CN102368068A - 检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明“检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒”,属于医学检测试剂。包括包被亲和素的微孔板,生物素化的肺炎衣原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物。本发明以亲和素包被微孔板,通过亲和素-生物素***间接包被生物素化的抗原,不仅便于放大生产、易于监控生产过程,而且避免了直接包被固相存在的活性损失大、工艺优化繁琐等缺点,同时保证了批次间的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测试剂,特别是一种检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒。
背景技术
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)是1989年确定的一种严格真核细胞内寄生的原核细胞微生物,根据2004年公布的伯杰氏细菌分类学手册,已被更名为肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn),与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体共同组成嗜衣原体属。CPn基因组大小约1.2Mbp,由21个Pmp基因,一个III型分泌毒力因子***,3个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,2个磷脂酶-D样蛋白基因组成。
Cpn的感染极为普遍,呈世界性的分布,主要引起人类的呼吸道感染,与人口密度呈正相关,在临床上多以隐性、持续性感染形式存在,反复迁延导致难以治疗的并发症,与哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病等心脑血管疾病的发生和发展密切相关。儿童感染率在20%左右,随着年龄的增加感染率迅速上升,青壮年可达50-60%,老年70-80%。肺炎衣原体通过呼吸道分泌物的进行人与人传播,家庭、学校、军队以及其他人口集中的工作区域可存在小范围的流行。目前,肺炎衣原体已是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的主要病原体,肺炎衣原体急性感染率占23%,肺炎病人仅占感染者的小部分,70-90%为亚临床表现。肺炎衣原体感染的潜伏期为15-23天,可引起上呼吸道感染,如鼻窦炎、中耳炎和咽炎,也可引起下呼吸道感染,如支气管炎和肺炎。呼吸道感染多数表现为咽痛、发热、咳嗽,病情通常较轻,有自限性。老年肺炎衣原体肺炎病人症状可能较为严重,有时甚至致死,尤其是合并细菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病等时。因此,Cpn感染早期诊断对于尽早发现和治疗Cpn感染性疾病非常重要。
目前对Cpn的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、核酸检测技术、血清学诊断技术等方法,国际上尚无公认的标准方法。其中病原体分离培养技术,由于CPn的抵抗力较弱,对室温或冰冻敏感,难以从临床标本中分离培养成功,一般实验室难以开展,已逐渐为其他快速检测方法所取代。补体结合试验虽然试验条件要求低,不需要特殊仪器,但具有影响因素复杂、操作步骤繁锁等缺陷。微量免疫荧光(micro-immunofluorescence,MIF)是目前CPn感染诊断最常用且最敏感的血清学方法,其结果被认为是检测CPn感染的“金标准”。其缺点是非常费时费力,MIF检测结果的可靠性在很大程度上依赖于抗原的制备和检测者的个人经验,实验操作的主观性很大,仅限于少数研究实验室使用。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,使其得到迅速的发展和广泛应用,成为最广泛应用的检测方法之一。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)是近年来继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种高灵敏度的微量测定技术。具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速等优点,作为放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者,是当前最理想的免疫分析方法。
亲和素-生物素***在免疫分析中的应用有多种形式,其中包括信号放大、间接包被等形式。信号放大指生物素化的抗原或抗体与酶标亲和素反应体系,其优点是利用生物素-亲和素放大效应提高检测灵敏度,缺点是亲和素的等电点较高,对聚苯乙烯等固相载体有较高的非特异性吸附,因而导致本底较高。
发明内容
本发明根据上述领域的存在的空白和需求,提供一种检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒,实验证明,具有操作简便,灵敏度高,特异性好的优点。
检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒,包括包被亲和素的微孔板,生物素化的肺炎衣原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物,所述化学发光底物包括底物液A和底物液B,其中A液为的组成为:pH值为7.2~8.5,浓度为10~30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02~0.1%Proclin300,0.1~1.0%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02~0.1%Proclin300,1.0~3.0mM的4-碘苯酚,0.1%~1%的BSA,0.1~1%的溴化十六烷基三甲基铵,10~50mM鲁米诺溶液。
所述生物素化的肺炎衣原体抗原采用如下方法制备而得:(1)生物素溶于N,N-二甲基甲酰胺终浓度为1mg/mL;(2)用0.1mol/L pH 9.0的NaHCO3衣原体抗原稀释为1~2mg/mL;(3)按生物素与抗原重量比1∶7左右混合,室温搅拌下反应2~4h;(4)装入透析袋,用0.05mol/L pH7.2的PBS,4℃透析过夜得到生物素化抗原,透析产物加等体积甘油溶解备用。
所述包被亲和素的微孔板制备方法为:用pH 9.6的碳酸盐缓冲液配制成2ug/ml的亲和素包被液包被微孔板。
所述试剂盒还包括稀释液,洗涤液,衣原体抗体IgM阴性对照、阳性对照、校准品,辣根过氧化物酶标记的抗人IgM。
所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗。
本发明的试剂盒采用亲和素包被微孔板,与生物素化抗原和待测样本中肺炎衣原体IgM形成固相亲和素-生物化抗原-抗体复合物,再与标记的抗人IgM形成固相亲和素-生物素化抗原-抗体-标记二抗夹心复合物,然后加入化学发光底物,利用化学发光仪检测相对发光强度,定性或半定量检测待测样本中肺炎衣原体IgM抗体,从而避免了酶免试剂存在的灵敏度低、部分底物有毒或致癌等缺点,该试剂盒具有反应速度快、光信号不受温度变化影响、成本低、易储存等优势,可为临床肺炎衣原体相关的急性呼吸道疾病辅助诊断提供更为特异、快速、可靠的诊断依据。
本发明的了一个主要的贡献在于提供了一种新的化学发光底物液配方,与采用现有常规底物液配方的试剂盒相比,具有灵敏度高,稳定性好等优点。
具体实施方式
实施例1本发明的试剂盒制备方法
1、本发明试剂盒包括:
1)肺炎衣原体IgM阳性对照;2)肺炎衣原体IgM阴性对照;3)肺炎衣原体IgM校准品;4)包被亲和素的微孔板;5)生物素化的肺炎衣原体抗原;6)抗人IgM酶标记物;7)20倍浓缩洗涤液;以及8)化学发光底物液。
其中,微孔板为24、48或96孔的微孔板条;
抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗;
酶为辣根过氧化物酶;
化学发光底物液:A液和B液。
2、本发明I号试剂盒的制备方法:
以肺炎衣原体IgM阳性血清配制阳性对照,以健康人血清配制阴性对照,以肺炎衣原体IgM阳性血清配制校准品,微孔板包被亲和素,使肺炎衣原体抗原生物素化,标记抗人IgM,配制化学发光底物,分装上述组份,以及组装为成品。
2.1微孔板包被亲和素:
2.1.1包被
用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液,并将包被液负载于微孔板(100ul/孔)
亲和素包被液配方
2.1.2封闭用含BSA,pH值为7.0-7.5,浓度为10mM的Tris缓冲液作为封闭液封闭上述洗涤后的固相载体。
封闭液配方
2.2酶标抗人IgM抗体的制备采用改良的过碘酸钠法。具体步骤参见《生物化学与生物物理学报》16卷1984年第6期,骆加里等“过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法”。
2.3生物素偶联肺炎衣原体抗原的制备
(1)将生物素BNHS(购自美国Sigma)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/mL;
(2)用0.1mol/L pH值为9.0的NaHCO3将纯化的衣原体抗原(购自广州贵翔)稀释为1~2mg/mL;(3)按BNHS与抗原容积比为1∶8或重量比1∶7左右混合,室温搅拌下反应2-4h;(4)装入透析袋对0.05mol/L pH值为7.2的PBS,4℃透析过夜,结合物加等体积甘油,小量分装,-20℃以下保存备用。
2.4生物素化抗原、酶标记抗体稀释液的配制
2.5生物素化抗原和酶标记抗人IgM工作液的配制
将制备的生物素化抗原、酶标记抗人IgM抗体用稀释液分别稀释成不同浓度,使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为分别为1∶3000、1∶7000(V/V)。
2.620倍洗涤液配方
使用时双蒸水稀释20倍。
2.7HRP化学发光底物
A液和B液各1瓶,A液和B液各1瓶,其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为10mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.02%Proclin300,1.0%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02%Proclin300,2mM的4-碘苯酚,0.1%的BSA,0.1%的溴化十六烷基三甲基铵,10Mm鲁米诺溶液。
II号试剂盒:
其它同I号试剂盒,HRP化学发光底物的配方为:A液和B液各1瓶,其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.05%Proclin300,0.5%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.05%Proclin300,3mM的4-碘苯酚,1%的BSA,1%的溴化十六烷基三甲基铵,50mM鲁米诺溶液。
III号试剂盒:
其它同I号试剂盒,HRP化学发光底物的配方为:A液和B液各1瓶,其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为20mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.04%Proclin300,0.1%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.04%Proclin300,2mM的4-碘苯酚,0.7%的BSA,0.4%的溴化十六烷基三甲基铵,30mM鲁米诺溶液。
对照试剂盒:其它同I号试剂盒,而化学反光底物为市售化学发光底物(A液为过氧化脲溶液,B液为鲁米诺溶液,购自湖州英创生物科技有限公司)。
3、本发明的试剂盒的使用方法
1)自2-8℃冰箱中取出试剂盒,室温平衡15分钟。
2)取出包被板条,***板架上。
3)每次试验设阴性对照、阴性对照、校准品各2孔每孔50ul,预稀释(1∶100)的待测样本50ul,然后每孔加入50ul生物素化抗原,振荡混匀后37℃温育30分钟。
4)甩去反应液,每孔加满稀释后的洗涤液,洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干。
5)每孔分别加入100μL酶标记物,37℃温育20分钟。
6)甩去反应液,每孔加满稀释后的洗涤液,洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干。
7)各孔加化学发光底物液A、B各50μL,用微量震荡器充分振荡混合均匀,室温(20~25℃)避光反应5分钟。
8)必须于加化学发光底物液后的第5~30分钟内测量,在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1秒/孔。
9)以校准品临界值,定性或半定量判定待测样本中是否存在肺炎衣原体IgM抗体或其含量
4、本发明I号试剂盒与酶联免疫试剂的平行对比试验
对正常对照样本358例,呼吸道感染样本254例(源自梧州市肿瘤防治研究所)采用本发明的试剂盒(化学发光法)与肺炎衣原体IgM抗体检测试剂(酶联免疫法)进行平行检测,检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。
表1.肺炎衣原体IgM抗体检测试剂(酶联免疫法)测定结果
表2.本发明I号试剂盒测定结果
表3.本发明I号试剂盒与肺炎衣原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)的比对
表1-3所述数据表明,本发明试剂盒与对比酶联免疫检测试剂盒的阳性符合率为89.9%,阴性符合率为99.8%,两种检验方法的符合率为98%。经验证,酶联免疫检测试剂盒检出1份假阳性、11份假阴性,而本发明试剂盒检测结果与临床结果完全相符。
II号试剂盒、III号试剂盒对比检测实验结果与I号试剂盒相符。
实施例2.本发明试剂盒化学发光底物与市场销售化学发光底物对比试验
对照试剂盒:与实施例1的试剂盒相同,区别在于化学发光底物采用市场销售的化学发光底物液(购自湖州英创生物科技有限公司)。
步骤1检测样本为实施例1中呼吸道感染样本254例及健康人血样358份。
检测操作步骤同实施例1步骤3的使用方法。
结果如表4所示。
表4.本发明I号试剂盒化学发光底物与市场销售的化学发光底物比对
表4所述数据表明,本发明I号试剂盒化学发光底物与对比化学发光底物的阳性符合率为89.9%,阴性符合率为100%,两种检验方法的符合率为98.2%。经验证,对比发光底物检出11份假阴性,而本发明试剂盒检测结果与临床结果完全相符。
II号试剂盒、III号试剂盒对比检测实验结果与I号试剂盒相符,说明本发明比采用对照发光底物的试剂盒具有更高的检测灵敏性。
步骤2.本发明的I号试剂盒、II号试剂盒、III号试剂盒2-8℃保存6个月后,用于检测步骤1的同一批样本,结果显示,阳性检出率未发生变化,与临床验证结果相符率为100%。而采用对照发光底物的试剂盒,2-8℃保存6个月后,假阴性比例由11/109提高到14/109,说明本发明的试剂盒中化学发光底物具有良好的稳定性,适于批量大量生产,检测结果稳定可靠。
Claims (5)
1.检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒,包括包被亲和素的微孔板,生物素化的肺炎衣原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物,所述化学发光底物包括底物液A和底物液B,其中A液为的组成为:pH值为7.2~8.5,浓度为10~30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02~0.1%Proclin300,0.1~1.0%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02~0.1%Proclin300,1.0~3.0mM的4-碘苯酚,0.1%~1%的BSA,0.1~1%的溴化十六烷基三甲基铵,10~50mM鲁米诺溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,所述生物素化的肺炎衣原体抗原采用如下方法制备而得:(1)生物素溶于N,N-二甲基甲酰胺终浓度为1mg/mL;(2)用0.1mol/L pH 9.0的NaHCO3衣原体抗原稀释为1~2mg/mL;(3)按生物素与抗原重量比1∶7左右混合,室温搅拌下反应2~4h;(4)装入透析袋,用0.05mol/L pH7.2的PBS,4℃透析过夜得到生物素化抗原,透析产物加等体积甘油溶解备用。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,所述包被亲和素的微孔板制备方法为:用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成2ug/ml亲和素包被液包被微孔板。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,所述试剂盒还包括稀释液,洗涤液,肺炎衣原体抗体IgM阴性对照、阳性对照、校准品,辣根过氧化物酶标记的抗人IgM。
5.根据权利要求1~4任一所述的试剂盒,辣根过氧化物酶标记的抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗。
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