CN104694439B - 一种降解原油细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降解原油细菌及其应用,该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis1098‑4,保藏号为CGMCC No.9844,其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。应用于降解原油。该枯草芽孢杆菌1098‑4利于原油降解,以原油为唯一营养源生长,可在1‑2天内完全降解土壤及水中原油污染。
Description
技术领域
本发明属于生物降解原油材料及其应用领域,特别涉及一种降解原油细菌及其应用。
背景技术
石油及其产品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入环境会造成严重污染;其中溢油污染危害最大,石油泄漏被称为海洋污染的超级杀手。全世界因油轮事故溢入海洋的石油每年约为39万吨(王传远等,2009)。近年来中国每年排入大海的石油约12万吨,中国近海海域石油的平均质量浓度已达到0.055mg/L,而且污染正日趋加剧。除营养盐之外,石油烃已成为世界海洋(尤其是浅海)的主要污染物(Al-Majed et al.2012)。随着我国经济发展和能源战略的确定,海运将会有一个更大的发展。同时船舶溢油污染的潜在威胁也在同步增加。上海港从1999年至2009年共发生各类船舶油类污染事故173起,油类累计泄漏量达2619.51吨,平均每年发生污染事故15.73起,每年污染物泄漏量达238.14吨(陈维,2010)。
目前处理溢油的方法有物理法、化学法和生物法(King et al.2014)。化学法由于使用化学试剂毒性大,造成生态环境危害,难以大范围广泛利用。物理法主要有围栏法、撇油器法、吸油材料法、活性炭吸附过滤法等,其中吸附剂处理是最经济有效的方法。这些物理主要是应对大规模、大范围的海面石油泄漏事故,通过物理措施将原油吸收、捕捉后再进行分离、回收。但对于汽、煤、柴油等轻质油及大规模处理后残余量油,因其密度小、黏度小,在海面扩散速度快等特点,目前工艺方法难以奏效。这些油在海面形成大片油膜,阻隔了大气和海水之间的自由交换,妨碍空气溶解到海水中去,使水中氧减少。影响海洋植物及藻类的光合作用,对海洋生物、渔业、水产养殖业带来严重危害,另一方面它易粘附到其他物体上或漂到做为疗养性地的海滨,影响优美的环境,导致海洋光量下降(桂客,2011)。
以油作为生长底物的细菌清除油污作为主要的生物处理工艺,其修复过程具有安全性高、经济性强、应用范围广、去除效率高和无明显的二次污染等显著优点(Wiszniowskiet al.2011)。然而细菌个体小,移动性能差,单纯细菌在油污自然环境下存活期短生长慢,在实践应用上自主性差,与目标接触慢等缺点,限制了该工艺在实际中的应用(Wang etal.2013)。因此开发出新的溢油清除菌,对于减轻油污污染,维护环境尤为重要(杨伟华等,2004)。生物界有着十分丰富的微生物资源,人们对微生物的认知还仅仅局限在一小部分当中。因此,还有大量的具有开放潜力的生物表面活性剂菌种未被发现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种降解原油细菌及其应用,该枯草芽孢杆菌1098-4利于原油降解,以原油为唯一营养源生长,可在1-2天内完全降解土壤及水中原油污染。
本发明的一种降解原油细菌,该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis1098-4,保藏号为CGMCC No.9844,其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1098-4,于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.9844。
本发明的一种降解原油细菌的应用,应用于降解原油,具体为:将菌株接种于培养基中,37℃条件下,培养1-2天。
所述培养基为:每100ml培养基中胰蛋白胨1.0g,氯化钠0.5g,原油10g,100ml去离子水,pH 7.0-7.2。
本发明就是分离出一株高效降解原油的细菌菌株,并利用该菌株进行原油污染水体除油效果。
根据BLAST聚类分析及形态学鉴定结果,将该菌株定命名为Bacillussubtilis1098-4。该菌经发明人检测产生表面活性剂,这种功能国内外已经发现菌株是前所未见或未有应用的,要求保护该菌株。
本发明提供的枯草芽孢杆菌1098-4的特征如下:
该菌菌落表面干躁,边缘不整齐;呈乳白色不透明;呼吸类型为好氧呼吸,在有氧条件下生长良好,革兰氏染色呈阳性,形态观察菌体圆柱形杆状,菌体长度为1.717μm。测定菌株的16S rRNA部分序列,进行***发育学分析(菌株的16S rRNA全序列见附表)。
有益效果
本发明的枯草芽孢杆菌1098-4利于原油降解,以原油为唯一营养源生长,可在1-2天内完全降解土壤及水中原油污染,需要成本低,对环境友好。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1098-4菌株降解原油效果,其中a为加菌前油污染水状态;b为培养24小时后状态;c为培养48小时后状态;
图2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1098-4菌株16S rRNA序列***发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
新菌株枯草芽孢杆菌1098-4(Bacillus subtilis1098-4),已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号是:CGMCC No.9844。
菌种来源:
(1)富集 取油土样按5%的接种量接种到富集培养基(牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g,去离子水100mL,pH7.0~7.6)中,于37℃、180rpm培养48h。
(2)初筛 取富集液100μL涂布于油平板(以原油为唯一碳源的无机盐培养基),37℃培养筛选出生长的单菌落,挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上。
(3)复筛 将初筛得到的菌种活化后接种于发酵培养基中37℃、180rpm培养,发酵液离心后测其表面张力,重复几次做进一步的分离纯化,最后获得菌株1098-4。
菌种鉴定:
(1)菌落形态观察 将菌株Bacillus subtilis 1098-4在LB平板上进行划线分离,24h后观察菌落的形状、颜色、表面质地、菌落边缘等并记录。
(2)菌体形态观察 将菌株Bacillus subtilis 1098-4制片,进行革兰式染色,用带拍摄装置的光学显微镜观察菌体的形状、大小、及其特殊构造。
(3)电镜观察 将菌株Bacillus subtilis 1098-4在LB培养基中培养24h,用phenon-world台式扫描电子显微镜进行观测和拍摄。实验方法如下:
①收集菌体:8000rpm离心5min收集菌体,弃上清;
②固定、脱水:加2.5%戊二醛固定2h,再用PH为7.2的磷酸盐缓冲液固定20-30min;
③干燥:加入蒸馏水稀释,充分混合后用滴管取混合液10-20mL于盖玻片上吸附2min,用滤纸吸去多余溶液;
④喷金:加0.1%戊二醛固定1h,再用0.5%戊二醛置换2h,用蒸馏水洗后用70%、90%、100%的乙醇依次脱水,每次5-10min。最后用双面胶将载玻片黏在样品台上,喷金,电镜观察。(4)分子鉴定
①菌株DNA的提取方法
A、取1ml细菌过夜培养液移至1.5mL的Eppendorf管中,5000rpm离心10分钟,去上清液;
B、立即加入600μL预热的提取缓冲液,混匀后,65℃温浴1h;
C、冰浴冷却(5分钟),加入600μL酚/氯仿(1:1)溶液,颠倒混匀后,静置10min,然后12000rpm离心6min;
D、上清转移至另一个Eppendorf管中,加入等体积氯仿,静置5min,12 000rpm离心5min;
E、取上清液,加入等体积异丙醇,沉淀DNA;
F、用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于500μLTE或重蒸水中,-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀;
②16S rRNA的基因扩增
A、PCR反应引物AGAGTTTGATCCTG GCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC
B、在冰上建立PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 | 5μL |
引物(AGAGTTTGATCCTG GCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC) | 各50pmol |
dNTP | 各200μmoL/L |
模板DNA | 0.1~2μg |
Taq DNA聚合酶 | 1U |
Mg2+ | 1.5mmol/L |
加双或三蒸水至 | 50μL |
94℃预变性5min;94℃变性60sec;55℃复性30sec;72℃延伸90sec;32个循环,72℃下延伸为双链10min。最后将***稳定在4℃。取3μL的PCR产物,在1%的琼脂糖凝胶100V下电泳30min,电极缓冲液为0.5×TAE,然后用溴化乙锭(EB)染色检验扩增产物。扩增产物由上海生工生物工程有限公司完成。
(6)所得序列的分析
序列同源性搜索使用Blast进行在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行。并应用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,version 4.0)对其进行分子进化***发育树分析。
实施例2
将过夜用LB培养基培养Bacillus subtilis1098-4 1mL加入灭菌处理的三角瓶中(内含胰蛋白胨1.0g,氯化钠0.5g,原油10g,水100mL,pH 7.0-7.2),37℃培养,观察原油降解情况照相。培养2天后,水中污染原油全部被降解。
Claims (1)
1.一种降解原油细菌的应用,其特征在于:应用于降解原油,具体为:将菌株接种于培养基中,37℃条件下,培养1-2天,其中该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis1098-4,保藏号为CGMCC No.9844,其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示;所述培养基为:每100ml培养基中胰蛋白胨1.0g,氯化钠0.5g,原油10g,100ml去离子水,pH 7.0-7.2。
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