CN102749446A - 一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒，包括硝酸纤维素膜检测线上包被的重组肺炎衣原体抗原、质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体和金标垫上包被的胶体金标记的鼠抗人IgM单抗，肺炎衣原体抗原浓度为1-2mg/ml，用SDS-PAGE测定；羊抗鼠IgG抗体浓度为1-3mg/ml；鼠抗人IgM单抗浓度为5-30

g/mL，用SDS-PAGE测定。本发明的有益效果为：肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点，整个操作时间仅需几十分钟就可以判读结果。胶体金快速检测试纸条，以多表位的重组抗原为原料，具有操作更加简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高的特点，可单份检测，易于普及，对于肺炎衣原体IgM的检测和控制效果明显。

Description

一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗体检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法。 

背景技术

肺炎衣原体是人类呼吸道疾病的重要病原体，可引起急慢性呼吸道疾病，调查显示，社区获得的肺炎、支气管炎和鼻窦炎5-10%由肺炎衣原体引起。经常引起成人及青少年的非典范肺炎，亦可引起支气管炎、咽炎及扁桃体炎等急性呼吸道传染。肺炎衣原体呼吸道感染的临床表现不典型，通常以咽痛和音哑起病，几日至一周后出现咳嗽，与其他呼吸道疾病相比，自起病至就医的时间以肺炎衣原体感染为最长，因此病初时的低热,检查时多已降至正常，异常呼吸音和鼻窦区压痛为最常见的特征，白细胞计数大多正常，血沉增速，X线胸片常显示单侧节段性肺炎，类似非典型性肺炎，严重者病变较广泛，甚至波及双肺，也可伴有胸膜炎或胸腔积水。 

热带国度地区高于北部发财国度，有的地区5～14岁年龄组发病率高于成年人。据统计在引起肺炎的病因中，是继肺炎球菌、流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的第三位紧张病原体。 

美国报告每年发病约30万例，而鹦鹉热衣原体引起的肺炎仅约150例。 

香港亦有雷同报告，在呼吸***传染的患者中，检测血清肺炎衣原体抗体阳性率为54.8%，紧张传染者为24.8%，抗体效价多1∶256，而鹦鹉热衣原体抗体之阳性率仅为0.9%，且多为非近期传染。 

亦发觉肺炎衣原体传染与冠芥蒂、心肌梗死及膨胀型心肌病等心血管疾病及脑血管疾病等的产生明显相干。本病埋伏期10～65 天。贫乏特异性临床表现，无症状传染和轻症患者常见。 

1.急性呼吸系传染 是其紧张表现，如咽炎、喉炎、鼻窦炎、中耳炎、支气管炎及肺炎，以肺炎最常见占50%以上，支气管炎次之。老年人以肺炎常见，20岁以下的青少年，则多为支气管炎及上呼吸道传染。常以发烧、满身不适、咽痛及声音嘶哑起病，数日后呈现咳嗽，此时体温多已平常。亦可引起支气管炎、支气管哮喘，原有支气管哮喘的患者传染肺炎衣原体后，可加重病情。还可引起咽炎、鼻窦炎及中耳炎，此多与肺炎及支气管炎同时存在。病变平常均较轻，但尽管应用抗生素治疗，病情规复较慢，咳嗽及满身不适等症状可连续数礼拜至数月。 

病情紧张者可因原根本疾病加重或因产生并发症如细菌传染而死亡。 

　  2.伤寒型 少数患者表现为高热、头痛、相对缓脉及肝脾年夜，易并发心肌炎、心内膜炎和脑膜炎，重症患者呈现昏倒及急性肾枯竭，表现雷同重型伤寒。 

　  3.肺炎衣原体传染与动脉硬化、冠芥蒂及急性心肌梗死之发病的相干性 据统计50%的慢性冠芥蒂及68%急性心肌梗死患者血清中，可检出抗肺炎衣原体抗体(IgG 和IgA)，比较组仅17%。 

用肺炎衣原体单克隆抗体免疫组化染色或用PCR法，在冠状动脉或自动脉的硬化斑中，可检出肺炎衣原体抗原或其DNA，证实在病灶内存在病原体，而在平常动脉构造中未检出。 

Gloria 等报告用单克隆抗体免疫荧光法，别离在自动脉和冠状动脉硬化的标本中检出肺炎衣原体抗原，阳性率别离为13%和79%，平常自动脉为4%。 

故觉得肺炎衣原体传染与动脉硬化的产生相关，是产生冠芥蒂的危机身分，对冠芥蒂患者应注意除外肺炎衣原体传染，并觉得防治肺炎衣原体传染有年夜略裁减冠芥蒂的产生。 

据报告，动脉粥样硬化、冠芥蒂及外周动脉栓塞等心血管病患者，常归并肺炎衣原体传染，用罗红霉素等年夜环内酯类抗生素治疗，并经过议定2～7 年的随访，可明显低落心血管病的进展。同时发觉有肾枯竭的冠芥蒂患者，其肺炎衣原体的传染率更高，且更易促进心血管病的进展。 

　　4.其他 可引起虹膜炎、肝炎、心内膜炎、脑膜炎及结节性红斑等。 

通常情况下的诊断方法有：

因为本病贫乏特异性临床表现，故对有肺炎或上述临床表现的患者，如疑及本病，可做病原学或免疫学检测确诊。

　　实行室检测： 

　　1.血象 血白细胞计数多平常，重症患者可升高。血沉多增快。

　　2.病原学查抄 是确诊本病的靠得住方法。临床诊断不常用。 

　　(1)直接涂片：涂片后用Giemsa 或免疫荧光单克隆抗体染色，检测肺炎衣原体包涵体及原体，方法轻巧，但阳性率低。 

　　(2)构造培养法：鸡胚卵黄囊接种因检出阳性率低已罕用。可用细胞培养法，取咽拭子或收集下呼吸道标本，用HEP-2 细胞(喉癌细胞)或Hela229 细胞培养24 h，再用肺炎衣原体特异性单克隆抗体染色，检测特异性包涵体。 

方法较繁杂，且较其他衣原体检出率低。 

　　3.免疫学检测：是常用的诊断方法。 

　　(1)直接免疫荧光法：用肺炎衣原体单克隆抗体染色，直接免疫荧光法检测肺炎衣原体抗原，方法特异灵活且急剧轻巧。 

　　(2)微量免疫荧光(MIF)法：检测肺炎衣原体抗体，特异性IgM 滴度≥1∶16和(或)IgG≥l∶512 或双份血清滴度4 倍以上升高者，均可诊断急性传染。如IgM≤1∶16 或IgG≤1∶512，则为既往传染。 

本方法特异性灵活性均较高，且可用于区分原发传染和再传染，是如今最常用且最灵活的血清学方法。但要清除血轮回中类风湿因子的感化。 

　　(3)补体联合抗体检测：滴度≥l∶64 和(或)双份血清滴度4 倍以上升高者，均可诊断急性传染，但不能用于早期诊断，亦不能区分为哪种衣原体传染。 

4.PCR 法：检测肺炎衣原体DNA，灵活性更高，且可和其他种衣原体区分，其特异性灵活性高于其他方法。据统计，PCR 法检出率为50%～55%，而直接免疫荧光法及涂片法别离为24%～27%和6%～10%。用连接聚合酶链反响(LCR)检测，可进一步进步伶俐性及检出率，但尚未在临床应用。据报告，PCR-EIA 法是一种急剧、轻巧的酶免疫测定法，能进步PCR 对肺炎衣原体DNA 的扩增检测效果，优于PCR 法，更优于培养法。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可以快速定性检测血清样本中的肺炎衣原体IgM抗体的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒，包括硝酸纤维素膜检测线上包被的重组肺炎衣原体抗原、质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体和金标垫上包被的胶体金标记的鼠抗人IgM单抗，所述肺炎衣原体抗原浓度为1-2mg/ml，用SDS-PAGE测定；所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1-3mg/ml；所述鼠抗人IgM单抗浓度为5-30 

/mL，用SDS-PAGE测定。 

本发明的第二个目的是提供了一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤： 

（1）反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将重组Cpn -Ag稀释到包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2.0mg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存；

（2）鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备：将标记浓度为5-30μg/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn－IgM金结合物垫，将Cpn－IgM金结合物垫干燥保存；

（3）切割装配：在反应膜所在胶板的上部揭去1.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0.9cm的不干胶纸，贴上Cpn－IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1mm，制成反应板，再用切条机切成4mm试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。

进一步的，所述肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法中，所述步骤（1）和（2）的干燥条件为37℃干燥3小时。 

进一步的，所述肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法中，其特征在于：所述步骤（2）的鼠抗人IgM单抗的标记浓度为15μg/ml。 

本发明的有益效果为：肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点，整个操作时间仅需几十分钟就可以判读结果。胶体金快速检测试纸条，以多表位的重组抗原为原料，具有操作更加简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高的特点，可单份检测，易于普及，对于肺炎衣原体IgM的检测和控制效果明显。 

附图说明

图1为本发明提供的一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备工艺流程示意图。 

具体实施方式

一、生产工艺条件的确定

1.胶体金颗粒的选择：

1.1 原理：根据煮沸条件下氯金酸与柠檬酸三钠发生氧化还原反应制备胶体金。可以通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的加入比例来改变和控制胶体金的颗粒大小。

操作：在100mL纯化水中加入0.1mL 10%氯金酸煮沸、在搅拌条件下加入不同体积的1%柠檬酸三钠溶液，煮沸 5分钟，制备不同条件的胶体金颗粒，待其自然冷却回复至原体积。用鼠抗人IgM单抗标记不同颗粒的胶体金，然后再用企业参考品进行检测。其结果如表1： 

            表1：1% 柠檬酸三钠用量的选择实验（粒径选择）

用制备的四种胶体金标记鼠抗人IgM单抗与重组Cpn-Ag包被的反应膜配比，再用企业参考品血清进行检测。如表2：

表2  不同胶体金标记鼠抗人IgM单抗与重组Cpn-Ag膜配对检测结果

结果分析：由表2结果可知，3号制金条件制的胶体金，颜色鲜红、清亮，无混浊及漂浮物，标记后的胶体金其特异性、敏感性较好。故选择制金条件为：1/万氯金酸100ml+1.8ml 1%柠檬酸三钠

2. 胶体金标记鼠抗人IgM单抗条件的优化:

2.1 原理: 根据胶体金标记技术特性，将胶体金中细微的金颗粒与纯化的鼠抗人IgM单抗稳定结合，形成红色的胶体金鼠抗人IgM单抗结合物。

胶体金标记最适pH值的选择: 采用目测法。取若干个1.5mL试管，分别加入1 mL胶体金；用0.1M K₂CO₃或5M盐酸将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；取96孔酶标板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100

L加入孔中，重复三次；每孔分别加入3

L浓度为1 mg/mL的鼠抗人IgM单抗，混合，室温下放置40 min；每孔分别加入20

L浓度为10％ NaCl溶液，混匀，室温下放置2小时；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)。调整pH为X-1.0、X-0.5、X、X+0.5、X+1.0，重复以上步骤，保持红色的最低pH值即为标记的最佳pH值。结果如表3： 

表3  胶体金标记鼠抗人IgM单抗最适PH值的选择实验结果

结论:由表3结果可知,当PH值为8.5时,即加入0.1MK₂CO₃ 20μl/ml时，胶体金标记鼠抗人IgM单抗的效果较好，稳定性好，因此选定PH值8.5（即加入0.1MK₂CO₃  20μl/ml）为胶体金标记鼠抗人IgM单抗的最适PH值。

鼠抗人IgM单抗最佳标记量的选择：

2.3.1 最低标记量：盐沉淀法和梯度法。首先采用盐沉淀法选择鼠抗人IgM单抗的最低标记量，然后用交叉配比法选出鼠抗人IgM单抗的最佳标记量。取96孔酶标板，分别加入最佳pH的胶体金100

L，重复3次；各孔依次加入不同量的蛋白，混匀，室温下放置40min；加入20

L 10%NaCl，室温下放置2h；颜色仍保持红色的为标记的最低蛋白用量。结果如表4：

表4  鼠抗人IgM单抗最低标记量选择的实验结果

由表4实验结果可知：鼠抗人IgM单抗的最低标记量为5

g/mL。

2.3.2最佳标记量选择：用0.1M K₂C0₃溶液调PH到8.5，然后分别加入5

g－30

g /mL标记用鼠抗人IgM单抗，搅拌40分钟，再加入 10%的牛血清白蛋白至终浓度为1%， 搅拌 15分钟。12000rpm  4℃离心40分钟，小心弃去上清液，加入胶体金结合物稀释液。铺金，干燥后，与以最适包被条件包被好的Cpn－IgM反应膜配对，检测其特异性和灵敏度。结果如表5： 

表5  鼠抗人IgM单抗最低标记量选择的实验结果

由表5结果可知：在PH值8.5条件下，鼠抗人IgM单抗标记浓度为10μg/mL时，试纸条的特异性和敏感性较好，灵敏度较高。因此我们确定的标记条件为：每毫升胶体金加入0.1M 碳酸钾溶液20μL，鼠抗人IgM单抗标记浓度为15μg/mL为最终生产工艺条件。

检测线包被浓度和胶体金标记鼠抗人IgM稀释比例的选择：

按照上述确定好的标记条件进行标记，将其体积浓缩至原体积（原体积以胶体金体积计算）的1/10，再以不同的稀释比例稀释浓缩液，用稀释液浸泡金标垫，1.5ml/条，干燥后与以不同检测线包被浓度，0.1

l/mm的包被量包被好的Cpn-IgM反应膜进行配对，检测内控血清。实验方案如表6，实验结果如表7、8：

表6  实验方案设计

表7  阳性企业参考品和最低检出限检测结果

表8  阴性企业参考品检验结果

通过表7、8实验可知，A3B3与A3B4两组实验结果比较理想。

浓缩液稀释比例为1：5，检测线包被浓度为1.0mg/ml到2.0mg/ml时，Cpn-IgM反应膜质控线和检测线显色效果较好，且灵敏度，特异性较好。在此选择A3B2配对组合。即： 

胶体金结合物稀释液加入至原体积（原体积以胶体金体积计算）的1/2，浸泡金标垫1.5mL/条，为胶体金标记后金结合物垫制备条件。

检测线包被浓度为1.0mg/ml，0.1

l/mm喷点量。 

质控线包被浓度的选择：

将羊抗鼠IgG配成不同浓度，与重组Cpn-Ag 1.0mg/ml，以0.1l/mm喷点量，分别包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置上，进行干燥后，与制备好的金结合物垫配组，用企业参考品血清进行检测，结果如表9：

表9  质控线检测结果

由表9结果可知：当质控线浓度为1.0mg/ml、1.5mg/ml时，质控线显线较其浓度较弱，而当检测强阳性样本时质控线显线更弱，这主要由于检测线与质控线的竞争引起来的。当质控线浓度为3.0mg/ml以上时，质控线显线较粗且不规则。综合以上实验结果，我们选取2.0mg/ml作为质控线的包被浓度。

为此反应膜最终包被条件为： 

喷点量为0.1μL/mm，

质控线包被浓度：羊抗鼠IgG抗体为2.0mg/ml

检测线包被浓度：重组Cpn-Ag为1.0 mg/ml

5 Cpn－IgM反应膜和金结合物垫干燥条件的选择：

按上述确定的反应膜和金结合物垫生产条件，将包被好的反应膜合金标垫，放入干燥箱，在干燥不同的时间后，取出金结合物垫和反应膜，组装成试纸条，用企业参考品血清进行检测，并且进行稳定性试验。结果如表10-14：

表10：干燥后检测结果

表11：干燥3天后检测结果

表12：干燥6天后检测结果

表13：干燥9天后检测结果

表14：干燥14天后检测结果

适宜的干燥条件，不仅影响试剂盒的灵敏度，而且关系到试剂盒的稳定性.结果表明，在干燥环境为37℃条件下，干燥3小时制备的试纸条，其敏感性，稳定性均较好，故选择37℃条件下干燥3小时为反应膜及金标垫生产的干燥条件。

  

二、反应体系研究

1. 反应时间和加样量的选择：

按照上述确定条件，生产Cpn-IgM试纸条，对其反应时间和加样量进行确定。结果如表15：

表15  反应时间和加样量选择的实验结果

由表15实验结果可知：当加样量为10

L血清和100

L样本稀释液时，15-20min判读结果，Cpn-IgM试纸条检测效果较好。因此确定加样量为10

L血清和100

L样本稀释液，判读时间为15-20min。

血清及血浆不同抗凝剂标本对比验证试验：

   采集血液用不同抗凝剂肝素、柠檬酸钠、EDTA处理血液样本和制备血清，用上述确定的生产条件制备的试纸条，检测处理后的样本，检测结果如表16：

表16  不同处理方法处理的血液检测结果

由表16实验结果可知：抗凝剂肝素、柠檬酸钠、EDTA处理的血液样本对检测结果无影响，与血清检测一致。因此本试剂盒可用于血清和血浆样本的检测。

实施例1：

1. 原料来源

肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒制备的各原料及稀释液来源及用量见下表17：

表17

 2、原料要求：

2.1 重组Cpn抗原

（1）外观：无色透明液体；

（2）浓度及纯度要求：浓度大于2mg/ml，用SDS-PAGE测定，上样量在10μl条件下仅存一条带；

2.2 羊抗鼠IgG抗体

（1）外观：无色透明液体；

（2）浓度要求：浓度大于4mg/ml；

2.3 鼠抗人IgM单抗

（1）外观：无色透明液体；

（2）浓度及纯度要求：浓度大于2mg/ml，用SDS-PAGE蛋白电泳检测，重链/轻链均为单一区带；

3. 液体配制：如图1所示，试剂盒的具体制备流程如下：

3.1 0.05M PBS缓冲液的配制：

(1)标准配方：按照100mL量计。

 (2)配制方法： 

    按照标准配方内容准确称取Na₂HPO₄·12H₂O、 NaH₂PO₄·2H₂O 、NaCl加纯化水80.00mL，搅拌使充分溶解后，使用pH计测量液体pH值应在7.30～7.50范围内，用纯化水两倍稀释检测所配溶液的电导率应在9000

s/cm～13000

s/cm，用纯化水定容至100.00mL，混合均匀。2～8℃保存备用，有效期14天。

氯金酸溶液的配制：

(1) 标准配方：按照100mL量计。

 (2) 配制方法： 

    取一支1g/支的氯金酸，打开瓶子；量取2ml纯化水倒入容器内，取纯化水把氯金酸溶解并且将盛放氯金酸的试剂瓶清洗干净, 将清洗液倒入容器内，再加纯化水至100ml；盖紧瓶盖，充分摇晃15分钟，混合均匀，用铝箔包好，2～8℃保存备用，有效期12个月。

碳酸钾溶液配制：

(1) 标准配方：按照20mL量计。

 (2) 配制方法： 

量取待配液体积80%的纯化水于试剂瓶中，按照标准配方内容准确称取K2CO3加入试剂瓶中, 加纯化水至20.0mL，使充分溶解。2～8℃保存备用，有效期14天。

牛血清白蛋白溶液的配制：

(1) 标准配方：按照10mL量计。

 (2)  配制方法： 

量取待配液体积80%的纯化水于试剂瓶中，按照标准配方内容准确称取牛血清白蛋白加入试剂瓶中, 待完全溶解，加纯化水至10.00mL，使充分溶解，即用即配。 

胶体金结合物稀释液的配制:

(1) 标准配方：按照100mL量计。

 (2) 配制方法： 

按照标准配方内容准确称取三羟甲基氨基甲烷于容器中，加纯化水80mL，搅拌使充分溶解后，然后滴加盐酸使其pH值调制到9.0，再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中，充分搅拌溶解后，根据配方用加样器量取吐温-20加入试剂瓶中，使用纯化水定容至100.00mL，使用pH计测量液体的批pH值为8.60～8.80，检测所配溶液的电导率应在2300

s/cm～3000

s/cm 。2～8℃保存备用，有效期14天。

样本稀释液的配制：

(1) 标准配方：按照100mL量计。

 (2) 制备方法：按照标准配方内容准确称取NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O，加纯化水80.00mL，搅拌使充分溶解后加入0.85g氯化钠，充分混匀，定容至100.00mL，使用pH计测量液体的批pH值为7.30～7.50， 4～30℃保存，有效期14个月。 

胶体金的制备:

(1) 标准配方：按照100mL量计。

 (2) 制备方法： 

按照标准配方内容准确量取1%氯金酸溶液1.0mL，加入到99mL纯化水中，边加热边搅拌至沸腾；5分钟后，准确量取1.8ml的1％柠檬酸三钠溶液，迅速、一次性加入到容器中，继续加热煮沸5min。冷却至室温后加入纯化水恢复到原来体积。2～8℃保存备用，有效期14天。

试剂盒检测线包被液的配制:

(1) 标准配方：按照10mL量计。

 (2)制备方法： 

按照标准配方内容准确量取重组Cpn-Ag 10mg，加入到相应体积的0.05M PBS缓冲液中。充分混匀15min。即用即配。

试剂盒质控线包被液的配制:

(1) 标准配方：按照10mL量计。

 (2) 制备方法： 

   按照标准配方内容准确量取羊抗鼠IgG抗体20mg，加入到相应体积的0.05M PBS缓冲液中，充分混匀15min，用0.05PBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使羊抗鼠IgG抗体的终浓度为2.0mg/ml, 即用即配。

胶体金标记鼠抗人IgM单抗的制备:

(1)相关试剂标准用量：按照100mL量计。

 (2)制备方法： 

按照试剂标准用量量取主配方规定量的胶体金于三角瓶中，准确加入主配方规定量的0.1M碳酸钾溶液，混匀,静置10分钟。准确量取主配方规定量的鼠抗人IgM单抗，快速搅拌下，将鼠抗人IgM单抗逐滴加入到三角瓶中，室温静置40分钟。准确量取主配方规定量的10%牛血清白蛋白溶液，快速搅拌下逐滴加入到三角瓶中，室温静置15分钟。12000rpm，4℃离心40分钟，小心弃去上清液,加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，2～8℃保存备用，有效期14天。

实施例2

试剂盒的制备一

（1）反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将重组Cpn -Ag稀释到包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2.0mg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存；

（2）鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备：将标记浓度为5μg/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn－IgM金结合物垫，将Cpn－IgM金结合物垫干燥保存；

（3）切割装配：在反应膜所在胶板的上部揭去1.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0.9cm的不干胶纸，贴上Cpn－IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1mm，制成反应板，再用切条机切成4mm试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。

实施例3

试剂盒的制备二

（1）反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将重组Cpn -Ag稀释到包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2.0mg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存；

（2）鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备：将标记浓度为30μg/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn－IgM金结合物垫，将Cpn－IgM金结合物垫干燥保存；

（3）切割装配：在反应膜所在胶板的上部揭去1.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0.9cm的不干胶纸，贴上Cpn－IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1mm，制成反应板，再用切条机切成4mm试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。

实施例4

试剂盒的制备三

（1）反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将重组Cpn -Ag稀释到包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2.0mg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存；

（2）鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备：将标记浓度为15μg/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn－IgM金结合物垫，将Cpn－IgM金结合物垫干燥保存；

（3）切割装配：在反应膜所在胶板的上部揭去1.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0.9cm的不干胶纸，贴上Cpn－IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1mm，制成反应板，再用切条机切成4mm试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。

实施例5

样品检测：

1、检测样本的要求

血清样本按常规方法由静脉采集。血浆样本可采用肝素、柠檬酸钠、EDTA进行处理。5天内测定的样本可放置4℃保存。样本放置在-20℃至少可保存3个月。样本避免溶血或反复冻融。混浊或有沉淀的样本应离心或过滤澄清后再检测。

、检验方法：

1）从铝箔袋中取出检测卡；

2）放在水平工作台面上平置并做好样本标记；

3）用微量移液器取10

L血清或血浆样本；直接加入到加样孔中；再滴加样本稀释液100

L（约2-3滴）；

4）15-20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。                           

检测条检测方法：

1）从原包装铝箔袋中取出检测条，平置于台面上；

2）用微量移液器取10

L血清或血浆样本；

3）加到检测条指示箭头下端的加样处，再滴加样本稀释液，100L（约2-3滴）；

4）15-20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。

、检验结果

1）阴性：只在质控线（C）位置出现一条红色条带。                                      

2）阳性：质控线（C）和检测线（T）位置出现两条红色条带。                        

3）无效：质控线（C）位置没有出现红色条带。

本产品阴阳性符合率、精密性、灵敏度等均符合质量标准要求，效期内产品质量稳定。类风湿因子、乙型肝炎、梅毒不会对本品造成干扰。 

实施例6

反应时间和加样量的选择

生产Cpn－IgM试剂盒，对其反应时间和加样量进行确定。结果见表18：

表18 加样量和判读时间的选择实验结果

由表18实验结果可知：加样量的多少会影响试纸条能否产生正确的反应结果，加样量低会出现漏检或样本展开不足，加样量高时容易产生假阳性。通过以上实验，考虑到不同使用者在应用上的误差及使用的方便性，选择加样量为10μL血清再加入100μL样本稀释液，15-20min判读为加样判读条件。

实施例7

血清及血浆不同抗凝剂标本对比验证试验

    采集血液用不同抗凝剂肝素、柠檬酸钠、EDTA处理血液样本和制备血清，用上述确定的生产条件制备的试纸条，检测处理后的样本，结果显示：抗凝剂肝素、柠檬酸钠、EDTA处理的血液样本对检测结果无影响，与血清检测一致。因此本试剂盒可用于血清和血浆样本的检测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒，包括硝酸纤维素膜检测线上包被的重组肺炎衣原体抗原、质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体和金标垫上包被的胶体金标记的鼠抗人IgM单抗，其特征在于：

所述肺炎衣原体抗原浓度为1-2mg/ml，用SDS-PAGE测定；

所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1-3mg/ml；

所述鼠抗人IgM单抗浓度为5-30                                               

/mL，用SDS-PAGE测定。

2.根据权利要求1所述的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将重组Cpn -Ag稀释到包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2.0mg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存；

（2）鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备：将标记浓度为5-30μg/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn－IgM金结合物垫，将Cpn－IgM金结合物垫干燥保存；

（3）切割装配：在反应膜所在胶板的上部揭去1.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0.9cm的不干胶纸，贴上Cpn－IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1mm，制成反应板，再用切条机切成4mm试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。

3.根据权利要求2所述的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）和（2）的干燥条件为37℃干燥3小时。

4.根据权利要求2所述的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的鼠抗人IgM单抗的标记浓度为15μg/ml。

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