CN104195084A - 一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应用。沙雷氏菌(Serratia sp.)S，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12941。所述的沙雷氏菌S及其菌剂在降解***尤其是降解己烯雌酚中应用。本发明筛选获得一株沙雷氏菌S，利用该菌株制备的固定化菌剂在实验室摇瓶培养条件下7d内对初始浓度为50mg L^-1的DES降解率可达80％以上。将固定化菌剂直接施用于DES污染的水体以及畜禽粪便中，能够在短时间内使其中的DES残留降低90％以上，解决了***DES对水体环境，畜禽粪便和人体健康的危害问题。

Description

一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应用

技术领域

本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应用。

背景技术

环境***已成为继臭氧层破坏、全球气候变暖之后的第三大环境问题，被喻为威胁人类存亡的定时炸弹。近年来，世界各国很多水体中均发现不同程度的***污染，对人类和动物的产生了不良影响。在我国的长江、黄河流域也有***的检出。当水体中的***浓度为1ng·L^-1时就会对鱼类的内分泌***产生干扰作用，造成雄鱼的雌性化。人类和动物正常的生理分泌***会释放***，污水处理厂汇集了人类排放的***，成为了环境***的一个重要来源。养殖业畜禽粪便是环境***的重要来源之一，每年大量的***随畜禽粪便排入环境，对土壤、地表水和地下水环境造成污染，严重威胁人类和动物的安全与健康；也制约了畜禽粪便的资源化利用。

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成***，极微量就能对生物体造成严重伤害。在人体医学上，DES曾被用于预防妊娠妇女自发性流产，但研究表明其能增高女性后代患***腺癌的几率；在兽医上，DES也被用于诱导动物发情、促进生长，但长期应用会损伤动物的肝脏。在环境中DES不易于降解，并在水体和畜禽粪便等固体废弃物中富集，造成环境DES污染。人类和动物通过消化道、呼吸道、皮肤接触等多种途径暴露DES，而其能在动物和人体脂肪组织中长期滞留，当体内蓄积的DES达到一定浓度时，其就会从脂肪组织中释放出来进入血液，对生物体造成不良影响。近些年来，如何去除水体和固体废物中DES备受关注。

微生物降解修复技术是近几十年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物大面积面源污染的降解修复，修复费用较低(仅为传统的物理化学修复花费的10％左右)，且不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于环境有机污染物的清除。由于DES性质稳定，不易发生自然降解，因此，对环境DES进行微生物降解的研究具有重要的意义。而目前，国内外还未见关于DES微生物降解菌株的专利研究和应用报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种***降解菌。

本发明的另一目的是提供该降解菌生产的菌剂。

本发明的又一目的是提供该降解菌的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

沙雷氏菌(Serratia sp.)S，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12941。

一种用所述的己烯雌酚降解菌沙雷氏菌S所生产的菌剂，所述的菌剂优选为固定化菌剂。

一种用所述的沙雷氏菌(Serratia sp.)S所生产的固定化降解菌剂，是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCC 1.12941的沙雷氏菌(Serratia sp.)S试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^-1，酵母5.0g·L^-1，NaCl 10.0g·L^-1，pH 7.0-7.4；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，将该菌悬液与质量百分比为4％的海藻酸钠溶液按体积比2:1混合均匀，再以与混合液等体积的质量百分比为4％的CaCl₂溶液为交联剂，交联6h，得到直径约为3～5mm固定化小球，即为固定化修复菌剂。

所述的保藏编号为CGMCC 1.12941的沙雷氏菌(Serratia sp.)S在降解***尤其是降解己烯雌酚中的应用。

所述的沙雷氏菌(Serratia sp.)S在降解水体环境或固体废弃物中***尤其是己烯雌酚中的应用。

有益效果

本发明筛选获得一株沙雷氏菌(Serratia sp.)S(CGMCC 1.12941)，利用该菌株制备的固定化菌剂在实验室摇瓶培养条件下7d内对初始浓度为50mg L^-1的DES降解率可达80％以上。将固定化菌剂直接施用于DES污染的水体以及畜禽粪便中，能够在短时间内使其中的DES残留降低90％以上，解决了***DES对水体环境，畜禽粪便和人体健康的危害问题。

本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体环境以及畜禽粪便中DES造成的***污染。本发明中的技术可直接应用于我国畜禽粪便的无害化和资源化处理过程，具有广阔的产业前景和重要的环境、经济和社会效益。

附图说明

图1菌株S的菌落照片和透射电镜照片

A图为菌株S的菌落照片，B图为菌株S的菌透射电镜照片

图2菌株S以50mg L^-1DES为唯一碳源时的生长和降解曲线

生物材料保藏信息

己烯雌酚降解菌S(Serratia sp.)，保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 1.12941，保藏日期为2014年8月26日。

具体实施方式

实施例1 菌株的分离和鉴定

取南京某污水处理站活性污泥5g，加入到100mL的无机盐培养基中，添加DES至50mg L^-1作为唯一碳源，于30℃，180r min^-1摇床培养7d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取10^-4-10^-7稀释度的富集液各0.1mL涂布于添加50mgL^-1DES的无机盐平板上，于30℃恒温培养4d后，挑取长出的单菌落接种于含有50mg L^-1DES的无机盐液体培养基中，于30℃，180r min^-1摇床培养7d，验证其对DES的降解效果。无机盐培养基配方为：NH₄NO₃1.0g·L^-1，KH₂PO₄0.5g·L^-1，K₂HPO₄1.5g·L^-1，NaCl 1.0g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.2g·L^-1，pH 7.0；固体培养基加16g·L^-1琼脂。

降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min混匀，12000r·min^-1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤(孔径0.22μm)，用高效液相色谱法测定其中的DES含量。高效液相色谱(岛津LC-20AT)设定参数为：Inertsil ODS-SP-C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈:水＝80:20，流速1.000mL·min^-1，柱温40℃，紫外检测波长230nm。外标法按峰面积定量。

从富集液中分离到一株DES降解菌，命名为菌株S。菌株S降解DES前后的液相色谱检测结果表明菌株S 7d内对初始浓度为50mg L^-1的DES降解率大于65％。菌株S在固体培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，呈红色，有光泽，菌体易挑起。在透射电子显微镜下该菌呈短杆状，大小为(7.0～8.0)μm×(12.0～13.0)μm，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。G^-，好氧生长，其生理生化特性见表1。菌株S的形态和生理生化特征和Bergey'smanual of systematic bacteriology上对沙雷氏菌的描述是一致的。

以菌株S的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株S与沙雷氏菌属菌株的同源性最近，与Serratia marcescens菌株的序列相似性达到99％。结合生理生化特征将该菌鉴定为沙雷氏菌属(Serratia sp.)，将该菌送交中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 1.12941，保藏日期为2014年8月26日。

表1菌株S的生理生化特性

注：+表示发酵糖类只产酸不产气及其它试验中呈阳性反应，-为阴性反应。

实施例2 修复菌剂的发酵和固定化

使用上述菌株S生产修复菌剂的工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—固定化产品(包装剂型为固定化菌剂)。

1)将保藏编号为CGMCC 1.12941的沙雷氏菌(Serratia sp.)S试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％(V/V，以培养基体积为基准，下同)的接种量接入装液量为70％(V/V，以发酵罐体积为基准，下同)的500L种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入装液量为70％的生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.0，搅拌速度为220转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^-1，酵母5.0g·L^-1，NaCl 10.0g·L^-1，pH 7.0-7.4；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，将该菌悬液与质量百分比为4％的海藻酸钠溶液按体积比2:1混合均匀，再以与混合液等体积的质量百分比为4％的CaCl₂溶液为交联剂，交联6h，得到直径约为3～5mm固定化小球，即为固定化修复菌剂。

实施例3 培养基中菌株S对DES的生物降解实验

在无机盐培养基(同实施例1)中加入终浓度为50mg L^-1的DES，以5％(V/V，以培养基体积为基准)接种量接入菌株S(CGMCC 1.12941)，设接种灭活的菌株S(CGMCC 1.12941)对照，30℃恒温摇床振荡培养。定时取样检测菌株S(CGMCC 1.12941)以50mg L^-1的DES为唯一碳源生长时的生长情况以及对DES的降解情况，结果见图2。菌株S(CGMCC 1.12941)可以DES为唯一碳源生长良好，且在7d内对初始浓度为50mg L^-1的DES的降解率达到65％以上。

实施例4 固定化修复菌剂在污水和畜禽粪便处理中的应用

采用南京市玄武区月牙湖湖水作为供试水样。在该湖的的3个生活污水排污口处的湖水中均检测到DES，浓度分别为40.01μg·L^-1、37.90μg·L^-1、33.52μg·L^-1。按10％的接种量在1L水样中投入固定化修复菌剂300g，于30℃，180r·min^-1摇床振荡培养7d后利用高效液相色谱测定各水样中DES含量(同实施例1)，以不接菌剂水样作为对照。固定化修复菌剂对实际污水中DES的降解效果详见表2。从表2中可以看出，固定化修复菌株对排水口1处的DES降解率为90.0％；对排水口2处的DES降解率为96.0％；对排水口3处的DES降解率为96.7％。

采用南京市某养殖场的牛粪作为供试畜禽粪便。在该牛粪样品中检测到DES的浓度为24.27μg·kg^-1。按10％的接种量在100g牛粪样品中投入固定化修复菌剂，于30℃恒温培养箱中培养7d后利用高效液相色谱测定其中的DES含量，以不接菌剂牛粪作为对照，期间牛粪的含水量保持在60％，并每隔12h对牛粪进行翻堆处理。牛粪中DES含量测定参照付银杰等于2013年在《应用生态学报》杂志上发表的文章《应用UE-SPE-HPLC/FLD法检测养殖业畜禽粪便中***》(24(11):3280-3288)中关于畜禽粪便中***的检测方法进行，具体检测步骤如下：牛粪样品经冷冻干燥后，加入15mL乙酸乙酯，超声萃取1h，于4000r·min^-1下离心10min，取上清液5mL过硅胶柱，并用10mL的1:1(体积比)的乙酸乙酯与甲醇混合液洗脱，洗脱液收集于试管中，经氮吹仪吹干后，甲醇定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜后，用高效液相色谱仪测定，计算牛粪中DES的去除率。结果表明，固定化修复菌剂对该样品中DES的去除率可达99％以上，经固定化修复菌剂处理后的牛粪样品中的DES浓度低于检测限浓度，未检出。

表2固定化修复菌剂对污水中DES的降解率

Claims (10)

1.一株***降解菌沙雷氏菌(Serratia sp.)S，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12941。

2.一种用权利要求1所述的***降解菌沙雷氏菌S所生产的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述的菌剂为固定化菌剂。

4.根据权利要求3所述的其特征在于所述的固定化菌剂通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCC 1.12941的沙雷氏菌S试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6‐1.2，搅拌速度为180‐240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48‐60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^‐1，酵母5.0g·L^‐1，NaCl 10.0g·L^‐1，pH 7.0‐7.4；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，将该菌悬液与质量百分比为4％的海藻酸钠溶液按体积比2:1混合均匀，再以与混合液等体积的质量百分比为4％的CaCl₂溶液为交联剂，交联6h，得到直径约为3～5mm固定化小球，即为固定化修复菌剂。

5.权利要求1所述的沙雷氏菌S在降解***己烯雌酚中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的沙雷氏菌S在降解水体环境或固体废弃物中***中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的***为己烯雌酚。

8.权利要求2所述的菌剂在降解***中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求2所述的菌剂在降解水体环境或粪便中***中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的***为己烯雌酚。