CN106082447A

CN106082447A - 一种利用嗜热菌复配生物强化菌剂处理高温采油污水的新方法

Info

Publication number: CN106082447A
Application number: CN201610448035.0A
Authority: CN
Inventors: 闫筱; 罗明志; 余培丽; 金阳; 邓林红
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明公开一种利用嗜热细菌对石油烃分散、吸附、絮凝和降解特性复配生物强化菌剂处理高温(50～55℃)采油污水的新方法。本发明从油田污染土壤富集、纯化得到近的100种菌株中筛选出5株嗜油菌株(H43、H56、H57、H58和H59)，具有耐盐、分散、吸附、絮凝和降解特性。将上述五种菌株按等比关系复配得到生物强化菌剂，试该强化菌剂对5L高温污水石油烃去除率达89％，原油降解率为48％。联合超滤***开展中试实验，每天可处理150吨含油污水，相对常温菌处理，膜通量提高76.47％，除油率达99％。本研究的成果将为石化企业高温采油污水处理提供一个新思路，不仅降低能耗，也降低环境危害，应用前景巨大。

Description

一种利用嗜热菌复配生物强化菌剂处理高温采油污水的新方法

技术领域:

本发明涉及微生物生物技术领域，特别涉及一种利用从石油污染土壤中分离获得的5株嗜热菌根据分散、吸附、絮凝和降解特性复配出生物强化菌剂来处理高温(50～55℃)采油污水的新方法。

背景技术：

石油是我国重要的能源之一，2014年我国石油产量高达2.1亿吨，在生产、生活中都发挥着十分重要的作用。然而石油开采过程中产生大量含石油烃的高温(50～55℃)污水，如不能得到有效处理，将会对环境和人类健康造成巨大危害。我国石油开发总量仍在增加，减排压力巨大。因此，高温采油污水处理新方法，对解决相关环境和能源战略问题具有重要意义。

微生物资源被广泛应用于高温(50～55℃)采油污水的净化处理，但传统的方法主要基于常温(25～37℃)细菌，因此在净化处理过程中需要采用冷却塔预先将高温的采油污水降温至常温后才能进行微生物处理。这一降温过程不仅消耗大量电能，而且导致大量芳香烃等致癌物质挥发，对采油工人及周围居民的身体健康造成严重威胁。另外影响石油降解的因素有很多，其中最为重要的是分散、吸附、絮凝和降解特性。国内外许多学者专家都只是针对其中一种特性进行研究，但将四种特性结合一起应用到石化企业实际高温采油污水处理的方法未见报道。

本发明从泰州油田石油污染土壤，污水和污泥中取样，在55℃条件下经过半年的富集、分离和纯化获得35株具有石油烃降解能力的细菌，分别依据石油烃分散、吸附、絮凝和降解能力从上述细菌中筛选出5株嗜热菌(H43、H56、H57、H58和H59)，经16S rDNA鉴定分别为地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，短芽孢杆菌属(Brevibacillusborstelensis)，地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)，假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas sp)，进行1:1:1:1复配得到生物强化菌剂，通过正交实验设计筛选出最优化生长发酵培养基(LB 0％，尿素0.05％，葡萄糖1％)，实验室内进行小试，复配生物强化菌剂对石油烃去除率达89％，原油降解率为48％，扩大化后结合超滤膜***应用到泰州油田高温(约50℃)采油污水处理中试，目前石化企业尚未见嗜热细菌直接处理高温采油污水的长期应用。

发明内容

(1)本发明提供一种利用嗜热细菌复配生物强化菌剂处理高温(50～55℃)采油污水的新方法，复配特性是嗜热菌对石油烃的分散、吸附、絮凝和降解。

(2)本发明进行复配的5株菌株(H43、H56、H57、H58和H59)经鉴定分别为地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，短芽孢杆菌属(Brevibacillus borstelensis)，地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas sp)，复配比例为1：1：1：1。

(3)本发明所用最优生长发酵培养基为LB 0％，尿素0.05％，葡萄糖1％。

(4)本发明所用5种菌株复配生物强化菌剂处理高温采油污水中的石油烃去除率达89％，原油降解率为48％。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供的5株嗜热菌是从帅垛油田污染的土壤，污水和污泥中分离纯化得到的，在以原油为唯一碳源的情况下55℃反复驯化培养半年而获得，利用乳化指数法，高岭土沉降法，红外光谱分析和GC/MS进行各种降解特性的评价，通过原子力显微镜和16S rDNA对5株嗜热菌进行鉴定。

附图说明

图1为本发明复配所用5株嗜热菌的原子力显微镜图；

图2为温度、pH和氯化钠含量对本发明所用复配嗜热菌株生长的影响；

图3为本发明所用菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H57与SDS乳化法测EI对比图；

图4为本发明所用菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H57产表活物质的红外光谱分析图；

图5为本发明所用复配生物强化菌剂的最优化生长发酵培养基的正交实验结果图；

图6为本发明所用复配生物强化菌剂对含石油烃污水处理对比图；

图7为本发明所用复配生物强化菌剂对原油处理前后的石油烃组分分析的GC/MS图；

图8为本发明所用复配生物强化菌剂对高温采油污水处理前后的石油烃组分分析的GC/MS图；

具体实施方式

实施例1发明所用5株复配菌株的筛选

1.取样：用无菌容器从中石化华东分公司帅垛油田联合处理站采集原油(三相分离器出口管道，先流1min后再取样)、土壤(去除表层覆土0.5cm后取样)、污水(隔油池水面15cm以下)和活性污泥，置4℃保存备用。

2.富集：分别取原油、土壤、污水和活性污泥样品，按5％比例接入100mL富集培养基(含1g原油、1mL微量元素、10mL矿物盐培养基)中，摇床培养7d(55℃，160rpm/min)。取富集液5mL转接至100mL富集培养基内，培养7d，如此连续富集培养7次。

3.分离：采用涂布平板法从富集液中分离、纯化石油烃降解菌株。在LB固体培养基上涂布0.2mL富集液，55℃培养24h后，挑取不同形态克隆于LB液体培养基，摇床培养(55℃，160rpm/min)24h。在55℃条件下初步分离获得35种单克隆菌株，并进行菌种保藏，历时半年。

4.原子力显微镜观察细菌形态：12000rpm离心5min，弃上清，纯水重悬再离心如此反复10次。用纯水重悬后涂布在载玻片表面，用原子力显微镜观察细菌形态和大小如图(1)。

5.所用培养基成分

以上培养基经高压灭菌(121℃，20min)。

实施例2复配菌株H43、H56、H57、H58和H59的16S rDNA鉴定

1.供试菌株：菌株H43、H56、H57、H58和H59

2.试验方法：

①获得活性良好的菌株：先将纯化菌株复苏，取100uL冻存液注入10mL LB液体培养基，55℃，160rpm摇床培养12-24h。将摇出来的菌液划线培养，55℃恒温箱培养24h，挑取平板上的单克隆，接种到LB液体培养基的试管里摇床55℃，160rpm培养12-24h。

②细菌DNA提取法(Takara试剂盒)

③细菌16S rDNA扩增

所用引物：Seq forward 5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'

Seq reverse 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'

3.试验结果：见下表1

表1：5株复配菌株的16s rRNA鉴定结果

实施例3温度、pH和氯化钠含量对本发明所用复配菌株生长的影响

1.供试菌株：菌株H43、H56、H57、H58和H59

2.试验方法：

①向48孔深孔板中加入LB液体培养基(2mL/wells)，接种30μL菌悬液(H43、H56、H57、H58、H59各6μL)，每组各做四个重复。②温度梯度分别是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃；氯化钠梯度是0％、0.5％、1％、2％、4％和8％；pH梯度是5、6、7、8、9和10。③培养12h后用酶标仪测量其生长情况(OD₆₂₀)，进行温度、pH、盐浓度的生长曲线绘制试验。

3.试验结果：H43、H59的最适温度在50℃，H56、H57和H58的最适生长温度在55℃；H43、H56、H57和H58的最适pH都为7.0，H59的最适pH为8.0，H56有较宽的pH耐受范围；H43、H56、H57、H58和H59最适生长氯化钠浓度在0.5％～1％之间，其中H59可耐8％的氯化钠浓度，结果如图(2)

实施例4所用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H57乳化法测EI以及表活物质的红外光谱分析

1.供试菌株：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H57

3.试验方法：

①菌株的复苏：先将H57的菌株复苏，取100uL冻存液注入10mL LB液体培养基，55℃，160rpm摇床培养12-24h。②产生物表面活性剂发酵步骤：取LB培养的菌液100μL，加入含10mL产表活的淀粉培养基的试管内，分别在35℃，40℃，45℃，50℃，55℃和60℃下摇床培养48小时，转速160rpm。③产生物表面活性剂的乳化法检测：将摇床拿出的发酵液进行离心，转速4000rpm，时间20min。取上清液4mL于比色管中，加入4mL正己烷，凡士林封口后再用封口膜封几圈，在漩涡震荡混合仪上混合几分钟直至上下完全混匀，静置24小时后，测量乳白色固体的高度与总高度的比值即为EI值，同样的取4mL SDS，加入4mL正己烷作为对照组。④将H57按1％接种到淀粉培养基，50℃，发酵48h，发酵液4700rpm，离心20min，取上清液于试剂瓶内，加酸调pH至2，4℃冰箱过夜放置，离心取沉淀，常温干燥，产物送去红外光谱分析。

4.试验结果：H57菌株最佳产表活温度为50℃，EI＝3.4/5.8＝0.59与SDS对照如图(3)。H57菌株在50℃，160rpm下，发酵48小时，酸沉淀获得产物经红外光谱分析得出是脂肽物质(图4)。

实施例5高岭土沉降法检测细菌产耐高温絮凝剂的能力

1.供试菌株：菌株H43、H56、H57、H58和H59

3.试验方法：

①采用上述培养基发酵48h，然后4000rpm离心30min，收集上清，保存在4℃。

②将97mL的高龄土悬液(4g/L)、5.0mL的CaCl₂(1％，w/v)、2mL的发酵上清混合在一起，用磁力搅拌器400rpm，搅拌1min，然后在160rpm搅拌5min，沉降5min，在550nm处测定其上清OD值。③对照组是不加菌株的发酵液，实验组为菌株发酵48h的发酵液。沉降活性计算

FA＝(对照组-实验组)/对照组*100％

4.试验结果：试验测得H43和H59菌株48h(55℃)发酵液上清的絮凝能指数分别为76％和72％。

实施例6正交实验筛选复配菌株的最优化生长发酵培养基

1.供试菌株：菌株H43、H56、H57、H58和H59

2.试验方法：

①利用正交设计以不同浓度LB、尿素、葡萄糖组合培养基，向48孔深孔板中加入LB液体培养基(2mL/wells)和20μL原油。②接种30μL菌悬液(H43、H56、H57、H58和H59各6μL)，每组各做四个重复，培养12h(55℃)，测OD₆₂₀，另外做一个不加原油的正交组合。③利用正交分析得出最优组合培养基和各营养剂的影响力大小(表2-1)和(表2-2)。

表2-1不同营养成分对复配生物强化菌剂生长的影响

3.试验结果：LB 2％，尿素0.05％，葡萄糖2％为最佳营养组合。LB、尿素、葡萄糖三种营养剂中，葡萄糖对菌株的生长影响最大(表2-2)。其中采用2号组(LB 0％，尿素0.05％，葡萄糖1％)较为经济，且在加原油的条件下生长更好，其OD₆₂₀结果如图(5)。

表2-2不同营养成分对复配生物强化菌剂生长的影响

实施例7复配生物强化菌剂处理含石油烃污水效率试验

1.供试菌株：复配菌株H43、H56、H57、H58和H59

2.试验方法：

①从台南、帅垛和洲城处理站采集含石油烃的采油污水，按5％的接种量加入嗜油细菌等量混合菌株，按照正交实验筛选的优化培养基添加后进行通气处理12h(55℃)。②分别取对照和实验组各100mL污水，采用四氯化碳萃取后在290nm检测其吸光度(OD)值。③分别对实验组和对照组的萃取液做GC/MS分析。

3.试验结果：结果显示处理后污水明显变清(图6)，对照组OD值为0.85±0.03，实验组OD值为0.098±0.01，石油烃去除率达89％，对照组和实验组的GC/MS分析如图(8)，污水中低分子量的石油烃被分解，且还生成一些新的低分子量的石油烃。

实施例8复配生物强化菌剂对原油降解效率评价

1.供试菌株：复配菌株H43、H56、H57、H58和H59

2.试验方法：

①在100mL液体培养基(无机盐溶液98mL，LB 2mL，尿素0.5g，葡萄糖1g，原油1g)中加入嗜油细菌等量混合菌株，55℃，160rpm摇床培养(7天，4天和21天)，对照组只加100mL液体培养基，各做3个重复。②培养7天，14天和21天后，用等量四氯化碳萃取出剩余原油并定容到相同体积。③紫外分光光度计进行嗜油率检测，并对萃取液做GC/MS。

3.试验结果：取对照和实验组处理液用四氯化碳萃取后在290nm检测其吸光度，结果显示对照组为0.53±0.03，复配嗜热菌实验组OD值为0.12±0.01，实验结果显示复配嗜热菌组对石油烃降解率为48％，复配生物强化菌剂对原油成分降解的GC/MS如图(7)，原油中C14～C27不同长度的石油烃具有一定程度的降解。

实施例9嗜热细菌联合超滤***理含油烃高温污水中试

1.供试菌株：复配菌株H43、H56、H57、H58和H59

2.试验方法：

①利用发酵罐对等比例混合的嗜热细菌H43、H56、H57、H58和H59进行扩大培养，按照每个污水反应池体积的1‰接种。②这次中试主要包括调试期和运行期2个不同阶段。

调试期：分别向1、2、3号微生物反应池各投加0.5吨活性污泥，随后向1、2、3号微生物反应池各充入50吨含油污水(含石油烃152mg/L)，按下表向微生物反应池先投加营养剂(表3-1)，然后投加菌种(50L/pool)，并连续曝气4天(溶氧维持在3～5mg/L)，采用菌落计数检测微生物反应池中嗜热细菌的数量，结果显示曝气第六天水中嗜热细菌的数量达到3.21×10⁹cells/mL。

运行期：调试第5天开始进行含油污水处理，前期处理量逐渐增加(见表3-2)。每天运行污水量按20％递增，分上、下午两次进入，直至满负荷300m³/d运行。运行期在一级生化池进水口每天投加尿素0.5kg和无机盐1kg；每5天视水质情况投加菌种1-2kg。运行期间污水pH控制在6.0-8.0，水温控制在40-55℃，溶氧控制在3～5mg/L。

表3-1生化曝气池菌种及营养剂投加量一览表(单位：kg)

表3-2运行前期进水量表

3.试验结果：在运行5、10、15天检测污水处理效率和通量，结果显示处理通量维持在10-12m³/h(与传统常温微生物处理相比，处理通量提高了76.47％)，除油率达到99％(表3-3)。经过处理后，水质标准达到《油田注水工程设计规范》国家标准(GB50391-2014)，满足低渗油田和特低渗油田的注水要求。

3-3嗜热细菌联合超滤膜***处理高温含油污水运行情况

Claims

1.本发明提供一种利用嗜热细菌复配生物强化菌剂处理高温(50～55℃)采油污水的新方法，复配特性是嗜热菌对石油烃的分散、吸附、絮凝和降解。

2.权利要求1本发明进行复配的5株菌株(嗜热细菌H43、H56、H57、H58和H59)经鉴定分别为地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，短芽孢杆菌属(Brevibacillusborstelensis)，地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)，地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)，假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas sp),复配比例为1：1：1：1。

3.权利要求2本发明所用5种菌株复配生物强化菌剂处理高温采油污水中的石油烃去除率达89％，原油降解率为48％。

4.权利要求3本发明所复配出的生物强化菌剂对温度，pH和氯化钠含量的耐受范围。

5.权利要求4本发明所用最优化生长发酵培养基为LB 0％,尿素0.05％，葡萄糖1％。

6.权利要求5本发明所用菌株H57产表活的EI为0.54，表活物质鉴定为脂肽。