CN102154224A - 一株重组鸡马立克氏病疫苗病毒sc9-1株的构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株重组鸡马立克氏病疫苗病毒SC9-1株的构建和应用。本发明的重组病毒构建方法解决了连续二次采用两端含有flp识别位点kan^r基因敲除同一病毒基因组上二个特定致病基因，所获得的重组病毒SC9-1株用作马立克氏病活疫苗的生产毒株所制备的疫苗，预防超强毒或新出现的特超强毒MDV诱发的鸡马立克氏病，其保护性免疫效果优越于目前国内外市场上应用最广泛的CVI988/Rispens株疫苗。该重组病毒的抗原性应比美国已发表的同类病毒rMd5Δmeq更类同于中国的流行株，不仅不会诱发肿瘤，也没有免疫抑制作用，因而更实用于中国。

Description

一株重组鸡马立克氏病疫苗病毒SC9-1株的构建和应用

技术领域本发明涉及一株重组鸡马立克氏病疫苗病毒SC9-1株的构建，属于兽用生物制品分子生物学领域。

背景技术

自1968年首次分离马立克氏病病毒(或称马立克氏病毒，MDV)以来，养鸡业采用疫苗免疫来预防MD已有40多年的历史了，随着MDV的致病性在不断演化，MDV的毒力和致病性逐渐增强，因而所用的疫苗从III型HVT单价疫苗发展到II型SB-1加HVT双价疫苗，最后不得不用致弱的但仍有一定致肿瘤性的I型CVI988/Rispens疫苗株。

从鸡群中MDV的流行来看，已从以弱病毒株(mMDV)为主，到以强病毒株(vMDV)为主，以至近20年来超强病毒(vvMDV)株越来越普遍，10年前还出现了特超强病毒株(vv+MDV)(Witter RL.Increased virulence ofMarek′s disease virusfieldisolates. Avian Diseases，1997，41(1)：149-163.)。科学家利用各种方法构建了各种MDV候选毒株试图改进疫苗的效果，但都不成功。例如，Witter和Kreager等比较了10株新的疫苗候选株的保护性免疫效果，但结果都不比CVI988/Rispens株好(Witter RL and Kreager KS.Serotype 1 viruses modified by backpassage or insertionalmutagenesis：Approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek’s disease.Avian Dis.2004，48：768-782)。看来，面对MDV野毒株致病性增强的趋势，用常规方法改进疫苗似乎已走到了尽头。但是，根据过去40多年中MDV演变规律，其毒力很有可能会在今后几年变得更强。近年来，在我国，即使在一些已用CV1988/Rispens免疫的鸡群，仍有肿瘤发生率上升的趋势，虽然国内还没有相关分离到特超强毒株的报道，但MDV的变异却一直在进行着。例如，本发明人分离的野毒株GX0101，其毒力虽比Md5(超强毒)小，但其横向传播能力却远远大于Md5(许晓云，孙爱军，崔言顺，等.带有REV-LTR片段的马立克氏病病毒重组野毒株与超强毒株致病性和横向传播性比较.微生物学报(Acta Microbiologica Sinica)，2009，49(4)：0540-0543)。显然，有必要在能突破CVI988/Rispens株的保护性免疫的新的致病性更强的MDV野毒株出现并开始流行以前，应尽快地用新的方法研制更有效的疫苗。

本发明人已将GX0101的全基因组克隆进BAC载体，构建了其感染性克隆GX0101-BAC，将其转染细胞，可以拯救出重组病毒MDV的bac-GX0101(孙爱军，2009，Chinese ScienceBulletin.54：2641-2647)。按如下方法敲除MDV的bac-GX0101中的2个meq基因，以质粒pKD13为模板，用PCR扩增卡那霉素抗性基因(kanamycin resistance gene，kan^r)，上下游引物的5’端分别含有与meq基因的前后50bp序列同源的同源臂，用来进行同源重组。引物序列如下：

Δmeq-F：5’-AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAcgtgtaggctggagctgcttc-3’(序列1)；

Δmeq-R：5’-CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGcattccggggatccgtcgac-3’(序列2，meq基因的前后50bp同源序列用大写字母表示，扩增kan^r的序列以小写字母表示)。

卡那霉素抗性基因的扩增体系如下：10×Buffer 2.5μL，模板pKD13(约100ng/μL)1μL，Mg²⁺(15mmol/L)2μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，上下游引物(25pmol/μL)各1μL，Taq enzyme(5U/μL)0.1μL，用双蒸水补至25μL。PCR扩增程序为：95℃10min，按95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用凝胶电泳进行鉴定。

在kan^r两端含有flp识别位点(flp recognition target，FRT)，flp重组酶能够识别卡那霉素抗性基因两侧34bp的FRT位点，可特异性切除2个FRT位点内侧的序列。PCR产物用Dpn I酶进行消化1h以去除PCR产物中残留的的环状模板质粒，消化后的PCR产物利用电转化仪转化进已含有GX0101-BAC的大肠杆菌EL250中(孙爱军，2009，Chinese ScienceBulletin.54：2641-2647)，电转条件为1800V，100Ω，25μF。转化后立即用1ml LB重悬细菌，32℃培养2h后取100μL菌液涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中。16h后挑取单菌落利用PCR鉴定kan^r是否取代了meq基因(Schumacher，D.，B.K.Tischer，W.Fuchs，and N.Osterrieder.2000.Reconstitution ofMarek’s disease virus serotype 1(MDV-1)from DNA clonedas a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1mutant.J.Virol.74：11088-11098)。经鉴定，利用卡那霉素抗性基因取代一个meq基因后，挑取菌落接种于LB液体培养基中于32℃过夜培养摇振培养，待其OD值达到0.5时，加10％的***糖诱导1h，使宿主菌内的质粒flp重组酶激活和表达，从而去除卡那霉素抗性基因。所得到的菌可在只含有30μg/mL氯霉素LB琼脂平板上生成，但不能在同时含有30μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上生长。敲除一个meq基因验证成功后，再利用同样的方法利用kan^r取代另外一个meq基因，将获得的缺失2个meq基因的MDV GX0101的感染性克隆质粒命名为GX0101Δmeq-BAC，由其质粒DNA转染细胞产生的病毒为GX0101Δmeq。但由于在敲除第二个Meq基因的过程中又加入了一个Kan^r基因，按照现行的基因工程产物生物安全法，不得将带有Kan^r基因的活病毒用作疫苗。为了取得可用作疫苗的毒株，还必须敲除Kan^r基因。

发明内容

本发明的目的是通过对flp重组酶部分诱导从而对3个FRT片段只产生部分消化再结合多重筛选，以此获取GX0101ΔmeqΔKan(SC9-1株)疫苗病毒。

本发明的技术方案

本发明涉及的病毒是采取一种对flp重组酶和FRT部分诱导消化结合多重筛选的方法，该方法将已经连续二次采用两端含flp识别位点kan^r基因替代二个特定基因后马立克氏病毒基因组上kan^r基因敲除，在其过程中对flp重组酶的表达仅实施部分诱导，从而使病毒全基因组上总共3个被flp重组酶识别的FRT片段只被部分消化，再结合对产生的大量克隆逐一用PCR检测筛选，从而获得在生物安全角度可作为疫苗用鸡马立克氏病活疫苗病毒SC9-1株。

本发明还涉及一株重组的鸡马立克氏病病毒SC9-1株在制备用于预防超强毒或新出现的特超强毒MDV诱发的鸡马立克氏病的鸡马立克氏病疫苗中的用途；

本发明同时还涉及一种预防鸡马立克氏病的方法，其中向鸡给予预防有效剂量的鸡马立克氏病疫苗，所述的疫苗包含重组鸡马立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株。

本发明的具体描述

一.在前期已发表的研究中(李延鹏马立克氏病病毒meq基因缺失株生物学特性及其免疫效果研究，博士学位论文，2010，中国农业科学院.)，利用卡那霉素抗性基因取代一个meq基因后，挑取菌落接种于LB液体培养基中摇振培养，待其OD值达到0.5时，加10％的***糖诱导1h，使宿主菌内的质粒flp重组酶，从而去除卡那霉素抗性基因。诱导后将菌分别涂布于含有30μg/mL氯霉素或50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上32℃过夜培养，如果只在含有30μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上生长但在含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上不生长，表明诱导后的重组菌仍具备氯霉素抗性而不再具备卡那霉素抗性(Kan^r)，即可确定该重组菌为目的菌。但该重组质粒中在被去掉的第一个Meq基因所在的位置仍保留一个flp重组酶识别的位点(flp recognition target，FRT)。

敲除一个Meq基因并经验证后，再利用同样的方法利用kan^r取代另外一个meq基因，将获得的缺失了2个Meq基因的MDV GX0101的感染性克隆质粒命名为pGX0101Δmeq-BAC。该克隆又***了一个kan^r基因。鉴于在敲除前一个kan^r基因是留下了一个FRT位点，在质粒GX0101Δmeq-BAC上已存在3个FRT位点(如图1)。如果按同样的方法用诱导flp重组酶来敲除第2个kan^r基因，就会同时敲除MDV的一部分基因组，因而不再能拯救到新的感染性克隆病毒。另一方面，我们已发表的GX0101ΔMeq病毒，虽然没有致病性并具备很好的保护性免疫力，但它在细胞上的复制能力较差，这一特性也不适合用作商品化疫苗。

为此，本发明人在构建敲除Meq基因的GX0101的感染性克隆过程中，对与pGX0101Δmeq-BAC同批获得的12个质粒克隆菌落进行了比较筛选。将这些单独菌落分别重新编号为pSCΔMeq-BAC1至pSCΔMeq-BAC12。分别将不同菌落的菌体大量培养后制备质粒DNA，再转染CEF。在细胞出现MDV特有的蚀斑后，分别将所得到的感染性克隆病毒命名为SC1ΔMeq至SC12ΔMeq。分别比较这些病毒在CEF上的复制水平，从中选择到感染性克隆质粒pSCΔMeq-BAC9在CEF上形成的病毒蚀斑最快最多。该感染性克隆质粒pSCΔMeq-BAC9用于进一步的敲除其中的Kan^r基因。为此，我们设计了“对flp重组酶和FRT部分诱导消化结合多重筛选”的新方法，即：在细菌培养时降低对flp重组酶的诱导条件和时间，使一部分GX0101Δmeq-BAC质粒DNA分子上3个FRT位点中只有2个位点被flp重组酶作用，从而使部分分子只有kan^r基因二侧的FRT被flp重组酶识别和作用，因此这一部分分子上只有kan^r基因被flp重组酶消化剪辑掉，而与另一个FRT位点相关的MDV基因组均全部保留。

已分别将每一菌落经过多次比较筛选，最后按如下条件取得成功：感染性克隆质粒pSCΔMeq-BAC9转化的E250株大肠杆菌接种于LB液体培养基中摇振培养，待其OD值达到0.5时，加5％(完全诱导的标准浓度为10％)的***糖诱导40min(完全诱导的时间为60min)，使宿主菌内的质粒flp重组酶只被部分激活，从而使部分MDV基因组克隆质粒分子只去除了卡那霉素抗性基因但不影响MDV基因组部分。

诱导后将菌涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，32℃过夜培养。将所有具备氯霉素抗性的菌落再分别接种二类LB琼脂平板，一类只含30μg/mL氯霉素(A)，另一类同时含有30μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素(B)，二类平板上接种的菌落分别一一对号。

选择在A板上生长而在B板上不生长的菌落即已不具备抗卡那霉素活性的菌落，再分别接种于含有30μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在，32℃过夜培养。

取每一个菌落的部分菌体分别提取基因组DNA，分别用kan^r基因和MDVpp38基因特异性引物(pp38-F：AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG，序列3和pp38-R：ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA，序列4)做PCR，选择在PCR中kan^r基因阴性但MDVpp38基因阳性的菌落再接种于含有30μg/mL氯霉素的LB肉汤，用plasmid Maxi kit(购自QIAGEN公司)大量提取质粒DNA。

然后分别用以上各个质粒DNA转染鸡胚成纤维细胞单层，从其中选出MDV特有的细胞蚀斑，由此拯救到了敲除了Kan^r抗性基因的重组病毒，命名为MDV SC9ΔMeqΔKan^r，简称马立克氏病毒SC9-1。该病毒株已于2010年12月03日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4399。

二、将野毒株敲除肿瘤Meq基因的马立克氏病疫苗病毒SC9-1株的鉴别特性

该病毒基因组上带有三个位于特定位点的特定序列可作为本病毒的鉴别性标志：

(1)在原有的二个Meq基因位点，在敲除Meq基因后，各留下一个34bp的FRT序列(序列5)，敲除二个Meq基因后，SC9-1株完全没有致病性；

(2)在病毒基因组的US/TRS片段连接点的上游约370bp处***了一段约539bp的REV-LTR片段(序列6)，提高了MDV SC9-1株病毒在鸡群中的横向传播性，因而在免疫的鸡群，即使少数个体由于不可避免的技术原因被漏免，也可能由于其横向传播性而提供免疫作用。

三.MDV SC9ΔMeqΔKan^r株(SC9-1株)病毒对鸡的致病性和保护性免疫作用

在已发表的研究中，已证明了GX0101Δmeq对鸡完全没有致病性且可诱发100％的保护性免疫(苏帅，李延鹏，孙爱军，崔治中.敲除meq的马立克氏病毒强毒株对超强毒的免疫保护作用，微生物学报，2010，50：380-386.)，只是由于GX0101Δmeq带有Kan^r基因，因而不能用作为疫苗病毒。为此，本发明采用了完全敲除Kan^r基因的新的疫苗毒株MDV SC9-1株，按已报道的方法(苏帅，李延鹏，孙爱军，崔治中.敲除meq的马立克氏病毒强毒株对超强毒的免疫保护作用，微生物学报，2010，50：380-386)在SPF鸡用同样方法同样条件的人工感染试验，具体方法如下：将1日龄SPF鸡180只，随机分为6组，每组30只，分别饲养于6个带有正压过滤空气的SPF动物饲养隔离器内，1日龄时，第1组鸡以2000pfu/只的剂量腹腔接种GX0101Δmeq，第2组鸡以2000pfu/只的剂量腹腔接种SC9-1、第3组鸡以2000pfu/只的剂量腹腔接种CVI988/Rispen，第4组鸡为攻毒对照，第5组鸡为空白对照，第6组鸡第6组鸡以2000pfu/只的剂量腹腔接种SC9-1。免疫接种5天后，第1、2、3和4组鸡分别以1000pfu/只的攻击剂量MDV超强毒株vv rMd5。攻毒后每周观察及的生长态势。实验期间，对各组死亡鸡只剖检，并取疑似马立克氏病特有病变脏器做石蜡切片，HE染色后进行病理组织学观察。在攻毒后90天，所有的存活鸡均被处死并剖检，观察鸡的病变，同时，每组随机选取5只，分别取心脏、脾、肝脏于10％中性***固定，4℃保存。石蜡切片，HE染色进行病理组织学观察。

试验结果证明，该病毒对SPF鸡没有致病性，并对超强毒vvMDV病毒株Md5表现出同样的保护性免疫(表1)。从表可看出，在将Kan^r基因敲除后，SC9-1株病毒对SPF鸡的致病性和保护性免疫效力与其GX0101Δmeq完全相同。在敲除了Kan^r基因后，将符合生物安全法的要求可用作疫苗。

表1.SC9ΔmeqΔKan^r与其他毒株对SPF鸡的致病性和保护性免疫效力的比较

*注：1日龄SPF鸡分别腹腔内接种2000pfu的不同疫苗用病毒GX0101Δmeq、SC9ΔMeqΔKan^r和CVI988/Rispens。在5日龄时分别接种1000pfu的MDV超强毒株rMd5.连续观察和记录13周的死亡率，对死亡鸡均剖解观察有无肿瘤，并作组织切片观察有无肿瘤病变。在13周时，扑杀所有鸡，肉眼观察有无肿瘤并记录。表中MD肿瘤率，是死亡鸡显现肿瘤和13周后扑杀鸡中出现肿瘤的总和。保护指数是根据对肿瘤发生率的预防作用计算的。

重组鸡马立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株因在其亲本病毒基因组的US/TRS片段连接点的上游约370bp处***的一段约539bp的REV-LTR片段，提高了在鸡群中的横向传播性，因而在免疫的鸡群，即使少数个体由于不可避免的技术原因被漏免，也可能由于其横向传播性而提供免疫作用。

四.MDV SC9ΔMeqΔKan^r株(SC9-1株)病毒对鸡既无致肿瘤作用也无免疫抑制作用

在SPF鸡的人工接种试验表明，接种了原始克隆毒bac-GX0101株的鸡，生长显著缓慢，而且胸腺和法氏囊与体重的比都比对照鸡低得多(P＜0.01)。但是，SC9-1株病毒不仅没有致肿瘤作用(见上表1)，而且也不会引起免疫抑制。1日龄SPF鸡接种SC9-1株病毒后，其体重及中枢性免疫器官胸腺和法氏囊与体重的比都与对照鸡无显著差异(表2)。这一特性对于用作疫苗来说是致关重要的。与SC9-1相比，美国的rMd5Δmeq则还保留显著的免疫抑制作用，因此不适用于做为疫苗株。

表2.接种bac-GX0101和SC9-1株病毒的SPF鸡法氏囊和胸腺与体重比(n＝20)

所有1日龄SPF鸡分别经腹腔接种1000PFU的bac-GX0101或GX0101Δmeq株病毒。分别在接种后7，14和21天采集血浆接种CEF细胞，在7天后检查和计算每毫升血浆所产生的病毒蚀斑单位(PFU)，表中数字为平均蚀斑数±标准差。右上角字母不同，表明差异非常显著(P＜0.01)，相同字母表示差异不显著((P＞0.05)。

本发明的积极意义

1.解决了连续二次采用两端含有flp识别位点kan^r基因敲除同一病毒基因组上二个特定功能基因后再敲除kan^r基因的技术难点；

2.MDV SC9-1病毒用作疫苗，预防超强毒或新出现的特超强毒MDV诱发的鸡马立克氏病，其保护性免疫效果优越于目前国内外市场上应用最广泛的CVI988/Rispens株疫苗；

3.MDV SC9-1病毒的亲本毒GX0101是中国本地分离的野毒株，其抗原性应比美国已发表的同类病毒rMd5Δmeq更类同于中国的流行株，因而更实用于中国；

4.MDV SC9-1病毒最初的亲本毒GX0101是一个***了禽网状内皮增生病毒LTR片段的天然重组病毒，其原有的致病性就显著低于rMd5Δmeq的亲本毒Md5。SC9ΔMeqΔKan不仅不会诱发肿瘤，也没有免疫抑制作用，而且具有与rMd5Δmeq完全相同的保护性免疫效果，可用作商业化疫苗。

附图说明

图1显示在敲除了2个Meq基因的重组马立克氏病毒GX0101的BAC克隆中可被flp重组酶识别的三个FRT位点(红色标志)。

Claims (4)

1.一株重组的鸡马立克氏病毒SC9-1株，其特征在于该病毒株已于2010年12月03日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4399，该病毒基因组上带有三个位于特定位点的特定序列可作为本病毒的鉴别性标志：

(1)在原有的二个Meq基因位点，在敲除Meq基因后，各留下一个34bp的序列FRT(序列5)敲除二个Meq基因后，SC9-1株完全没有致病性；

(2)在病毒基因组的US/TRS片段连接点的上游约370bp处***了一段约539bp的REV-LTR片段(序列6)，提高了MDV SC9-1株病毒在鸡群中的横向传播性，因而在免疫的鸡群，即使少数个体由于不可避免的技术原因被漏免，也可能由于其横向传播性而提供免疫作用。

2.如权利要求1所述的一株重组的鸡马立克氏病毒SC9-1株，其特征在于采取一种对flp重组酶和FRT部分诱导消化结合对大量克隆筛选的方法，将已经连续二次采用两端含flp识别位点kan^r基因替代二个特定致病基因后马立克氏病毒基因组上保留的kan^r基因敲除。在其过程中对flp重组酶的表达仅实施部分诱导，从而使病毒全基因组上总共3个被flp重组酶识别的FRT片段只被部分消化，对产生的大量克隆逐一用PCR检测筛选，从而获得在生物安全角度可作为疫苗用的不再保留kan^r基因的鸡马立克氏病活疫苗病毒SC9-1株。

3.一种根据权利要求1所述的一株重组的鸡马立克氏病病毒SC9-1株在制备用于预防超强毒或新出现的特超强毒MDV诱发的鸡马立克氏病的鸡马立克氏病疫苗中的用途。

4.一种预防鸡马立克氏病的方法，其中向鸡给予预防有效剂量的鸡马立克氏病疫苗，所述的疫苗包含权利要求1所述的重组鸡马立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株。

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