CN116063451B - 一种卡培立肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种卡培立肽的合成方法，属于多肽合成技术领域。该方法将15，16位的氨基酸采用特殊氨基酸Fmoc‑Ile‑(炔丙基)Gly‑OH；5，6位的氨基酸采用Boc‑Ser(Fmoc‑Ser)‑OH；从碳端到氮端依次按照肽序偶联剩余氨基酸，固相合成全保护卡培立肽，裂解之后，得到卡培立肽线肽。用纯水溶清后，加入PbCl2进一步裂解掉炔丙基，调节pH为碱性，利用Pb氧化形成二硫键，得到卡培立肽。本发明方法，提高了粗肽纯度，极大降低了人工成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域，是一种适用于治疗急性心功能衰竭（包括慢性心功能衰竭加重）疾病药物的合成方法。
背景技术
卡培立肽序列：
H-Ser1-Leu2-Arg3-Arg4-Ser5-Ser6-Cys7-Phe8-Gly9-Gly10-Arg11-Met12–Asp13-Arg14-Ile15-Gly16-Ala17-Gln18-Ser19-Gly20-Leu21-Gly22-Cys23-Asn24-Ser25-Phe26-Arg27-Tyr28-OH
卡培立肽的适应症是急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)。卡培立肽药理学作用是通过刺激心肌伸展，由心室内颗粒合成的，然后通过冠状动脉分布全身，作用于血管平滑肌和肾脏等组织，调节血压和体内电解质平衡。卡培立肽为28个氨基酸组成的一种循环调节激素，起血管扩张和利尿作用。卡培立肽引起的血管舒张是由于与血管平滑肌的ANP(心房利钠多肽)受体结合，通过提高鸟苷酸环化酶的活性而实现的，提示可减轻心脏前、后负荷。
目前卡培立肽的合成方法分为两大类：一是基因重组，二是采用Boc路线液相或固相合成。ZL200510012425.5公开了采用基因重组技术生产卡培立肽的方法，CN102382188报道了一种采用固相Fmoc路线逐个偶联制备卡培立肽的方法，CA1245635A1报道的为采用Boc路线固相合成卡培立肽最后通过HF树脂切割、液相氧化、HPLC（高压液相色谱）纯化等步骤得到精肽，CA1245637A1报道的为采用基因重组技术生产卡培立肽，其它的专利文献如EP0440311A1、JP3004169A、US4673732A等都是或者采用基因重组技术生产卡培立肽或者采用Boc路线固相或液相方法合成得到精肽。采用基因重组技术，操作繁琐，投资大，药物纯度不高，存在较高的技术壁垒。采用Boc路线液相或固相合成，需要使用HF及大量使用TFA，由此带来对环境的严重污染。同时液相法存在操作周期长、操作繁琐等缺点，不利于大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是为解决现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供一种优化的卡培立肽的合成方法。
实现本发明目的是技术方案是：
一种卡培立肽的合成方法，其特点是，该方法包括以下步骤：
（1）卡培立肽序列的第15-16位氨基酸中引入炔丙基Fmoc-Ile-(炔丙基)Gly-OH；卡培立肽序列的第5-6位氨基酸用Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH；
（2）按顺序依次固相合成卡培立肽序列的其他位点氨基酸，合成全保护卡培立肽，经裂解沉淀，溶解，加入PbCl2脱掉炔丙基，调节pH，环化得到卡培立肽。
本发明所述的一种卡培立肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)中，合成各个氨基酸所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBt/DIEA，PyBop/HOBt/DIEA其中的一种或多种。
本发明所述的一种卡培立肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)中，所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合。
本发明所述的一种卡培立肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)中，所使用的Fmoc脱除试剂为v/v20%哌啶/DMF溶液。
本发明所述的一种卡培立肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)中，采用的裂解试剂为：TFA:TA:EDT:苯甲醚=90:5:3:2。
本发明所述的一种卡培立肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)中，环化方法为：溶解后加入PbCl2，调节pH至碱性，氧化形成二硫键。
本发明所述的一种卡培立肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)中，溶解至浓度为2g/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明卡培立肽的制备方法采用了特殊的保护氨基酸：Fmoc-Ile-(炔丙基)Gly-OH，Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH。引入炔丙基提高了肽链的延展性，克服了困难肽序难联的问题，极大得提高了粗肽产率；调节pH弱碱性，利用PbCl2脱去炔丙基的同时，还能进行二硫键的氧化，一锅法极大的简化了合成步骤，降低了人工成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。
附图说明
图1是本发明实施例1得到的粗肽的色谱图；
图2是本发明实施例2得到的粗肽的色谱图；
图3是本发明实施例3得到的粗肽的色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1：
卡培立肽肽树脂的制备（依次合成）
称取Wang Resin 30.00g(Sub=0.42mmol/g)加入到固相反应器中，加入200mLDCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，DMF洗涤3遍。加入16.0g Fmoc-Tyr（tBu）-OH、DIC、DMAP、DMF偶联3h，然后抽掉溶剂，洗涤三遍。加入Ac2O:吡啶封端，测得取代度为0.33mmol/g。
称取30g Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin(Sub=0.33mmol/g)加入200mLDMF溶胀1h。抽掉溶剂，加入200mLv/v20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应15+15min。抽干，加入DMF250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 21.41g，HOBt4.82g，DIC5.5mL，200mLDMF溶液，冰浴活化10分钟，活化温度不超过10摄氏度。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。
重复以上步骤，按照氨基酸序列Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH 、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应。偶联结束后，加入DMF250mL洗涤3次，随后加入200mLv/v20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应15+15min。抽干，DMF250mL洗涤6次。DCM与MeOH交替洗涤各3次，每次400mL，茚检结果呈阳性。真空干燥，得到卡培立肽肽树脂。
裂解：
配制500mL裂解试剂为TFA:TA:EDT:苯甲醚=90:5:3:2，冰浴条件下加入全保护肽，室温继续反应2h，反应结束后，加入无水异丙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入异丙醚3000mL洗涤。干燥后所得产品即为卡培立肽线肽35.65g。
环化：
向环化罐中加入19L纯化水，称取38.60g的线性肽，将其加入环化罐中并搅拌均匀，浓度为2g/L左右。
缓慢滴加碘乙醇溶液，进行环化；用Ellmans试剂进行巯基检测，呈阴性反应结束。滴抗坏血酸至粗肽溶液呈无色，静置1小时；用0.45um微孔滤膜过滤，收集滤液，取样检测。粗肽经对照品定量为20.50g，总收率40.50%，纯度41.97%；粗肽的色谱图参照图1。
实施例2：
卡培立肽肽树脂的制备（Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH）
称取Wang Resin 30.00g(Sub=0.42mmol/g)加入到固相反应器中，加入200mLDCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，DMF洗涤3遍。加入16.0g Fmoc-Tyr（tBu）-OH、DIC、DMAP、DMF偶联3h，然后抽掉溶剂，洗涤三遍。加入Ac2O:吡啶封端，测得取代度为0.33mmol/g。
称取30g Fmoc-Tyr（tBu）-Wang Resin(Sub=0.33mmol/g)加入200mLDMF溶胀1h。抽掉溶剂，加入200mLv/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应15+15min。抽干，加入DMF250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 21.41g，HOBt 4.82g，DIC 5.5mL，200mL DMF溶液，冰浴活化10分钟，活化温度不超过10摄氏度。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。
重复以上步骤，按照氨基酸序列Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应。偶联结束后，加入DMF250mL洗涤3次，随后加入200mLv/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应15+15min。抽干，DMF250mL洗涤6次。DCM与MeOH交替洗涤各3次，每次400mL，茚检结果呈阳性。真空干燥，得到卡培立肽肽树脂。
裂解：
配制500mL裂解试剂为TFA:TA:EDT:苯甲醚=90:5:3:2，冰浴条件下加入全保护肽，室温继续反应2h，反应结束后，加入无水异丙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入异丙醚3000mL洗涤。干燥后所得产品即为卡培立肽线肽37.65g。
环化：
向环化罐中加入19L纯化水，称取38.60g的线性肽，将其加入环化罐中并搅拌均匀，浓度为2g/L左右。
缓慢滴加碘乙醇溶液，进行环化；用Ellmans试剂进行巯基检测，呈阴性反应结束。滴抗坏血酸至粗肽溶液呈无色，静置1小时；用0.45um微孔滤膜过滤，收集滤液，取样检测。粗肽经对照品定量为23.50g，总收率53.70%，纯度49.80%。粗肽的色谱图参照图2。
实施例3：
卡培立肽肽树脂的制备（Fmoc-Ile-(炔丙基)Gly-OH、Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH）
称取Wang Resin 30.00g(Sub=0.42mmol/g)加入到固相反应器中，加入200mLDCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，DMF洗涤3遍。加入16.0g Fmoc-Tyr（tBu）-OH、DIC、DMAP、DMF偶联3h，然后抽掉溶剂，洗涤三遍。加入Ac2O:吡啶封端，测得取代度为0.33mmol/g。
称取30g Fmoc-Tyr（tBu）-Wang Resin(Sub=0.33mmol/g)加入200mLDMF溶胀1h。抽掉溶剂，加入200mLv/v20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应15+15min。抽干，加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 21.41g，HOBt 4.82g，DIC 5.5mL，200mL DMF溶液，冰浴活化10分钟，活化温度不超过10摄氏度。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。
重复以上步骤，按照氨基酸序列Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-(炔丙基)Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应。偶联结束后，加入DMF250mL洗涤3次，随后加入200mLv/v20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应15+15min。抽干，DMF250mL洗涤6次。DCM与MeOH交替洗涤各3次，每次400mL，茚检结果呈阳性。真空干燥，得到卡培立肽肽树脂。
裂解：
配制500mL裂解试剂为TFA:TA:EDT:苯甲醚=90:5:3:2，冰浴条件下加入全保护肽，室温继续反应2h，反应结束后，加入无水异丙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入异丙醚3000mL洗涤。干燥后所得产品即为卡培立肽线肽38.65g。
环化：
向环化罐中加入19L纯化水，称取38.60g的线性肽，将其加入环化罐中并搅拌均匀，浓度为2g/L左右。
加入PbCl2脱掉炔丙基，调节pH至碱性，氧化形成二硫键；用Ellmans试剂进行巯基检测，呈阴性反应结束。静置1小时；用0.45um微孔滤膜过滤，收集滤液，取样检测。粗肽经对照品定量为29.50g，总收率67.50%，纯度76.09%；粗肽的色谱图参照图3。
Claims (6)
1.一种卡培立肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤： 固相合成全保护卡培立肽，经裂解沉淀，溶解，加入PbCl2脱掉炔丙基，调节pH，环化得到卡培立肽；所述固相合成全保护卡培立肽中，卡培立肽序列的第15-16位氨基酸中采用Fmoc-Ile-(炔丙基)Gly-OH进行偶联反应，卡培立肽序列的第5-6位氨基酸采用Boc-Ser(Fmoc-Ser)-OH进行偶联反应，卡培立肽的其他位点氨基酸按顺序依次合成。
2.根据权利要求1所述的一种卡培立肽的合成方法，其特征在于，所述步骤中，合成各个氨基酸所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBt/DIEA，PyBop/HOBt/DIEA其中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种卡培立肽的合成方法，其特征在于，所述步骤中，合成全保护卡培立肽所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种卡培立肽的合成方法，其特征在于，所述步骤中，采用的裂解试剂为：TFA:TA:EDT:苯甲醚=90:5:3:2。
5.根据权利要求1所述的一种卡培立肽的合成方法，其特征在于，所述步骤中，环化方法为：溶解后加入PbCl2，调节pH至碱性，氧化形成二硫键。
6.根据权利要求5所述的一种卡培立肽的合成方法，其特征在于，所述步骤中，溶解至浓度为2g/L。
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