CN104374861A - 一种用hplc分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药有关物质的方法，所述方法采用十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱，再用阴离子对试剂溶液作为缓冲液进行洗脱，并以紫外检测器对利奥西呱原料药中的有关物质进行检测。本发明所述分析方法具有专属性好，灵敏度高，准确度好，有较好的稳定性指示能力。

Description

一种用HPLC分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法

技术领域

本发明涉及医药化工领域，更具体地，涉及一种采用高效液相色谱法分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法。

背景技术

利奥西呱，化学名为N-[4,6-二氨基-2-[1-[(2-氟苯基)甲基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基]-N-甲基氨基甲酸甲酯(简称为RCGT)，其结构式如下：

CAS：625115-55-1      分子量：422.42

是由德国拜耳制药公司研发的能够激发可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的化合物，sGC通过作用于cGMP而调节多重血管床的血管舒张作用，可用于治疗心血管病证或/和性功能障碍。目前，拜耳制药公司研制的用于治疗肺动脉高压(PAH)的口服片剂已经获得FDA批准，商品名为Adempas。

在中国专利CN 1330649C中公开了利奥西呱、其异构体和水合物的三种制备方法，其中一种制备方法中涉及到2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺(以下简称为RCGT 02，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)和4,6-二氨基-2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯(以下简称为RCGT 03，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)等多个中间体。另外，利奥西呱原料药中还可能含有其异构体(以下简称为RCGT 3-F，可以参照专利文献中利奥西呱的制备方法获得)。以上所述的三个化合物为利奥西呱原料中较为常见的工艺杂质，具体结构式如下：

RCGT 02  

RCGT 03

RCGT 3-F  

因此，为了控制利奥西呱原料药的质量，需要控制以上所述的三个工艺杂质以及其他杂质。

在目前现有技术中，中国专利CN 1330649C公开了一种用于检测利奥西呱化合物及其中间体纯度的方法。其中所述方法特征是采用带有DAD检测器的HP100高效液相色谱仪；色谱柱是KromasilRP-18,60mm×2mm，3.5μm；洗脱剂：A相是0.5％HClO₄水溶液，B相是乙腈；梯度程序：0min，2％的B相，0.5min，2％的B相，4.5min，90％的B相，6.5min，90％的B相；流速是0.75ml/min；柱温是30℃；检测波长是UV 210nm。所述方法适合于利奥西呱合成反应时监控反应产物纯度，并不适用于对利奥西呱原料的质量监控，特别是对其原料药的有关物质项目进行检测。另外，以0.5％HClO₄水溶液作为流动相也不太安全，其高氧化性、腐蚀性可能会对检测样品的稳定性照成影响；对分析检测仪器进行腐蚀，缩短分析仪器的寿命。

在现有的技术中，没有公开适合于分析检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法。本发明提供一种适合于分离检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法。

发明内容

发明概述

由于利奥西呱化合物及其有关物质的结构式的特点，含有多氨基的化合物，在反相色谱中一般都会有比较好的亲水性，根据相似相溶的原理，其在水相流动相中的溶解度比较大，而在色谱柱固定相(有机相)中的溶解度较小，因此在反相色谱中出峰会比较快，而且利奥西呱及其有关物质的分离度将不会很理想。又因为利奥西呱及其有关物质多氨基的特点，其很容易和色谱柱上的硅羟基作用，而导致拖尾、峰型的对称性不好、柱效差等问题，在分析定量检测过程中精密度和准确度都会比较差。

本发明人在通过多次实验，在高效液相色谱仪中采用反相色谱柱，如以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱，再用阴离子对试剂溶液作为缓冲液进行洗脱。由于阴离子对试剂可以和氨基基团进行结合，可以有效的阻挡了氨基基团和硅羟基作用，从而获得优秀的柱效；另外由于离子对试剂和氨基基团相结合，可以增加利奥西呱及其有关物质的亲油性，加强其在反相色谱柱的固定相上的保留，提高利奥西呱及其有关物质的分离度。

本发明人提供的采用高效液相色谱法分离检测利奥西呱原料药的有关物质的方法能够有效的分离利奥西呱及其有关物质，准确定量各主要杂质的含量。所述分析方法具有专属性好，灵敏度高，准确度好，有较好的稳定性指示能力。

本发明旨在提供一种采用HPLC分离检测利奥西呱原料药的有关物质的方法。

术语定义

术语“约”在本发明中是指在所述数值的±10％以内。

术语“w/v”在本发明中是指每100ml溶剂中含有溶质的克数。

发明详述

本发明提供的一种采用HPLC分离检测利奥西呱原料药的有关物质的方法，其特征是在高效液相色谱***中，采用反相色谱柱(如以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱)；流动相由作为A相的阴离子对试剂水溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成，进行洗脱；采用紫外检测器对利奥西呱原料药的有关物质进行检测。

其中，本发明所述的方法是采用梯度洗脱的方法进行。梯度洗脱至少包含两个阶段梯度变化，其中第一阶段梯度变换是在0～60min的时间内，A相在流动相中的含量是66％～80％，体积比；第二阶段梯度变化是第一阶段梯度变化的时间基础上在接下来的10～60min的时间内进行，A相在流动相中的含量由66％～80％变化至31.5％～38.5％，体积比。

更进一步地，还可以包括第三阶段的梯度变换，所述梯度变化是在第二阶段梯度变化完成后接下来的1～10min内将流动相中A相的含量变化为第一阶段时A相的初始含量，并保持运行5～20min。该阶段可以省去梯度洗脱后的再平衡步骤，并把过度的时间应用到分析检测的时间内，有效地缩短了分析检测的时间。

其中所述的组成A相或B相的有机溶液可以是一致的，也可以是不一致的；优选地所述的组成A相或B相的有机溶液是一致的；所述有机溶液可以是甲醇、乙腈或其混合物；优选乙腈。

其中，当A相是阴离子对试剂水溶液与有机溶液的混合液时，有机溶液的含量是0％～50％，或是5％～20％，优选10％，体积比。

在一些实施例中，本发明所述方法的色谱柱可以是以辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱，柱温可以是20～60℃；在一些实施例中色谱柱是Agilent RX C8，4.6X250mm，5μm，柱温是40℃。

在一些实施例中，本发明所述的方法的紫外检测器的检测波长可以是210～280nm，更加优选的是260nm。检测波长的选择可以根据待测化合物的紫外吸收强度进行适当调节，是分析领域的公知常识，在获得待测物的紫外吸收曲线的前提下，替换是可以预测的。

在一些实施例中，本发明所述的方法的流速可以是0.2～2ml/min；优选的是0.5～1.5ml/min；更加优选的是1.0ml/min。

本发明所述的阴离子对试剂可以是选自辛烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或几种。根据分析领域普通技术人员可以知道离子试剂主要是通过其带负电的烷基磺酸根能够与待测化合物的带正电的阳离子结合，如氨基，起到优化分离效果和柱效的作用。在分析领域，多种烷基磺酸钠盐之间的替换是常见的。

在一些实施例中，本发明所述的阴离子对试剂水溶液中，阴离子对试剂的浓度可以是约0.1～10g/L，优选地可以是约0.5～5g/L；其中所述的阴离子对试剂的水溶液还加入了约0.1～10ml，优选地可以是约0.5～5ml的分析纯磷酸溶液，所述分析纯磷酸是指浓度为85％的磷酸，w/v。以上所述的阴离子对试剂水溶液中离子对的浓度和磷酸加入量可以根据分析方法的需要适当调节。

在一些实施例中，所述的阴离子对试剂水溶液是含有浓度是约2g/L的辛烷磺酸钠的水溶液，其中加入分析纯磷酸的量是2ml，所述磷酸的浓度是85％，w/v。

在一些实施例中，本发明所述的采用HPLC分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法，其特征是：

色谱柱：Agilent RX C8，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长210～280nm；

流速：0.9～1.1ml/min；

柱温：20～60℃；

梯度洗脱：

A相：加入2ml磷酸溶液的浓度为约2g/L的辛烷磺酸钠水溶液：乙腈＝90:10，体积比，其中磷酸溶液的浓度是约85％，w/v；

B相：乙腈。

本发明所述的用HPLC分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法的供试品溶液中利奥西呱的浓度可以是0.6～5.0mg/ml，其中，配制样品的稀释液可以是水和二甲基亚砜(以下简称为DMSO)的混合溶液。其中进样体积可以是1～100μl，在一些实施例中，供试品溶液中利奥西呱的浓度是1.2mg/ml，其中进样体积是10μl。

本发明所述的用HPLC分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法，可以是采用未加校正因子的主成分自身对照法进行计算利奥西呱原料药的有关物质的含量。

本发明所述的用HPLC分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法适合测定利奥西呱原料中有关物质的含量，特别适合于分离检测RCGT 02、RCGT 03和RCGT 3-F的含量。

附图说明

图1示实施例1专属性实验的空白溶液的色谱图

图2示实施例1专属性实验的***适用性溶液的色谱图

图3示实施例1专属性实验的中间体加标液的色谱图

图4示实施例1专属性实验的供试品溶液的色谱图

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

本发明所提供的分析方法中用到的试剂均是符合中国药典2010版的分析试剂要求。

实施例1专属性实验

色谱条件：

仪器：安捷伦高效液相色谱仪1260；

色谱柱：Agilent RX C8，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长260nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

梯度洗脱：

A相：加入2ml磷酸溶液的浓度为约2g/L的辛烷磺酸钠水溶液：乙腈＝90:10，体积比，其中磷酸溶液的浓度是约85％，w/v；

B相：乙腈。

实验步骤：

稀释液(空白溶液)：DMSO：水＝3:1，体积比。

***适用性溶液：取利奥西呱约60mg，精密称定至50ml容量瓶中，加入其异构体杂质(RCGT 3-F)适量，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀。

中间体加标液：取利奥西呱约60mg，精密称定至50ml容量瓶中，加入中间体(RCGT02、RCGT03)杂质适量，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为中间体加标液。

供试品溶液：取利奥西呱约60mg，精密称定至50mL量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

分别取空白溶液、***适用性溶液、中间体加标液和供试品溶液，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图。空白图谱如图1，***适用性溶液图谱如图2，中间体加标液图谱如图3和供试品溶液图谱如图4。按面积归一化法计算利奥西呱原料药主要有关物质的含量。检测结果如表1。

表1

实施例2耐用性实验

本实施例通过改变部分色谱条件的参数考察色谱方法的耐用性，以如下色谱条件为基础：

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；

色谱柱：Agilent RX C8，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长260nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

梯度洗脱：

A相：加入2ml磷酸溶液的浓度为约2g/L的辛烷磺酸钠水溶液：乙腈＝90:10，体积比，其中磷酸溶液的浓度是约85％，w/v；

B相：乙腈。

以单因素变化的方式考察改变流速、色谱柱温度、更换不同生产系列号的Agilent RX C8，4.6×250mm，5μm色谱柱或流动相组成的起始比例等色谱条件对检测***适应性溶液和灵敏度溶液的影响。主要考察改变色谱条件对***适应性溶液中利奥西呱和RCGT 3-F的分离度以及灵敏度溶液响应的影响。

稀释液(空白溶液)：DMSO：水＝3:1，体积比。

***适应性溶液：取利奥西呱约60mg，精密称定至50ml容量瓶中，加入其异构体杂质(RCGT 3-F)适量，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：取利奥西呱样品约60mg，精密称定至50mL容量瓶内，用37mlDMSO溶解，加水稀释至刻度，摇匀，即得；

对照溶液：精密移取1ml供试品溶液至100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液5ml至50ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，即得；

灵敏度溶液：精密移取对照溶液5ml至10ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，利奥西呱浓度为约0.6μg/ml。

在各考察色谱方法下，分别取***适应性溶液和灵敏度溶液各进一针，检测结果如表2。

表2

实施例3精密度实验

色谱条件如实施例1所述色谱条件。

稀释液(空白溶液)：DMSO：水＝3:1，体积比。

对照溶液按实施例2中的对照溶液配制方法配制。

杂质对照储备液：取RCGT 3-F对照品37.5mg，精密称定，置于25ml的容量瓶中，加18mlDMSO溶解，再加入水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml至100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度。

分析重复性实验溶液：取供试品60mg，精密称定，置于50mL容量瓶内，加入37mlDMSO溶解，精密移取上述杂质对照储备液6ml至上述容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。

待基线平衡后，取对照溶液进样2针，取6份分析重复性实验溶液各进样1针，记录色谱图。按不加校正因子的自身对照法计算6份分析重复性试验溶液中杂质RCGT 3-F的含量、标准偏差值(SD)、相对标准偏差值(RSD)，检测结果如表3。

表3

实施例4回收率试验

色谱条件如实施例1所述色谱条件。

稀释液(空白溶液)：DMSO：水＝3:1，体积比。

供试品溶液按实施例2中的供试品溶液的配制方法配制。

对照品溶液按实施例2中的对照品溶液的配置方法配制。

杂质母液的配制：分别精密称取约50mg利奥西呱对照品和75mg杂质RCGT 3-F对照品至50ml容量瓶中，先加入37mlDMSO溶解，再用水稀释至刻度，摇匀；精密移取1ml上述溶液至100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。

回收率实验溶液：取供试品适量至容量瓶中(最终浓度1.2mg/ml)，先分别加入适量的DMSO溶解，分别按下表4精密量取不同体积的杂质母液于上述容量瓶中，再用水定容至刻度，摇匀，每个浓度配制3份，即得杂质RCGT 3-F的3(份)×3(浓度)共9份回收率供试液。

表4

待***适用性合格后，取对照溶液连续进样2针，再取2份供试品溶液各进1针，各浓度水平下回收率实验溶液各进样1针，记录色谱图。计算并报告9份样品的回收率单值，平均回收率(n＝9)的95％置信区间和回收率(n＝9)的相对标准偏差值(RSD)。按照不加校正因子的自身对照法计算杂质RCGT 3-F的含量，然后按照以下公式分别计算各浓度水平下回收率实验溶液中杂质RCGT 3-F回收率，检测结果见表5和表6。

式中：

C₀：加标前供试品溶液中杂质RCGT 3-F含量(取2份结果的均值)，％；

C₁：回收率实验溶液中杂质RCGT 3-F的含量，％；

W₁：回收率实验溶液中供试品的称样量，mg；

Wr：加入回收率实验溶液中的杂质RCGT 3-F质量，mg；

表5

表6

综上所述，

实施例1的实验结果和图谱1-4表明，本发明提供的方法在检测利奥西呱原料药有关物质，特别是RCGT 02、RCGT 03和RCGT 3-F有关物质时，空白无干扰，具有很好的专属性，其中RCGT 02、RCGT 03和RCGT 3-F与相邻杂质或RCGT的分离度均为2.0以上。RCGT 3-F在供试品溶液中的检测度为0.07％，因此所述方法的灵敏度很高。

实施例2的实验结果表明在单因素改变部分色谱参数的情况下，本方法依然适用于检测利奥西呱原料药有关物质，其中考察的***适应性溶液的分离度和灵敏度溶液的响应情况受影响不大，所述方法具有较好的耐用性，在适当范围内变更色谱条件完全不影响本发明方法实现分析目的。

实施例3的实验结果表明采用本发明提供的分析方法测定含有RCGT 3-F杂质的精密度溶液，进样6针后测定RCGT 3-F杂质的测定含量的相对标准偏差值是0.32％。

实施例4的实验结果通过测定原料药中含有不同浓度水平的RCGT 3-F杂质的回收率，考察本发明的分析方法在测定有关物质的准确性。经实验结果表明，不同浓度水平的RCGT 3-F杂质的回收率均在95％以上，平均回收率是97.04％，多个样品回收率的相对标准偏差是1.21％。因此所述方法在测定利奥西呱原料药有关物质中具有很好的准确性。

因此，本发明所述的分析方法在测定利奥西原料药有关物质具有专属性好，灵敏度高，重现性好，准确度高等优点。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，其特征是：采用以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱；流动相由作为A相的阴离子对试剂水溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成，进行洗脱；采用紫外检测器对利奥西呱原料药的有关物质进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是采用梯度洗脱的方式进行的，其中梯度洗脱至少包含两个阶段梯度变化，其中第一阶段梯度变换是在0～60min的时间内，A相在流动相中的含量是66％～80％，体积比；第二阶段梯度变化是第一阶段梯度变化的时间基础上在接下来的10～60min内进行，A相在流动相中的含量由66％～80％变化至31.5％～38.5％，体积比。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的A相是由阴离子对试剂水溶液与有机溶液组成的，其中阴离子对试剂水溶液与有机溶液的体积比是约0％～50％。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述的有机溶液是甲醇、乙腈或其混合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中紫外检测器的检测波长在210～280nm之间；流动相流速是0.5～1.5ml/min；色谱柱温度是20～60℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的阴离子对试剂是选自辛烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的阴离子对试剂水溶液中阴离子对试剂的浓度是约0.5～5g/L；其中所述的阴离子对试剂水溶液还加入了是约0.5～5ml的分析纯磷酸溶液，所述分析纯磷酸是指浓度为85％的磷酸，w/v。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的阴离子对试剂水溶液是含有浓度是约2g/L的辛烷磺酸钠的水溶液，其中加入分析纯磷酸的量是2ml，所述磷酸的浓度是85％，w/v。

9.一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，其特征是：

色谱柱：Agilent RX C8，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长260nm；

流速：0.9～1.1ml/min；

柱温：20～60℃；

梯度洗脱：

A相：加入2ml磷酸溶液的浓度为约2g/L的辛烷磺酸钠水溶液：乙腈＝90:10，体积比，其中磷酸溶液的浓度是约85％，w/v；

B相：乙腈。

10.根据权利要求9所述的方法，其中供试品溶液中利奥西呱的浓度是0.6～5.0mg/ml，其中，配制样品的稀释液是水和二甲基亚砜的混合溶液，其中进样体积是1～100μl。