CN102382188B - 醋酸卡培立肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种醋酸卡培立肽的制备方法，包括以下步骤：1）由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.5mmol/g-1.0mmol/g的WangResin反应，得到Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin；2）将Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽-WangResin；3）采用固相氧化法氧化卡培立肽-WangResin；4）采用TFA裂解，得到粗肽；5）对卡培立肽粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，得到高纯度精肽。该工艺具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等有益的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种醋酸卡培立肽的制备方法。
背景技术
本品所含卡培立肽，别名基因重组心房肽、卡哌利丁、Hamp、人脑利钠肽。它的适应症是急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)。;卡培立肽药理学作用是通过刺激心肌伸展，由心室内颗粒合成的，然后通过冠状动脉分布全身，作用于血管平滑肌和肾脏等组织，调节血压和体内电解质平衡。本品为28个氨基酸组成的一种循环调节激素，起血管扩张和利尿作用。本品引起的血管舒张是由于与血管平滑肌的ANP(心房利钠多肽)受体结合，通过提高鸟苷酸环化酶的活性而实现的，提示可减轻心脏前、后负荷。
目前国内有一篇卡培立肽专利（专利号：ZL200510012425.5），采用的是基因重组技术生产，未见固相合成工艺方法的报道；CA1245635A1专利报道的为采用Boc路线合成卡培立肽，CA1245637A1专利报道的为采用基因重组技术生产卡培立肽，其它的专利如EP0440311A1、JP3004169A、US4673732A等都是或者采用基因重组技术生产卡培立肽或者采用Boc路线合成卡培立肽，未见采用Fmoc路线合成卡培立肽的相关文献及专利。
发明内容
本发明提出了一种采用固相Fmoc合成线性卡培立肽的制备方法，整个工艺操作方便、收率高。
本发明提供的一种制备醋酸卡培立肽的方法，包括以下步骤：
1）由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.5mmol/g -1.0mmol/g的Wang Resin反应，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin；
2）将Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽- Wang Resin；
3）采用固相氧化法氧化卡培立肽- Wang Resin；
4）采用TFA裂解，得到粗肽；
5）经过反相高效色谱纯化、冻干得到醋酸卡培立肽。
本发明相对于Boc法，Fmoc法操作简单，对环境污染小。
采用Wang Resin（Wang-树脂）不仅成本低，更加具有社会价值，而且Wang Resin能够使整个固相合成反应稳定。申请人意外地发现，本合成中Wang resin的替代度对反应的收率有着重要影响，当wang resin的替代度大于1.0mmol/g时，合成产物卡培立肽的收率明显降低；当Wang resin的替代度低于1.0mmol/g时，收率比较稳定，但是当替代度低于0.5mmol/g时，Wang resin用量会大幅度增加，对合成产品卡培立肽的成本影响很大。为了寻求收率与成本的最佳结合点，本发明采取用替代度为0.5mmol/g -1.0mmol/g的Wang Resin。
本发明采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽- Wang Resin，偶联过程采用的偶联剂包括DIC/HOBt、PyBOP/HOBt或TBTU/HOBt。同时采用有机碱包括TEA、NMM或DIPEA。优选体系为TBTU/HOBt体系，优选有机碱为NMM。实验发现，采用本发明的多种偶联体系能显著提高反应效率。申请人意外地发现，有机碱为TEA、NMM或DIPEA，可以有效的防止合成产物消旋。
采用固相碘氧化法在应用于氧化卡培立肽- Wang Resin，碘的用量是一个非常重要的因素，当碘的物质量大于卡培立肽- Wang Resin物质量的80倍时，由于用量过高，致使氧化产物复杂，难以纯化；当碘的物质量小于卡培立肽- Wang Resin物质量的10倍时，氧化的收率很低，致使反应效率低下。申请人意外的发现，当碘的物质量是卡培立肽- Wang Resin物质量的10-80倍时，是平衡了反应效率和纯化难度的一个理想范围。其中氧化时间确定为4-16小时。
所述步骤5）卡培立肽反相高效色谱纯化包括以下步骤：
第一步纯化：将合成所得粗肽溶解后用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A 相，缓冲溶液pH范围为2.5-3.5；色谱纯乙腈为B相，B相的梯度为：17%～32%，进行梯度洗脱纯化45-120min。磷酸盐缓冲溶液可以为体积浓度是0.1-0.2%的磷酸缓冲溶液；
第二步转盐：采用RP-HPLC法将其转成醋酸盐。作为A 相的醋酸盐缓冲溶液浓度应为0.5--0.1%；缓冲溶液pH应为3.5～4.4；第二步转盐的色谱纯乙腈B相的梯度为：6%～36%，梯度洗脱时间为30--90 min。其中min是单位分钟的英文缩写。
采用本纯化方法，可以使整个生产过程可控性高、重现性好，同时可以得到很高的产率。
本发明合成方法示意流程如下：
其中：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链叔丁基保护酪氨酸
Fmoc-Arg(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护精氨酸
Fmoc-Phe-OH代表：N-芴甲氧羰基苯丙氨酸
Fmoc-Ser(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护丝氨酸
Fmoc-Asn(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬酰胺
Fmoc-Cys(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护半胱氨酸
Fmoc-Gly-OH代表：N-芴甲氧羰基甘氨酸
Fmoc-Leu-OH代表：N-芴甲氧羰基亮氨酸
Fmoc-Gln(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护谷氨酰胺
Fmoc-Ala-OH代表：N-芴甲氧羰基丙氨酸
Fmoc-Ile-OH代表：N-芴甲氧羰基异亮氨酸
Fmoc-Asp(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬氨酸
Fmoc-Met-OH代表：N-芴甲氧羰基-蛋氨酸
当氨基酸为精氨酸时，侧链R=pbf（2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）；当氨基酸为丝氨酸、天冬氨酸时，侧链R=tBu（叔丁基）；当氨基酸为半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺时，侧链R=Trt(三苯甲基)。
DIC代表：二异丙基碳二亚胺
DMAP代表: 4，4-二甲氨基吡啶
HOBt代表：1-羟基苯并三氮唑
TBTU代表：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯
TFA代表：三氟乙酸
TEA代表：三乙胺
本发明工艺具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，全部反应的总收率可达30%。
具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
Wang Resin购自天津南开和成有限公司，各种保护氨基酸购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中：
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| DIC | 二异丙基碳二亚胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并*** |
| DIPEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| NMM | N-甲基吗啉 |
| Pbf | 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
| Trt | 三苯甲基 |
| tBu | 叔丁基 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DMF | 二甲基甲甲酰胺 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| DMAP | 4，4-二甲氨基吡啶 |
| TBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯 |
实施例1、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的合成
在50ml的反应柱中加入4.8克Wang Resin（sub=0.5mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，并用适量DMF洗涤树脂三次。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH (2.89g, 6.3mmol)，HOBT(1.02g，7.56mmol)，全部混合后，加入DMF(10ml)、DCM(10ml)搅拌溶解完全。然后加入DIC(0.98ml，6.3mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，并加入DMAP（29.3mg，0.24mmol），鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂4次，然后加入乙酸酐（16.2ml、180mmol）、吡啶（（13.8ml、180mmol），反应2h。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。真空干燥，取样测其取代度为0.3mmol/g。
实施例2、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的合成
在50ml的反应柱中加入3.0克Wang Resin（sub=0.8mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，并用适量DMF洗涤树脂三次。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH (2.89g, 6.3mmol)，HOBT(1.02g，7.56mmol)，全部混合后，加入DMF(10ml)、DCM(10ml)搅拌溶解完全。然后加入DIC(0.98ml，6.3mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，并加入DMAP（29.3mg，0.24mmol），鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂4次，然后加入乙酸酐（16.2ml、180mmol）、吡啶（（13.8ml、180mmol），反应2h。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。真空干燥，取样测其取代度为0.4mmol/g。
实施例3、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的合成
在50ml的反应柱中加入2.4克Wang Resin（sub=1.0mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，并用适量DMF洗涤树脂三次。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH (2.89g, 6.3mmol)，HOBT(1.02g，7.56mmol)，全部混合后，加入DMF(10ml)、DCM(10ml)搅拌溶解完全。然后加入DIC(0.98ml，6.3mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，并加入DMAP（29.3mg，0.24mmol），鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂4次，然后加入乙酸酐（16.2ml、180mmol）、吡啶（（13.8ml、180mmol），反应2h。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。真空干燥，取样测其取代度为0.6mmol/g。
实施例4、线性卡培立肽- Wang Resin的合成
将5mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin(取代度=0.4mmol/g)用DMF溶胀30分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(9.732g，15mmol)、HOBT(2.027g，15mmol)，全部混合后加入DMF(30ml)、DCM(30ml)搅拌溶解完全。然后加入DIC(2.355ml，15mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应2h。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽- Wang Resin 47.233g， 树脂合成收率106.3%。
实施例5、线性卡培立肽- Wang Resin的合成
将5mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin(取代度=0.4mmol/g)用DMF溶胀30分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(9.732g，15mmol)、PyBOP(7.806g，15mmol)、HOBT(2.027g，15mmol)，全部混合后加入DMF(30ml)、DCM(30ml)搅拌溶解完全。然后加入NMM(3.33ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应2h。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽- Wang Resin 47.695g， 树脂合成收率108.1%。
实施例6、线性卡培立肽- Wang Resin的合成
将5mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin(取代度=0.4mmol/g)用DMF溶胀30分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(9.732g，15mmol)、PyBOP(7.806g，15mmol)、HOBT(2.027g，15mmol)，全部混合后加入DMF(30ml)、DCM(30ml)搅拌溶解完全。然后加入DIPEA(4.965ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应2h。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽- Wang Resin 47.102g， 树脂合成收率105.8%。
实施例7、线性卡培立肽- Wang Resin的合成
将5mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin(取代度=0.4mmol/g)用DMF溶胀30分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(9.732g，15mmol)、TBTU(4.817g，15mmol)、HOBT(2.027g，15mmol)，全部混合后加入DMF(30ml)、DCM(30ml)搅拌溶解完全。然后加入NMM(3.33ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应2h。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽- Wang Resin 46.936g， 树脂合成收率105.1%。
实施例8、线性卡培立肽- Wang Resin的合成
将5mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin(取代度=0.4mmol/g)用DMF溶胀30分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(9.732g，15mmol)、TBTU(4.817g，15mmol)、HOBT(2.027g，15mmol)，全部混合后加入DMF(30ml)、DCM(30ml)搅拌溶解完全。然后加入DIPEA(4.965ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应2h。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽- Wang Resin 46.835g， 树脂合成收率104.8%。
实施例9、卡培立肽- Wang Resin的固相氧化
称取碘（12.69g，50mmol），加入DMF(100ml)，搅拌溶解完全。将溶解好的碘/DMF溶液加入实施例4-8任意一个实施例制备的线性卡培立肽- Wang Resin，鼓氮气搅拌反应6h。抽干反应液，DMF洗涤树脂6次，甲醇洗涤树脂3次，真空干燥，得卡培立肽- Wang Resin 。
实施例10、卡培立肽- Wang Resin的固相氧化
称取碘（101.52g，400mmol），加入DMF(800ml)，搅拌溶解完全。将溶解好的碘/DMF溶液加入实施例4-8任意一个实施例制备的线性卡培立肽- Wang Resin，鼓氮气搅拌反应1.5h。抽干反应液，DMF洗涤树脂6次，甲醇洗涤树脂3次，真空干燥，得卡培立肽- Wang Resin。
实施例11、卡培立肽- Wang Resin的TFA裂解
称取实施例10所得卡培立肽- Wang Resin至1L圆底烧瓶中，加入500ml 裂解液（TFA：苯甲醚：水=90:5:5），室温反应5h。减压过滤，滤液加入5L的冰冻***沉淀离心。所得粗肽真空干燥后称重17.203g，粗肽收率111.7%。
实施例12：卡培立肽反相高效色谱纯化
1. 样品处理：按照每克粗肽100毫升纯水比例溶解，溶解后的溶液用无机滤膜过滤，收集滤液备用。
2.纯化
条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为：
50mm × 300mm 。流动相：A 相： 0.2%磷酸溶液用三乙胺调pH 至2.5～3.5；B相：乙腈。流速：70-80 ml/min。检测波长：230 nm。梯度：B%：17%～32%（45 min）。进样量为1.3-1.5 g 。
操作：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.3-1.5g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于28 ℃减压旋蒸浓缩至约10～12 mg/ml 后备用。
3、转盐：
条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 50mm × 300mm 。流动相：A 相：质量浓度0.1%的醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈。流速：70-80 ml/min。检测波长：230 nm。梯度：B%：6%～36%（30 min）。进样量为 1.6-2.0g 。
操作：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为160-200ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约50-80mg/ml 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥，得纯度大于98.5%的符合内控标准的卡培立肽，总收率32.1%。
实施例13：卡培立肽反相高效色谱纯化
1. 样品处理：按照每克粗肽100毫升纯水比例溶解，溶解后的溶液用无机滤膜过滤，收集滤液备用。
2.纯化：
条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为： 150 mm × 300 mm 。流动相：A 相： 0.2%醋酸溶液用氨水调pH 至2.5～3.5；B相：乙腈。流速：450-550 ml/min。检测波长：230 nm。梯度：B%：17%～32%（60 min）。进样量为13-15 g 。
操作：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为13-15g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于28 ℃减压旋蒸浓缩至约10-12 mg/ml 后备用。
3、转盐：
条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 150 mm × 300 mm 。流动相：A 相：质量溶度0.1%的醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈。流速：450-550 ml/min。检测波长：280 nm。梯度：B%：6%～36%（60 min）。进样量为 15-20g 。
操作：将色谱柱用50%以上的甲醇冲洗干净后上样，上样量为1500-2000ml样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约50-80mg/ml 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥，得纯度大于98.5%的符合内控标准的卡培立肽，总收率30.1%。
实施例14：卡培立肽反相高效色谱纯化
1. 样品处理：按照每克粗肽100毫升纯水比例溶解，溶解后的溶液用无机滤膜过滤，收集滤液备用。
2.纯化：
条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为：300mm ×300mm 。流动相：A 相： 0.2%醋酸溶液用氨水调pH 至2.5～3.5；B相：乙腈。流速：1900-2200 ml/min。检测波长：230 nm。梯度：B%：17%～32%（120 min）。进样量为55-75 g 。
操作：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为55-75g。线性梯度洗脱120min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液28 ℃减压旋蒸浓缩至约10-12 mg/ml 后备用。
3、转盐：
条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 300mm ×300mm 。流动相：A 相：0.1%醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈。流速：1900-2200 ml/min。检测波长：230 nm。梯度：B%：6%～36%（90 min）。进样量为 55-75g 。
操作：将色谱柱用50%以上的甲醇冲洗干净后上样，上样量为5500-7500ml样品溶液。线性梯度洗脱90min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约50-80mg /ml 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥，得纯度大于98.5%的符合内控标准的卡培立肽，总收率30.3%。
综上所述，本发明采用未经报道的Fmoc固相合成策略合成卡培立肽、反相高效色谱纯化，具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，全部反应的总收率可达30%。本发明具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
Claims (4)
1.一种醋酸卡培立肽的制备方法，包括以下步骤：
1）由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.5mmol/g-1.0mmol/g的Wang Resin反应，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin；
2）将Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽-Wang Resin，所述步骤2）逐一偶联采用偶联剂，偶联剂包括TEA、NMM或DIPEA；
3）采用碘固相氧化合成卡培立肽-Wang Resin，所述采用碘固相氧化合成卡培立肽-Wang Resin时，碘的用量以物质量计，是卡培立肽-Wang Resin物质量的10-80倍，氧化时间是4-16小时；
4）采用TFA裂解，得到粗肽；
5）高效液相纯化卡培立肽，包括以下步骤：
第一步纯化：将合成所得粗肽溶解后用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化；
第二步转盐：采用RP-HPLC法将其转成醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）第一步纯化：以磷酸盐缓冲溶液为A相，缓冲溶液pH范围为2.5-3.5；以色谱纯乙腈为B相，B相的梯度为：17%～32%，进行梯度洗脱纯化45-120min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）第二步RP-HPLC法为：以浓度为0.05--0.1%醋酸盐缓冲溶液作为A相；缓冲溶液pH为3.5～4.4；以色谱纯乙腈作为B相，梯度为：6%～36%，梯度洗脱时间为30-90min，转成醋酸盐。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5）第二步RP-HPLC法为：以浓度为0.05--0.1%醋酸盐缓冲溶液作为A相；缓冲溶液pH为3.5～4.4；以色谱纯乙腈作为B相，梯度为：6%～36%，梯度洗脱时间为30-90min，转成醋酸盐。
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