens)的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，或具有α-淀粉酶活性的其变体、同源物或突变体；和
d.脂肪酶，例如来自异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)的糖脂肪酶。
143.根据实施方式142的组合用于施用前述任意实施方式的用途。
144.通过用根据实施方式142的组合进行处理而生产的食品或饲料产品。
145.能够编码根据实施方式1至129中任一项的多肽的核酸。
146.根据实施方式145的核酸，其具有的核酸序列与SEQ ID NO：52至少78％同一。
147.核酸，其包含根据实施方式145或146的核酸的至少60个残基的片段，其能够编码具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的多肽。
148.包含根据实施方式145至147中任一项的核酸的质粒。
149.表达载体，其包含根据实施方式145至147中任一项的核酸，或能够表达根据实施方式1至129中任一项的多肽。
150.宿主细胞，其包含，优选被转化以，根据实施方式148的质粒或根据实施方式149的表达载体。
151.能够表达根据实施方式1至129中任一项的多肽的细胞。
152.根据实施方式150的宿主细胞，或根据实施方式151的细胞，其是细菌、真菌或酵母细胞。
153.表达多肽的方法，所述方法包括获得根据实施方式150，151或152的宿主细胞或细胞和从所述细胞或宿主细胞表达多肽，以及任选地纯化所述多肽。
154.产生根据实施方式1至129中任一项的多肽方法，所述方法包括将氨基酸取代引入具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的SEQ IDNO：1中，所述氨基酸取代为
a.在选自下列的一个或多个位置：16，48，88，97，105，205，235，240，248，266，311，347，350，362，364，369，393，395，396，400，401，403，412和409和/或
b.一个或多个下列氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D，392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G或399C/H，和/或
c.在一个或多个选自下列的位置：44，96，204，354和377和/或
d.下列氨基酸取代：392S。
155.根据实施方式1-129中任一项的多肽，其在相应于位置49-66处包含序列DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD-X4-SSW(SEQ ID NO：38)，其中X1为S或T，X2为M或L，X3为V或P以及X4是任意天然存在的氨基酸残基，优选L-氨基酸；所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
156.根据实施方式1-129和155中任一项的多肽，其在相应于位置79-85处包含序列GGEGYFW(SEQ ID NO：39)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
157.根据实施方式1-129和155-156中任一项的多肽，其在相应于位置114-117处包含序列VPNH(SEQ ID NO：40)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
158.根据实施方式1-129和155-157中任一项的多肽，其在相应于位置150-154处包含序列CDDGD(SEQ ID NO：41)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
159.根据实施方式1-129和155-158中任一项的多肽，其在相应于位置187-197处包含序列AGGFRFDFVRG(SEQ ID NO：42)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
160.根据实施方式1-129和155-159中任一项的多肽，其在相应于位置256-259处包含序列FALK(SEQ ID NO：43)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
161.根据实施方式1-129和155-160中任一项的多肽，其在相应于位置282-294处包含序列WREVAVTFVDNHD(SEQ ID NO：44)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
162.根据实施方式1-129和155-161中任一项的多肽，其在相应于位置296-300处包含序列GYSPG(SEQ ID NO：45)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
163.根据实施方式1-129和155-162中任一项的多肽，其在相应于位置304-306处包含序列GQH(SEQ ID NO：46)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
164.根据实施方式1-129和155-163中任一项的多肽，其在相应于位置318-322处包含序列AYAYI(SEQ ID NO：47)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
165.根据实施方式1-129和155-164中任一项的多肽，其在相应于位置325-329处包含序列SPGTP(SEQ ID NO：48)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
166.根据实施方式1-129和155-165中任一项的多肽，其在相应于位置331-333处包含序列VYW(SEQ ID NO：49)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
167.根据实施方式1-129和155-166中任一项的多肽，其在相应于位置335-340处包含序列HMYDWG(SEQ ID NO：50)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
168.根据实施方式1-129和155-167中任一项的多肽，其在相应于位置13-26处包含序列HGGDEIILQFHWN(SEQ ID NO：37)，所述位置参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
169.产生根据实施方式1至129和155-167中任一项的多肽的方法，所述方法包括将氨基酸取代引入具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性的SEQ ID NO：1中，所述氨基酸取代在下列位置中的一处或多处：88或205；和/或是一个或多个下列氨基酸取代：42K，235H/K/R，240E，392K/D/E/Y或409E。
170.制作糖浆的方法，包括将根据实施方式1至129和155-167中任一项的多肽加入颗粒淀粉熔解物中以形成糖浆。
171.实施方式170的方法，其中所述颗粒淀粉熔解物是由α-淀粉酶产生的。
172.实施方式170的方法，其中所述颗粒淀粉熔解物是酸产生的熔解物。
173.实施方式170的方法，其中所述颗粒淀粉熔解物获得自来自下列的淀粉：玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。
174.实施方式170的方法，其中所述颗粒淀粉熔解物在55℃至65℃被糖化。
175.实施方式170的方法，其中所述颗粒淀粉熔解物在60℃至65℃被糖化。
176.实施方式170的方法，其中所述颗粒淀粉熔解物在pH 5.0至pH 7.0被糖化。
177.实施方式170的方法，还包括将具有脱支活性的酶加入颗粒淀粉熔解物中的步骤。
178.实施方式177的方法，其中所述具有脱支活性的酶为异淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶、新支链淀粉酶或其任意组合。
179.实施方式177的方法，任选地包括向颗粒淀粉中加入下列的步骤：蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、果胶裂解酶或其任意组合。
180.实施方式170的方法，其中所述糖浆基于总糖含量包含至少35％按重量的麦芽四糖。
181.实施方式180的方法，其中所述糖浆基于总糖含量包含至少45％按重量的麦芽四糖。
182.实施方式181的方法，其中所述糖浆基于总糖含量包含至少50％按重量的麦芽四糖。
183.实施方式182的方法，其中所述糖浆基于总糖含量包含40％按重量至60％按重量的麦芽四糖。
实施例
实施例1.PS4和G4-淀粉酶的克隆
在LB培养基上过夜培养嗜糖假单胞菌(Pseudomonassacharophila)并且通过标准方法(Sambrook J，1989)分离染色体DNA。使用引物P1和P2(参见表3)，通过PCR从嗜糖假单胞菌染色体DNA中扩增含有PS4开放阅读框(Zhou等人，1989)的2190bp片段。在使用引物P3和P4的巢式PCR中，将所产生的片段用作模板，扩增PS4的开放阅读框而不带有其信号序列，并在所述基因的5′末端引入NcoI位点、在3′末端引入BamHI位点。与NcoI位点一起，引入N-末端甲硫氨酸的密码子，允许PS4的细胞内表达。将1605bp的片段克隆到pCRBLUNT TOPO(Invitrogen)中并通过测序分析构建体的完整性。修饰大肠杆菌芽孢杆菌穿梭载体pDP66K(Penninga等人，1996)以允许在P32启动子和ctg酶信号序列的控制下表达PS4。将所产生的质粒(pCSmta)转化到枯草芽孢杆菌中。
制作第二个表达载体，其中去除了PS4的淀粉结合结构域。在pCSmta上用引物P3和P6(表3)进行PCR，产生了mta基因的截短的版本。将pCSmta中全长的mta基因与质粒pCSmta-SBD中所产生的截短的版本进行交换。
通过编码成熟蛋白质的序列的基因合成(GeneScript；NJ，USA)将假单胞菌属的种AM1(2006)、假单胞菌属的种7193、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(菌株ymp)和溶藻菌(Hahellachejuensis)(菌株KCTC 2396)的G4淀粉酶克隆到含有信号序列的芽孢杆菌表达载体中，所述成熟蛋白质在N末端添加了M，如SEQ ID NO3，5，7和9所示。
实施例2.定点诱变
使用定点诱变来产生本文所公开的变体多肽。利用QuickChangeTM方法(Stratagene，California)，根据随试剂盒提供的说明书(伴有一些修饰)，将突变引入编码具有SEQ ID：1的pMS 382的核酸中。简要地，挑取单菌落并在10ml Falcon管中将其接种到补充了50μg/ml卡那霉素(Sigma)的3ml LB(22g/l Lennox L Broth Base，Sigma)中。以200rpm在37℃过夜温育后，以5000rpm将培养物离心5分钟。去除培养基并利用QIAGEN柱(QIAGEN)来制备双链DNA模板。根据制造商的方案设计引物。例如，表1列出了用于产生新变体的引物，所述新变体是基于SEQ ID NO：52中所示的pMS382的核苷酸序列。
然后，进行PCR以合成突变体链。PCR反应混合物含有下列：
Figure BDA0000109684100000811
在Eppendorf热循环仪中进行PCR反应，进行35个循环的变性(96℃，1min)，引物退火(62.8℃，1min)和延伸(65℃，15min)，然后保持在4℃。对于每个扩增反应，加入2μl DpnI限制性酶(10U/μl)，并且在37℃将混合物温育约3hr。
然后将经DpnI处理的DNA用于转化XL10-Gold
Figure BDA0000109684100000821
超感细胞(Stratagene)。在冰上融化XL10-Gold
Figure BDA0000109684100000822
细胞。对于每个诱变反应，将45μl细胞加入预冷的Falcon管中。随后，向每个管中加入2μlβ巯基乙醇混合物。在冰上温育所述混合物10分钟，伴随每2分钟的回荡。然后，将1.5μl经DpnI处理的DNA加入每等份细胞中，并且在冰上温育所述混合物30分钟。使样品在42℃经受30秒的热脉冲，并且在冰上再放置2分钟。向每个样品中加入0.5ml预热的NZY+培养液，并且在37℃进行1hr温育，伴随225-250rpm的振荡。将200μl的每个转化反应涂在补充了1％淀粉和50μg/ml卡那霉素的LB板上(33.6g/l Lennox L琼脂，Sigma)。在37℃将平板温育过夜。通过DNA测序鉴别带有所需突变的单个克隆并使其经历质粒制备以收获具有所需突变的质粒。
实施例3.转化到枯草芽孢杆菌中。
根据下面的方案用经突变的质粒DNA转化枯草芽孢杆菌(菌株DB104A；Smith等人，Gene 70，351-361(1988))。
A.用于原生质体和转化的培养基
2x SMM每升：342g蔗糖(1M)；4.72g马来酸钠(0.04M)；8.12gMgC12·6H2O(0.04M)；pH 6.5(用浓缩的NaOH调节)。分配为50-ml的部分并高压灭菌10min。
4x YT(1/2NaCl)2g酵母提取物+3.2g胰蛋白胨+0.5gNaCl/100ml。
SMMP混合等体积的2x SMM和4x YT。
PEG 10g聚乙二醇6000(BDH)或8000(Sigma)在25ml1x SMM中(高压灭菌10分钟)。
B.用于铺板/再生的培养基
Figure BDA0000109684100000831
DM3再生培养基：在60℃(水浴；500-ml瓶子)混合：
250ml琥珀酸钠
50ml酪蛋白水解物
25ml酵母提取物
50ml磷酸盐缓冲液
15ml葡萄糖
10ml MgCl2
100ml熔融琼脂
加入合适的抗生素：氯霉素和四环素，5μg/ml；红霉素，1μg/ml。在DM3培养基中用卡那霉素进行选择是有问题的：可能需要250μg/ml的浓度。
C.制备原生质体
全程使用无去污剂的塑料或玻璃器皿。
在100-ml烧瓶中从单一菌落接种10ml的2x YT培养基。在振荡器中(200rev/min)于25-30℃过夜培养。
将过夜培养物稀释20倍，稀释到100ml的新鲜2x YT培养基(250-ml烧瓶)中并在振荡器中(200-250rev/min)于37℃培养至OD600＝0.4-0.5(大约2h)。
通过离心收获细胞(9000g，20min，4℃)。
用移液管移除上清液并将细胞重悬在5ml的SMMP+5mg溶菌酶中(经无菌过滤的)。
在水浴振荡器(100rpm)中于37℃温育。
30分钟之后，以及此后以15分钟的间隔，通过显微镜检查25μl的样品。继续温育直到99％的细胞均原生质化了(球状外观)。通过离心(4000g，20min，RT)收获原生质体并移掉上清液。轻柔地在1-2ml的SMMP中重悬粒状沉淀。
现在原生质体准备好被使用了。部分(例如0.15ml)可被冷冻于-80℃以备将来使用(无需加入甘油)。虽然这可引起可转化性的一定减少，用冷冻的原生质体可获得106转化体/μg DNA。
D.转化
转移450μl的PEG至微管中。
将1-10μl的DNA(0.2μg)与150μl的原生质体混合并将所述混合物加入含有PEG的微管中。立即但是轻柔地混合。
在室温放置2分钟，然后加入1.5ml的SMMP并混合。
通过微量离心(10min，13,000rpm(10,000-12,000g))收获原生质体并倒掉上清液。用纸巾去除剩余的液滴。
加入300μl的SMMP(不震荡)并在37℃在水浴振荡器中(100rpm)温育60-90分钟以允许抗生素抗性标记物的表达。(通过水浴的振动作用而使得原生质体充分重悬。)在1x SSM进行适当的稀释和并将0.1ml涂布在DM3平板上。
实施例4.在摇瓶中发酵变体。
通过将下述溶解于水中而制备摇瓶底物：
Figure BDA0000109684100000841
高压灭菌之前，用4N的硫酸或氢氧化钠将底物调节到pH 6.8。将100ml底物置于具有一个挡板的500ml烧瓶中，并高压灭菌30分钟。随后，加入6ml无菌右旋糖糖浆。所述右旋糖糖浆是通过将1体积的50％w/v右旋糖与1体积的水混合，然后高压灭菌20分钟而制备的。
用所述变体接种摇瓶并以35℃和180rpm在培养箱中温育24小时。温育后通过离心(10.000g，10分钟)将细胞与培养液分离，以及最后通过以0.2μm微细过滤而使上清液不含细胞。所述不含细胞的上清液被用于测定和应用测试。
表1.用于基于SEQ ID NO：52中所示的pMS382的核苷酸序列来产生变体的引物。
Figure BDA0000109684100000851
实施例5.淀粉酶测定
Betamyl测定
一个Betamyl单位被定义为这样的活性：每分钟降解0.0351mmole PNP-偶联的麦芽五糖从而可通过测定混合物中过量的α-葡糖苷酶每分钟释放0.0351mmole PNP的活性。测定混合物含有50μl 50mM柠檬酸钠，5mM CaCl2(pH 6.5)以及25μl酶样品和25μl来自Megazyme(爱尔兰)的Betamyl底物(Glc5-PNP和α-葡糖苷酶)(1小瓶溶解于10ml水中)。在40℃将所述测定混合物温育30分钟，然后通过加入150μl 4％Tris终止。使用ELISA读数仪测量420nm处的吸收，并且Betamyl活性是基于下述测量的：活性＝A420*d(以Betamyl单位)/ml所测定的酶样品。对于烘焙试验中的剂量，使用的是1BMK＝1000Betamyl单位。
内切淀粉酶测定
内切淀粉酶测定与根据制造商(Pharmacia & Upjohn DiagnosticsAB)所述运行的Phadebas测定完全相同。
外切特异性
外切淀粉酶活性与Phadebas活性的比率被用于评价外切特异性。
实施例6.基于残余活性的热稳定性测定的过程
将适当稀释的酶样品在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0，用了0.5MNaCl)中、在室温(对照)或80℃(加热的样品)下温育4分钟，然后紧接着利用Betamyl测定分析对照和加热的样品。残余的活性是如下计算的：加热的样品的Betamyl活性除以对照样品的Betamyl活性。
实施例7.突变的稳定效果
利用实施例6中描述的程序，在表2中作为加热后残余活性的增加显示了突变Q42K，R88L，S205L，E223S，Q311P，S409E和T235K的稳定效果。类似地，表3中显示了A392D的稳定效果，表4中显示了S205L，S223A和S205L与S409相结合的稳定效果，表5中显示了N34Q和G100Q的稳定效果，表6中显示了Q240E的稳定效果。在表2-6中，所述变体的序列与第一行中所述的序列相同，除了进行了第二列中所述的其它突变之外。
表2.Q42K，R88L，S205L，E223S，Q311P，S409E以及T235K与Q311P的组合的稳定效果
  变体   pMS382中的其它突变   残余活性(％)
  pMS382(SEQ ID NO：1)   8.4
  pMS465(SEQ ID NO：18)   E223S   9.6
  pMS1042(SEQ ID NO：19)   Q311P   13.1
  pMS1104(SEQ ID NO：20)   Q42K   11.2
  pMS1153(SEQ ID NO：21)   R88L   19.5
  pMS1286(SEQ ID NO：22)   T235R   12.3
  pMS1284(SEQ ID NO：23)   T235R，Q311P   17.2
  pMS1290(SEQ ID NO：24)   T235K   14.1
  pMS1484(SEQ ID NO：25)   S205L   8.8
  pMS1579(SEQ ID NO：26)   S409E   16.4
表3.A392D的稳定效果
  变体  pMS1105中的其它突变   残余活性(％)
  pMS1105(SEQ ID NO：27)   11.0
  pMS1723(SEQ ID NO：28)  A392D   12.3
表4.S205L、S223A和S205L与S409E相结合的稳定效果
  变体  pMS1776中的其它突变   残余活性(％)
  pMS1776(SEQ ID NO：12)   18.9
  pMS2104(SEQ ID NO：29)   S223A   22.1
  pMS2138(SEQ ID NO：30)   S205L   22.4
  pMS2022(SEQ ID NO：15)   S205L，S409E   23.3
表5.N34Q和G100Q的稳定效果
  变体  pMS2124中的其它突变   残余活性(％)
  pMS2124(SEQ ID NO：31)   24.7
  pMS2177(SEQ ID NO：32)   N34Q   28.8
  pMS2178(SEQ ID NO：33)   G100Q   26.4
表6.Q240E的稳定效果
  变体  pMS2022中的其它突变   残余活性(％)
  pMS2022(SEQ ID NO：15)   23.3
  pMS2118(SEQ ID NO：34)  Q240E   26.8
实施例10.烘焙试验的配方
烘焙试验是用标准白面包发酵物和美国吐司的生面团配方进行的。发酵的生面团从下列制备：1500g来自General Mills美国的″金牌″面粉，890g水，40g大豆油，7.5g GRINDSTEDTM SSL P55 Veg，10g乳化剂DIMODANTM PH300，26g干酵母和抗坏血酸(20ppm总浓度)。在Hobart螺旋式混合器上将发酵的面团在低速混合1分钟，然后在速度2混合3分钟。然后使发酵的面团在25℃、85％RH发酵3小时。
此后，将下列加入发酵的面团中：500g“金牌”面粉、14g干酵母、5g丙酸钙、240g高果糖玉米糖浆(42％)、5g丙酸钙、250g水和抗坏血酸(30ppm终浓度)和40g盐。在Hobart螺旋式混合器上将所产生的生面团在低速混合0.5分钟，然后在高速混合10.5分钟。
将生面团在环境温度静置5分钟，然后量取794g生面团块、在交叉谷物模具上成模并转移到锅中。在43℃、80％RH醒发60分钟后，将生面团在Reed Rack烤箱中、于200℃烘焙21分钟。
实施例11.用于评价硬度、弹力和粘结性的方案
面包的质地谱分析
利用来自英国Stable Micro Systems的质地分析仪通过质地谱分析来分析面包切片，从而测定硬度、弹力和粘结性。根据由英国StableMicro System提供的当前标准计算硬度、弹力和粘结性。所使用的探头是铝的、50mm圆形。
在第一次压缩过程中于40％压缩时测定硬度。数字是将切片压缩至总厚度的40％所需的力。此值越低，面包越软。硬度表示为，例如克。
实施例12.G4淀粉酶变体多肽抗陈化效果的评价
如实施例10中所述烘焙面包，其中pMS1776，pMS1934，pMS2020，pMS2022和pMS2062的剂量在7.5至20BMK/kg之间变化，相应于7,500至20,000Betamyl单位/kg。
根据实施例11中所示的方案在烘焙后不同的时间测试面包的硬度。作为对照，也用标准剂量烘焙了面包，所述标准剂量为600ppmNovamyl 1500和/或416.66ppm包含SEQ ID NO：1的组合物。
图1和2显示了硬度结果。相对于具有600ppm Novamyl 1500和/或416.66ppm包含SEQ ID NO：1的组合物的标准剂量的对照，用pMS1776，pMS1934，pMS2020，pMS2022和pMS2062时，在烘焙后第3天至第10天获得了硬化速度方面大得多的减少。相对于对照，这些面包在弹力和粘结性方面也有了很大的改进。
与Novamyl 1500及包含SEQ ID NO：1的组合物相比，这表明本文所述的变体多肽具有高度改进的抗陈化效果。
实施例13.用于评价破碎性(对于粉碎的抵抗)的方案
将两片面包置于一张纸上。通过垂直然后水平撕裂所述切片而将每一片分为4个正方形。
通过用手指将面包心拉开而进行撕裂。首先，从上面的面包表面的中间至底部的面包表面的中间撕裂所述切片。然后，从切片的外侧至内侧撕裂原来的切片的每一半。通过将手上下移动而在撕裂后摇动每片至少3次来去除从4个正方形上分离的面包心小块。
测定分离的面包心小块的重量作为破碎性的量度。此测定可被称作“破碎性评价方案”。
实施例14.评价可折叠性的方案
使用自动面包切片机将吐司面包切片，将切片厚度设定为15mm。用手从切片的顶部向底部折叠，从而使得折痕的方向是从一边到另一边。
利用下面的评分***在视觉上评估可折叠性：
Figure BDA0000109684100000901
此测定可被称作“可折叠性评价方案”。
实施例15.DP4糖浆的制备
材料：
经SPEZYME FRED
Figure BDA0000109684100000902
细菌α淀粉酶(Danisco US Inc.，GenencorDivision)处理的颗粒玉米淀粉熔解物(34％ds，9.1DE)。
支链淀粉酶(OPTIMAX L-1000，Danisco US Inc.，GenencorDivision)
实验：
用NaOH将淀粉熔解物的pH调节至5.2，然后将各个100g的熔解物在60℃温育，用于通过剂量为0.03BMK/gds的酶进行DP4糖化。当使用支链淀粉酶时，剂量为0.5ASPU/gds。反应进行到至多40小时，停止以阶段性地取样检测峰值DP4。当观察到峰值DP4时，通过在沸水中加热而停止反应。
结果：
表1.
Figure BDA0000109684100000911
如表1所示，结果表明PMS2062产生DP4作为主要的糖产物。如还表明的，加入支链淀粉酶(PU)(PMS2062+PU)引起更高的糖(参见例如DP11+)更快地减少，而DP4水平受到最小的影响。
序列
SEQ ID NO：1.pMS382的成熟蛋白序列
DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPYNWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGDKSGGGEGYFWHDFN
KNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRFYPDKEINLPAGQRFWRNDCPDPGNGPNDCDDGDRFLGGEADLNTGHP
QIYGMFRDEFTNLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKEPSEYPPWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCP
VFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHKWPLQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWPHM
YDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGS
GDGGGNDGG
SEQ ID NO：2.具有在N末端添加的M的假单胞菌种AM1(2006)的G4淀粉酶的成熟蛋白(Q1EJP2蛋白)：
  1  MDLAGKSPGG VRYHGGDEII LQGFHWNVIR ESPNNWYNTL RDMAPTIAAD
 51  GFSAIWMPVP WRDFSSWSDG ANSGGGEGYF WHDFNKNGRY GSDTQLKQAA
101  GALNNAQVKV LYDVVPNHMN RGYPDKQINL PAGQGFWRND CADPGNYPND
151  CDDGDRFMGG DADLNTANPQ VYGMFRDEFA NLRSNYGAGG FRFDFVRGYA
201  GERVDSWMGA AHDNAFCVGE LWKAPAEYPS WDWRNTASWQ QVIKDWSDRA
251  KCPVFDFALK ERMQNGSIAD WKNGLNGNPD PRWREVAVTF VDNHDAGYSP
301  GQNGGQHHWA LQDGLIRQAY AYILTSPGTP VVYWSHMYDW GYGDFIRQLI
351  QVRRTAGVRA DSAISFHSGY SGLVATVSGS QQTLVVALNS DLANPGQVAS
401  GSFSEAVNAS NGQVRVWRSG SGDGGGNDGG EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD
451  SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR
501  NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F*
SEQ ID NO：3.编码具有在N末端添加的M的假单胞菌种AM1(2006)的G4淀粉酶(Q1EJP2)的核苷酸的DNA序列(Q1EJP2 DNA)：
atggatctggcaggcaaatcaccgggcggcgttagatatcatggcggcgatgaaattattctgcaaggctttcattggaatgtt
attagagaatcaccgaataattggtataatacactgagagatatggcaccgacaattgcagcagatggcttttcagcaatttgg
atgccggttccgtggagagatttttcatcatggtcagatggcgcaaattcaggcggcggcgaaggctatttttggcatgatttt
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SEQ ID NO：4.具有在N末端添加的M的假单胞菌种7193的G4淀粉酶成熟蛋白(A5CVD5蛋白)：
  1  MDLAGKSPGG VRYHGGDEII LQGFHWNVIR ESPNNWYNTL RDMAPTIAAD
 51  GFSAIWMPVP WRDFSSWSDG ANSGGGEGYF WHDFNKNGRY GSDTQLKQAA
101  GALNNAQVKV LYDAVPNHMN RGYPDKQINL PAGQGFWRND CADPGNYPND
151  CDDGDRFMGG DADLNTANPQ VYGMFRDEFA NLRSNYGAGG FRFDFVRGYA
201  GERVDSWMGD GACQRLLRGR ALEGTGRIPE LGLAQYGQLA AVIKDWSDRA
251  KVPGCSNFAL KGAHAERLPS PTGRTASTAT PMPRWREVAV TFVDNHDTGY
301  SPGQNGGQHH WALRDDLVRQ AYAYILASPG TPVVYWSHMY DWGHGPLIRQ
351  LIQIRRAAGV RADSAIEFHS GYSGLVATVR GTAQTLVMAL GSNLSSPAEV
401  SSGSFSQALN QDSGQLRIWT TGSTGGDEGD GGGDGTMVSV NFRCDNGITQ
451  PGDSVYAVGS LAQLGSWSPA NAVRLTDVSN YPTWKGAISL PAGQAVEWKC
501  IVRSEADPTQ VRQWQAGDNN RVTAGAGATT IGRL*
SEQ ID NO：5.编码具有在N末端添加的M的假单胞菌种7193的G4淀粉酶(A5CVD5)的核苷酸的DNA序列(A5CVD5 DNA)：
atggatctggcaggcaaatcaccgggcggcgttagatatcatggcggcgatgaaattattctgcaaggctttcattggaatgtt
attagagaatcaccgaataattggtataatacactgagagatatggcaccgacaattgcagcagatggcttttcagcaatttgg
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gaagcagatccgacacaagttagacaatggcaagcaggcgataataatagagttacagcaggcgcaggcgcaacaacaattggc
agactgtaa
SEQ ID NO：6.具有在N末端添加的M的门多萨假单胞菌(菌株ymp)的G4淀粉酶的成熟蛋白(A4XX23蛋白)：
  1  MDAPGKTASG VRYHGGDEII LQGFHWNTVR TSSNWYATLA SMAPTLAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWSDPG NGTSGGGEGY FWHDFNKNGR YGSDSLLRQA
101  ASALNAAGVK PIYDVVPNHM NRGYPDKEIN LPAGQGLWRH DCNDPGNYAN
151  DCDDGDRFMG GDADLNTGHP QNYAMFRDEF ARLRSQYGAG GFRFDFVRGY
201  AGERVASWMS DAHDNGFCLG ELWKAPGEYP SWDWRNGASW QQILKDWSDR
251  AKCTVFDFAL KERMQNGGIA DWRHGLNGNP DARWREVAVT FVDNHDTGYS
301  PGPHGGQHHW PLPDARLKQA YAYILSSPGT PVVYWPHMYD WGHGDFIRQL
351  IQIRRAAGVK AASAIQFHTG FSGLVATISG SQQQLLIALD SNLSSPGQVA
401  SGDFTQALNT DNGAIRIWRS GQGGGDGQGN LVSVNFRCDN GVTQWGDSVY
451  ALGNVTQLGN WSPAGAVRLT DTSAYPTWKG SIALPAGQQV QWKCIVRSES
501  NPTQVKTWQP GGNNSVTVAS GASTAGSF*
SEQ ID NO：7.编码具有在N末端添加的M的门多萨假单胞菌(菌株ymp)的G4淀粉酶(A4XX23)的核苷酸的DNA序列：(A4XX23 DNA)：
atggatgcaccgggcaaaacagcatcaggcgttagatatcatggcggcgatgaaattattctgcaaggctttcattggaataca
gttagaacatcatcaaattggtatgcaacactggcatcaatggcaccgacactggcagcagatggcttttcagcaatttggatg
ccggttccgtggagagatttttcatcatggtcagatccgggcaatggcacatcaggcggcggcgaaggctatttttggcatgat
tttaataaaaatggcagatatggctcagattcactgctgagacaagcagcatcagcactgaatgcagcaggcgttaaaccgatt
tatgatgttgttccgaatcatatgaatagaggctatccggataaagaaattaatctgccggcaggccaaggcctgtggagacat
gattgcaatgatccgggcaattatgcaaatgattgcgatgatggcgatagatttatgggcggcgatgctgatctgaatacaggc
catccgcaaaattatgcaatgtttagagatgaatttgcaagactgagatcacaatatggcgcaggcggctttagatttgatttt
gttagaggctatgcaggcgaaagagttgcatcatggatgtcagatgcacatgataatggcttttgcctgggcgaactgtggaaa
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tgcacagtttttgattttgcactgaaagaaagaatgcaaaatggcggcattgcagattggagacatggcctgaatggcaatccg
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cattggccgctgccggatgcaagactgaaacaagcatatgcatatattctgtcatcaccgggcacaccggttgtttattggccg
catatgtatgattggggtcatggagattttattagacaactgattcaaattagaagagcagcaggcgttaaagcagcatcagca
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gttaaaacatggcaaccgggcggcaataattcagttacagttgcatcaggcgcatcaacagcaggctcattttaa
SEQ ID NO：8.具有在N末端添加的M的溶藻菌(菌株KCTC 2396)的G4淀粉酶的成熟蛋白(Q2SEA8蛋白)：
  1  MESSGKSGAG VRFHGGDEII LQGFHWNVVR TAERNWYNIL QSKAQQISED
 51  GFTAIWMPVP WRDNSSWQAS SDTRFGGEGY FWADMDKNSR YGDDGQLKQA
101  ASALKNKGVK VIYDIVPNHH DRGHSNDSLN LPSGQGYYRS DCSSCDDGDP
151  FMDGGSDFST AHPDVYDLFK NELVNLKTNY SAGGFRFDFV RGYAPERISA
201  WMSASLDSGY CVGELWKGPS EYPSWDWRHS ASWQEILKDF TDASDCSVFD
251  FALKERMQNG SISDWRYGLN GNPSAQWREV AVTFVDNHDT GYSPGPLGGQ
301  HHWALPDWKR KMAYAYILSS PGTPVVYWPH MYDWGMRDFI RNLIQLRKSA
351  GVKAYSGVQF HDGFSGLVGT TSGSNGKLLF AIDSNFSSPN QVAGGAWNLA
401  VNEDNGRIRI WRQ*
SEQ ID NO：9.编码具有在N末端添加的M的溶藻菌(菌株KCTC 2396)的G4淀粉酶的核苷酸的DNA序列(Q2SEA8 DNA)：
atggaatcatcaggcaaatcaggcgcaggcgttagatttcatggcggcgatgaaattattctgcaaggctttcattggaacgtt
gttagaacagcagaaagaaactggtacaacatcctgcaatcaaaagcacaacaaatttcagaagatggctttacagcaatttgg
atgccggttccgtggagagataattcatcatggcaagcatcatcagatacaagatttggcggcgaaggctatttttgggcagat
atggataaaaattcaagatatggcgatgatggccaactgaaacaagcagcatcagcactgaaaaataaaggcgttaaagttatt
tatgatattgttccgaatcatcatgatagaggccattcaaatgattcactgaatctgccgtcaggccaaggctattatagatca
gattgctcatcatgcgatgatggcgatccgtttatggatggcggctcagatttttcaacagcacatccggatgtttacgatctg
tttaaaaacgaactggttaacctgaaaacaaactactcagcaggcggctttagatttgattttgttagaggctatgcaccggaa
agaatttcagcatggatgtcagcatcactggattcaggctattgcgttggcgaactgtggaaaggcccgtcagaatatccgtca
tgggattggagacattcagcatcatggcaagaaattctgaaagattttacagatgcatcagattgctcagtttttgattttgca
ctgaaagaaagaatgcaaaatggctcaatttcagattggagatatggcctgaatggcaatccgtcagcacaatggagagaagtt
gcagttacatttgttgataatcatgatacaggctattcaccgggcccgctgggcggccaacatcattgggcactgccggattgg
aaaagaaaaatggcatatgcatatattctgtcatcaccgggcacaccggttgtttattggccgcatatgtatgattggggcatg
agagattttattagaaatctgattcaactgagaaaatcagcaggcgttaaagcatattcaggcgttcaatttcatgatggcttt
tcaggcctggttggcacaacatcaggctcaaatggcaaactgctgtttgcaattgattcaaatttttcatcaccgaatcaagtt
gcaggcggcgcatggaatctggcagttaatgaagataatggcagaattagaatttggagacaataa
SEQ ID NO：10.>gi|77787|pir||S05667没有信号序列的葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)成熟蛋白-嗜糖假单胞菌
DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGEGYFWHDFN
KNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPDKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFIGGESDLNTGHP
QIYGMFRDELANLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCP
VFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHM
YDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGS
GDGGGNDGGEGGLVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPASAVRLTDTSSYPTWKGSIALPDGQNVEWKCLIRNEADA
TLVRQWQSGGNNQVQAAAGASTSGSF
SEQ ID NO：11.葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)的信号肽-嗜糖假单胞菌
MSHILRAAVLAAVLLPFPALA
SEQ ID NO：12.pMS1776的成熟蛋白序列
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：13.pMS1934的成熟蛋白序列
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KDGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：14 pMS2020的成熟蛋白序列
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：15 pMS2022的成熟蛋白序列
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：16 pMS2062的成熟蛋白序列
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：17 pMS2171的成熟蛋白序列
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKAPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：18 pMS465的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：19 pMS1042的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：20 pMS1104的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：21 pMS1153的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：22 pMS1286的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：23 pMS1284的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：24 pMS1290的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNKASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：25 pMS1484的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：26 pMS1579的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QQASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：27 pMS1105的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：28 pMS1723的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：29 pMS2104的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKAPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：30 pMS2138的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：31 pMS2124的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：32 pMS2177的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYQWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：33 pMS2178的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAQ
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：34 pMS2118的成熟蛋白序列：
  1  DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APYNWYNILR QKASTIAADG
 51  FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG
101  ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC
151  DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP
201  ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK
251  CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301  QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ
351  VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LDNPGQVASG
401  SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*
SEQ ID NO：35.连接子序列
GSGDGGGNDGG
SEQ ID NO：36：PS4 SBD的序列：
  1  EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT
 51  WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS
101  F*
SEQ ID NO：37
HGGDEIILQFHWN
SEQ ID NO：38
DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD-X4-SSW
SEQ ID NO：39
GGEGYFW
SEQ ID NO：40
VPNH
SEQ ID NO：41
CDDGD
SEQ ID NO：42
AGGFRFDFVRG
SEQ ID NO：43
FALK
SEQ ID NO：44
WREVAVTFVDNHD
SEQ ID NO：45
GYSPG
SEQ ID NO：46
GQH
SEQ ID NO：47
AYAYI
SEQ ID NO：48
SPGTP
SEQ ID NO：49
VYW
SEQ ID NO：50
HMYDWG
SEQ ID NO：51：Novamyl：
SSSASVKGDVIYQIIIDRFYDGDTTNNNPAKSYGLYDPTKSKWKMYWGGDLEGVRQKLPYLKQLGVTTIWLSPVLDNLDTLAGTDNTGYHGYWTRDFKQIEEHFGNWTTFDTLVNDAHQNGIKVIVDFVPNHSTPFKANDSTFAEGGALYNNGTYMGNYFDDATKGYFHHNGDISNWDDRYEAQWKNFTDPAGFSLADLSQENGTIAQYLTDAAVQLVAHGADGLRIDAVKHFNSGFSKSLADKLYQKKDIFLVGEWYGDDPGTANHLEKVRYANNSGVNVLDFDLNTVIRNVFGTFTQTMYDLNNMVNQTGNEYKYKENLITFIDNHDMSRFLSVNSNKANLHQALAFILTSRGTPSIYYGTEQYMAGGNDPYNRGMMPAFDTTTTAFKEVSTLAGLRRNNAAIQYGTTTQRWINNDVYIYERKFFNDVVLVAINRNTQSSYSISGLQTALPNGSYADYLSGLLGGNGISVSNGSVASFTLAPGAVSVWQYSTSASAPQIGSVAPNMGIPGNVVTIDGKGFGTTQGTVTFGGVTATVKSWTSNRIEVYVPNMAAGLTDVKVTAGGVSSNLYSYNILSGTQTSVVFTVKSAPPTNLGDKIYLTGNIPELGNWSTDTSGAVNNAQGPLLAPNYPDWFYVFSVPAGKTIQFKFFIKRADGTIQWENGSNHVATTPTGATGNITVTWQN
SEQ ID NO：52：pMS382的核苷酸序列：
  1 gatcaagcag gaaaaagccc ggcaggcgtc agatatcatg gcggcgatga aatcatcctt
 61 cagggctttc attggaacgt cgtcagagaa gcgccgtata actggtataa catcctgaga
121 caacaagcga gcacaattgc cgctgatggc ttttccgcaa tctggatgcc ggttccgtgg
181 agagatttta gcagctggac ggatggagat aaaagcggag gcggcgaagg atatttttgg
241 catgacttta acaaaaacgg ccgctatgga agcgatgctc aactgagaca agcagcagga
301 gcacttggag gagcaggagt caaagtcctg tacgatgtcg tcccgaacca tatgaaccgc
361 ttttatccgg acaaagaaat caatctgccg gcaggccaaa gattttggag aaacgattgc
421 ccggacccgg gaaatggacc gaatgattgc gatgatggcg atagatttct gggcggcgaa
481 gcggatctga atacaggcca tccgcaaatc tatggcatgt ttcgggacga atttacgaat
541 ctgagaagcg gatatggagc gggcggattt cgctttgatt ttgtcagagg ctatgccccg
601 gaaagagttg atagctggat gagcgattca gcggatagca gcttttgcgt cggcgaactt
661 tggaaagaac cgagcgaata tccgccgtgg gattggagaa atacagcgag ctggcagcag
721 atcatcaaag attggagcga tagagcaaaa tgcccggtct ttgactttgc cctgaaagaa
 781 cgcatgcaaa atggaagcgt cgccgattgg aaacatggcc tgaacggaaa tccggacccg
 841 agatggagag aagtcgccgt cacgtttgtc gataaccatg acacaggata tagcccggga
 901 caaaatggag gacaacataa atggccgctt caagatggcc ttatcagaca ggcgtatgcc
 961 tatatcctta catcaccggg aacaccggtt gtttattggc cgcatatgta tgattggggc
1021 tatggcgatt tcatccgcca actgatccag gttagaagaa cagcaggagt cagagcggat
1081 agcgccatta gctttcatag cggctatagc ggacttgtcg ctacagttag cggcagccaa
1141 caaacactgg tcgtcgccct gaatagcgat ctggcaaatc cgggacaagt tgctagcggc
1201 agctttagcg aagcagtcaa tgccagcaat ggccaagtca gagtctggag aagcggaagc
1261 ggagatggag gaggaaatga cggaggataa
注意：此核苷酸序列的衍生的N末端为DQA…然而，可在最终构建体的5′端以atg延伸以在N末端编码M。
Figure IDA0000109684140000011
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Claims (17)

1.具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有：
a.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：235，16，48，97，105，240，248，266，311，347，350，362，364，369，393，395，396，400，401，403，412或409，和/或
b.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：88或205，和/或
c.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含一个或多个下列氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D，392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G或399C/H，和/或
d.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：44，96，204，354或377，和/或
e.与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代：392S，
参照如SEQ ID NO：1所示的序列的位置编号。
2.根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：235，88，205，240，248，266，311，377或409和/或一个或多个下列氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
3.根据权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代：235，88，205，240，311或409和/或一个或多个下列氨基酸取代：42K/N/I/H/F，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
4.根据权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述多肽在至少四个、五个或全部下列位置包含氨基酸取代：88，205，235，240，311或409和/或具有至少一个或两个下列氨基酸取代：42K/N/I/H/F，272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
5.根据权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个下列氨基酸33Y，34N，70D，121F，134R，141P，146G，157L，161A，178F，179T，223E/S/K/A，229P，307K，309P和334P。
6.根据权利要求1-5中任一项的多肽，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％的序列同一性。
7.根据权利要求1-6中任一项的多肽，其中所述多肽在位置88包含氨基酸取代。
8.根据权利要求7的多肽，其中所述多肽具有氨基酸88L。
9.根据权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述多肽在位置235包含氨基酸取代。
10.根据权利要求9的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235R。
11.根据权利要求1-10中任一项的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个下列氨基酸121F，134R，141P，229P或307K。
12.根据权利要求1-11中任一项的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ 1D NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。
13.根据权利要求1-12中任一项的多肽，其具有在C末端融合的连接子。
14.根据权利要求1-13中任一项的多肽，其具有外切淀粉酶活性。
15.根据权利要求1-14中任一项的多肽，其具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性。
16.根据权利要求1-15中任一项的多肽作为食物或饲料添加剂的用途。
17.制作糖浆的方法，包括向颗粒淀粉熔解物中加入根据权利要求1-15中任一项的多肽，以形成糖浆。
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