CN103013865A - 一种棒状链霉菌的工程菌株及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的工程菌株及其制备方法与应用。该棒状链霉菌首先通过紫外诱变技术获得了克拉维酸产量为原始菌株1.9倍的突变株B372，再以该突变株为出发菌株采用PCR-TARGETING构建了lat基因敲除的突变菌S.clavuligeruslat:: Δ，发现经紫外诱变及lat基因敲除后，棒状链霉菌的克拉维酸的产量获得了较大的提高，为原始菌株的2.3倍。本发明所构建的工程菌，克拉维酸产量明显提高，不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造；通过连续传代，克拉维酸产量比较稳定，重复性好。

Description

一种棒状链霉菌的工程菌株及其制备方法与应用

本申请得到天津师范大学博士基金（52x09010）的资助。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种棒状链霉菌的紫外诱变及基因阻断突变菌及其制备方法。

背景技术

几十年来，由于抗生素的大量使用，导致了细菌对很多药物的抗药性，病原菌对β－内酰胺类抗生素的耐药性，己成为临床上难治性感染的重要因素之一。

克拉维酸（clavulanic acid）是棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）的代谢产物，又名棒酸，是第一个被发现并应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂。克拉维酸本身的抗菌活性很弱，但它具有强力、广谱且不可逆的β-内酰胺酶抑制活性。克拉维酸与β-内酰胺类抗生素如阿莫西林(Amoxicillin)、替卡西林(Ticarcillin)分别联合，制成酶抑制剂联合制剂，可在不同程度上保护β-内酰胺类抗生素不被β-内酰胺酶灭活，从而提高该抗生素对产酶耐药菌的抗菌活性，提高临床疗效。

棒状链霉菌中头霉素C的合成代谢途径是以L-赖氨酸、L-半胱氨酸和缬氨酸为前体物质的。棒状链霉菌的lat基因编码赖氨酸ε-转氨酶（该酶是头霉素C合成途径中的关键酶），是牵涉到头霉素C合成的第一个基因，也是进行调控的首选基因。研究表明，棒状链霉菌中一种代谢产物的阻断可能导致其它代谢产物产量的提高。克拉维酸基因簇和头霉素C基因簇相邻，且受相同的调节蛋白CcaR的调控，Paradkar等（Paradkar AS, Mosher RH, Anders C (2001). Application of gene replacement technology to Streptomyces clavuligerus strain development for clavulanic acid production. Appl. Environ. Microbiol., 67(5): 2292-2297.）研究表明，在发酵过程中降低或消除棒状链霉菌中头霉素C的合成能够提高克拉维酸的产量，并可以有效减少发酵液中的干扰物质，简化提取工艺。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的棒状链霉菌克拉维酸产量低的不足，采用紫外诱变结合分子改造的方法对棒状链霉菌进行多方面改造，提供一种棒状链霉菌的高产工程菌株及其制备方法，该棒状链霉菌的突变菌株的克拉维酸产量得到较大提高。

本发明的一个目的在于克服上述技术问题，从而提供一种棒状链霉菌突变株棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株（保存的是最终产量最高的菌株）。

本发明所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)较佳的是棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)NRRL3585。

本发明的另一个目的在于提供一种棒状链霉菌的紫外线诱变突变菌的方法。

本发明的还一个目的在于提供一种棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株在用于抗生素生产菌生产中的应用。所述的抗生素生产菌对象为产酶耐药菌。

棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株。该菌种是一种在获得的紫外诱变高产突变株为出发菌株的基础上，先将其lat基因的第191～1600位之间的核苷酸片段以一段安普抗性基因置换掉，再通过基因敲除技术去除安普抗性基因，获得不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株。

菌落特征：成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形。28℃培养3～5天后菌落表面生成暗灰绿色孢子，孢子成熟后易于刮下。

菌丝特征：气生菌丝为网状、白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素。

根据本发明，所述的第安普抗性基因整合于本发明的棒状链霉菌的lat基因中。在lat基因中的整合位置是在基因组的任何位置，只要不影响菌株本身的生物合成，能够高产克拉维酸的情况，都在本发明的保护范围之内。

本发明更加详细的说明如下：

一、具体技术支撑

㈠ 微生物名称和保藏情况

棒状链霉菌lat::Δ菌株。该菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：，保藏时间。

㈡ 菌株的生物学特性及鉴定

1.棒状链霉菌lat::Δ菌株的形态学特征

菌落特征：成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形。28℃培养3～5天后菌落表面生成暗灰绿色孢子，孢子成熟后易于刮下。

菌丝特征：气生菌丝为网状、白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素。

依据《菌物学大全》（裘维蕃,菌物学大全 [M].北京:科学出版社,1998:890）和《常见与常用真菌》（中国科学院微生物研究所[M].北京：科学出版社,1973），该菌特征与枝顶孢霉特征相符，极似《常见与常用真菌》中所描述的顶头孢霉（Cephalosporium acremonium.）。

2.棒状链霉菌lat::Δ序列分析及鉴定结果

测序结果：连接产物经转化后测序，由北京华大基因科技序列测定片段长度约为500bp，测序结果如下：

序列提交到Gen-Bank数据库，进行BLAST比对，结果显示该菌株16S rDNA序列与棒状链霉菌同源性为100%（-）。结合形态学鉴定结果，将该菌确定为棒状链霉菌。

本发明进一步公开了一种制备如上所述的任一棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的基因阻断突变菌的方法，包括以下步骤：

（1）构建lat 基因中整合有安普抗性框的重组质粒pELA；

（2）将lat 基因中整合有安普抗性框的重组质粒pELA转化宿主细胞，获得转化子；

（3）构建 lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR；

（4）将棒状链霉菌B372作为受体，与步骤（2）所述的转化子进行接合转移，获得接合子，即棒状链霉菌的lat基因阻断突变菌S.clavuligerus lat::aac。

（5）将棒状链霉菌S.clavuligerus lat::aac作为受体，将步骤（3）所述的重组质粒pSCAR转入受体菌，获得不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株S.clavuligerus lat::Δ。

本发明中步骤（1）所述的构建lat 基因中整合有安普抗性框的重组质粒pELA用于与棒状链霉菌的lat基因发生同源双交换，从而得到lat基因中整合有安普抗性基因的棒状链霉菌的基因工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pGH112，在该载体骨架中克隆有整合了安普抗性基因的被阻断的lat基因。

本发明中步骤（2）所述的诱变条件较佳的是采用15W或30W紫外线，提前预热20—30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20—30cm处进行紫外照射30—45秒，较佳的诱变对象为棒状链霉菌的孢子。

本发明中步骤（3）所述的构建的lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR用于与棒状链霉菌的lat基因被安普抗性基因置换的突变株发生同源双交换，从而得到lat基因被敲除的无抗性标记的棒状链霉菌的基因工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pGH112，在该载体骨架中克隆有被敲除中间区段的lat基因，即只含有上游230bp的lat基因区段及下游170bp的lat基因区段。

本发明中步骤（1）和步骤（3）所述的载体较佳的是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pGH112。步骤（2）所述的宿主细胞较佳的是大肠杆菌，更佳的是大肠杆菌ET12567。步骤（4）所述的受体较佳的是棒状链霉菌，更佳的是棒状链霉菌紫外诱变克拉维酸高产突变株。步骤（5）所述的受体较佳的是lat基因整合有安普抗性基因的棒状链霉菌突变菌株的原生质体。步骤（5）所述的棒状链霉菌的原生质体的较佳制备条件为采用1mg/mL的溶菌酶浓度，酶解45min。步骤（5）所述的棒状链霉菌的原生质体的较佳转化条件为采用25%的PEG1000介导转化，转化前将棒状链霉菌原生质体于45℃温育10min，以降低链霉菌的限制性酶的活性。

相比于现有技术，本发明所具有的有益效果如下:

本发明通过紫外线诱变及基因工程的手段提高棒状链霉菌的克拉维酸的产量，首先通过紫外诱变获得了产量为原始菌株1.9倍的突变菌株，在以该突变菌株为出发菌株，通过同源重组交换来阻断其lat基因，最终构建的工程菌株的产酸量是原始菌株的2.3倍。通过基因工程手段提高棒状链霉菌的克拉维酸产量的方案已经出现很多，本发明首次采用紫外线诱变及基因工程相结合的手段，并且采用PCR-targeting对棒状链霉菌的lat基因进行了突变，经本发明构建的工程菌，克拉维酸产量明显提高，产酸量较稳定，且不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造。

附图说明

图1是出发菌株抑菌圈与突变株抑菌圈比较；图中372，373，374为紫外诱变突变株，B71为出发菌株；

图2是发酵液HPLC色谱图；克拉维酸的保留时间为3.972分钟；

图3是S.clavuligeruslat基因的PCR产物；M. 10kb Marker; 1. 棒状链霉菌赖氨酸ε-转氨酶基因的PCR产物；

图4是安普抗性框的引物设计；

图5是安普抗性框的PCR产物；1. 阿泊拉抗性框的PCR产物； M. 100bp Marker。

图6是重组质粒pGH112–lat的验证；M.1Kb .Marker；1. EcoRI、BamHI双酶切pGH112–lat质粒； 2. 质粒pGH112-lat的PCR产物；

图7是重组质粒pELA的构建过程示意图；

图8是重组质粒pELA的PCR验证；M.100bp Marker； 1,2,3,4. 质粒pELA的PCR产物；

图9是重组质粒pSCAR的限制图谱；

图10是重组质粒pSCAR的酶切验证；1. HindⅢ酶切pELA； 2. EcoRI酶切pELA; M.1kb Marker；3. HindⅢ酶切pSCAR； 4. EcoRI酶切pSCAR；5.BamHI酶切pSCAR；

图11是pELA与染色体的双交换示意图；

图12是突变株的PCR验证；1. 突变株S.clavuligerus lat::aac的PCR产物2.突变株S.clavuligerus lat:: Δ的PCR产物；M1. 100bp Marker； M2. 10kb Marker; 3. 出发菌株S.clavuligerusB372的PCR产物；

图13是突变株和原始菌株头霉素C的抑菌圈；1为对照菌株的抑菌圈，2，3，4分别为三株突变菌株的抑菌圈；

图14为lat基因PCR扩增后的核苷酸序列；

图15为安普抗性框PCR扩增后的核苷酸序列。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

实施例 1

棒状链霉菌 NRRL3585 的紫外线诱变

菌种：棒状链霉菌NRRL3585（S.clavuligerus NRRL3585），菌种保藏号CPCC 600044；肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC 29665，菌种保藏号29665™。

主要培养基及溶液：ISP培养基：ISP 8g、琼脂粉20g，调pH至7.3；TSB液体培养基(L^-1)：TSB 30g、淀粉 10g、pH6.8～7.0； SS液体培养基(L^-1)：黄豆粉 15g、淀粉 4.7g、KH₂PO₄ 0.1g、FeSO₄•7H₂O 0.2g，pH6.8。

其他常规培养基及溶液均参考萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第三版,北京:科学出版社,2002。

方法：

孢子悬液的制备

（1）挑取于ISP固体培养基上培养好的S. clavuligerus的单菌落转接于YMGA斜面，28℃培养2～3d，用大接种环将孢子刮下转接于茄子瓶中的YMGA斜面，28℃培养5～7d。

（2）向培养好的茄子瓶斜面中加入40mL无菌水。

（3）用无菌大接种环用力由轻到重将孢子刮下。

（4）将刮下的菌体全部转入无菌三角瓶中（含玻璃珠），剧烈振荡1min。

（5）将上述孢子悬液用装有无菌原棉的注射器过滤，所得滤液于1000g离心10min沉淀孢子。

（6）弃上清，轻弹管壁使沉淀分散于残留在管壁上的液体中。

（7）加入2mL 20％的无菌甘油，迅速混匀，保存于-20℃。

（8）使用前光学显微镜观察，血球计数板计数，适当稀释使孢子浓度达到10⁸个/mL。如暂时不使用，则加入20％甘油迅速混匀后-70℃冰箱保存。

紫外线诱变处理

（1）将培养好的S.clavuligerus孢子斜面制备孢子悬液。

（2）吸取孢子悬液5mL于60mm的无菌平板中，紫外照射诱变采用15W或30W紫外线，提前预热20—30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20—30cm处进行紫外照射30—45秒。

（3）取照射后的孢子悬液0.1mL涂布于含12％甘油的YMGA平板上，28℃避光培养7天。以上操作均在暗室进行。

突变菌株的筛选

1．琼脂块法初筛

（1）挑取含12％甘油平板上长出的单菌落，点接于不含甘油的YMGA平板上，28℃培养2～4d。

（2）在形成丰满的气生菌丝，但还未长出分生孢子之前，用6～8mm的无菌打孔器将每个菌落连同一定厚度的琼脂块一同取出，移至空的无菌平皿中。

（3）保持湿度继续培养，使其在生长发育过程中合成的抗生素限制在琼脂块中。

（4）当孢子生长成熟后再移至生物检定平板上，同时合理放置对照菌落，对照菌落的数量占总琼脂块的25％。

（5）测定每个琼脂块的抑菌圈直径，挑取抑菌圈明显大于对照菌的菌落，转接至斜面，以备进一步复筛。

2．摇瓶复筛

（1）用接种环从活化的斜面上挖取一菌环的S.clavuligerus菌丝体连同培养基接于装有5mL ISP培养基的50mL三角瓶中，于180r/min，28℃培养48h。

（2）将上述培养物转接于装有50mL TSB培养基的250mL挡板三角瓶，于180r/min，28℃培养36h。

（3）将培养好的种子液按5％的接种量接入发酵瓶中，500mL挡板三角瓶装液量为50mL，180r/min，28℃，培养时间为72～120h。

（4）取不同发酵液于EP管中，13200r/min离心10min，上清液经0.45μm滤膜过滤，测定其克拉维酸含量。

克拉维酸的测定

（1）色谱条件

日本岛津高效液相色谱仪： LC-10AT泵，SCL-10A控制***；

色谱柱：Shim-pack VP-ODS (150×4.6)， Shim-pack GVP(4.6mm) 保护柱；

流动相：磷酸二氢钾(0.1M)-6%甲醇溶液，磷酸调pH值至3.2，使用前经微孔滤膜（0.45μm）过滤；

体积流速：1.5mL/min；

检测波长：312nm；

进样量：10μL；

柱温：室温；

检测器：SPD－M10AE二级管阵列；

Class-VP色谱工作站。

（2）测定方法

工作曲线的绘制：精密吸取不同稀释度的克拉维酸标样与咪唑溶液按1：5的比例混匀，30℃反应12min，迅速冷却至20℃，制得衍生标样。精密量取各衍生标样10µL进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

②发酵液的测定：将处理后发酵样品按标准曲线的绘制中的方法进行衍生，精密量取10µL进样，测定克拉维酸含量。

棒状链霉菌的发酵培养

将棒状链霉菌在ISP固体平板上划线分离，28℃培养3-5d后，挑取单菌落接种到5mL液体ISP培养基中， 200r/min,28℃培养24h，按1%（v/v）接种量转接至液体TSB种子培养中，采用250mL挡板三角瓶，装液量25mL/瓶，28℃，150r/min培养24h，按10%（v/v）接种量转接至SS发酵培养基进行培养，采用500mL挡板三角瓶，装液量为50mL/瓶，发酵条件为：28℃, 150r/min，发酵至72h，96h及120h时取样，样品经13200r/min离心10min ，上清液作为检测样品。

棒状链霉菌突变株B372的遗传稳定性考察：

将棒状链霉菌突变株B372进行连续四次转接传代，摇瓶发酵后HPLC法测定克拉维酸的效价。结果：紫外诱变突变株的初筛结果见表1和图1。

表1初筛统计结果

由表1可以看出，在含12%甘油的YMGA平板中生长的突变株中，绝大部分突变株的产量均不同程度上高于出发菌株，仅有11%为负突变。有20%的突变株的产量较出发菌株提高了50%以上，其中有10株的产量较出发菌株提高了1倍，占1.7%。说明以甘油作为选择压力能够有效的提高正突变株的筛选率。从比出发菌株提高50%以上的甘油耐受性突变株中选取37株进行斜面培养，准备摇瓶复筛。

摇瓶复筛结果：将初筛所得的甘油耐受性突变株分别转接于5mL ISP中，180r/min，28℃培养48h，HPLC法测定其克拉维酸含量，结果见图2。发现有一株甘油耐受性突变株其发酵液中克拉维酸的效价比出发菌株提高了80％以上。

棒状链霉菌突变株B372的遗传稳定性考察结果见表2，由表2可知，突变株B732在传代4次之内产酸量及其甘油耐受量较稳定，继续传代，则菌种的产酸量及其甘油耐受量均明显下降，所以应尽量控制传代次数在4代以内。

表2 S.clavuligerus B732的遗传稳定性

实施例 2

棒状链霉菌 lat 基因的 PCR 扩增

菌种：棒状链霉菌紫外诱变突变株B372，本实验室保存（实施例1中构建得到菌种）。

主要培养基及溶液：ISP、YMGA培养基参考实施例1。

其他常规培养基及溶液均参考萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第三版,北京:科学出版社,2002.

方法：

棒状链霉菌基因组DNA的提取：

（1）挑取固体YMGA平板上的S.clavuligerusB372单菌落接种于液体ISP培养基中，28℃ ，200r/min培养2d，2000r/min离心5min收获菌体。

（2）用10mM pH8.0的EDTA洗一次，或用水洗两次，所得菌体存于-20℃。

（3）加入SET溶液至1mL，并加入50mg/mL溶菌酶20μL，37℃水浴30-60min。

（4）加入20mg/mL的蛋白酶K 28μL混匀。

（5）加入120μL 10%SDS，翻转混匀，55℃温浴2h，分装于两个离心管中。

（6）分别加入500μL酚/氯仿，激烈震荡20min充分混匀。

（7）6500r/min离心15min,小心吸取上清液于另一离心管内。

（8）若蛋白沉淀不完全，可重复（6）、（7）两步。

（9）加入0.6μL冰的无水乙醇，翻转充分混匀，静置3min。

（10）离心沉淀DNA（若染色体较多可用加样枪挑入另一离心管中）。

（11）用0.5mL的冰无水乙醇洗一次。

（12）所得DNA在室温放置10min，使之干燥。

（13）将干燥后的DNA溶于20μL TE缓冲液中（或溶于水中，溶液用量视染色体量的多少而定），存于-20℃。

lat基因的PCR扩增

参照棒状链霉菌编码赖氨酸ε－转氨酶的lat基因相应的核苷酸序列，设计合成如下引物（引物委托上海生物工程有限公司合成），理论上将扩增出1771bp的片段（核酸序列如SEQ ID NO:1所示）。

引物1：5’-GAATTCCCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCA-3’

引物2：5’-GGATCCAGCGCGTCCTTCACAGCGGTGTACTCCCGCCCGTCGACG-3’

其中引物1和引物2中划线部分分别为EcoRI和BamHI酶切位点，以上述提取的棒状链霉菌的基因组DNA为模板，lat基因的上下游引物（引物1和引物2）进行PCR扩增，退火温度n=61℃。结果获得了1.8kb的片段（图3），与理论值相符。

实施例 3

安普抗性框的 PCR 扩增

菌种：棒状链霉菌紫外诱变突变株B372，实施例1中构建。

质粒：含安普抗性基因的质粒pIJ773，购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。

方法：

根据棒状链霉菌中lat基因的序列及质粒pIJ773中安普抗性基因的序列（该序列中还包含转移复制起始点oriT以及FLP重组酶的识别位点FRT序列，oriT便于后面重组质粒的接合转移）设计一对长59nt及58nt的引物，两引物分别含有20nt及19nt的安普抗性基因两侧的FRT序列的互补序列以及lat基因上下游的两段39nt的互补序列（图4）；

两引物序列如下：

引物：

3：5’CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTT

CTCACCCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’ ；

引物:

4：5’TGTAGGCTGGAGCTGCTTCGACCGCTCGT

CACAGTGCGGCCAGCGGCTCTCGCAGACT-3’；

按此引物PCR所得产物中应包含一个安普抗性基因，并且在它的两端含有各带有39bp的lat基因上下游的同源序列，理论大小为1.45kb，将此PCR产物称为安普抗性框。

以含有安普抗性基因的质粒pIJ773作为模板，引物3和引物4进行PCR扩增，退火温度n=50℃，获得了1.45kb的安普抗性框片段（图5），与理论值相符（核酸序列如SEQ ID NO:2所示）。

实施例 4

lat 基因中***安普抗性框的重组质粒 pELA 的构建

菌种：大肠杆菌DH5α，购自上海生工生物技术有限公司；大肠杆菌BW25113/pIJ790（pIJ790质粒是一个含有λRED(gam，bet，exo)功能启动子的温敏型质粒，λRED功能启动子能够极大的提高线性DNA的重组率），参考文献Gust B, Kieser T, Chater KF (2002). PCR targeting system in Streptomyces coelicolor A3(2). (John Innes Centre, Norwich Research Park).

质粒：pGH112，大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，具有氨苄青霉素抗性基因(amp)和硫链丝菌素抗性基因(tsr)，其中硫链丝菌素抗性基因在大肠杆菌和链霉菌中均能表达。

主要培养基及溶液：LB、SOB、SOC等常规培养基及溶液均参考萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第三版,北京:科学出版社,2002.

方法：

重组质粒pGH112-lat的构建

将上述PCR获得的lat基因片段经UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工）纯化，纯化产物用EcoRI和BamHI双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒载体pGH112连接，采用T4DNA连接酶于16℃恒温连接12h，所得的连接产物用于转化E.coli DH5α感受态细胞。

大肠杆菌电转用感受态细胞的制备

（1） 接大肠杆菌单菌落于LB培养基中，37℃，180r/min培养过夜。

（2） 将培养物以1%（v/v）接种量接种于另一装有100mL LB培养基中，37℃，180r/min培养2h～3h，使细胞达到对数生长期(A₆₀₀=0.6)。

（3）将三角瓶转移到冰上放置20min，3000r/min 4℃离心15min以收集细胞。

（4）弃上清，用10%甘油水溶液洗涤细胞3次，3000r/min 4℃离心15min收集细胞。

（5）将细胞悬浮在约300L 10％的甘油中，按40L每份分装到预冷的无菌离心管中并迅速于液氮中快速冷冻，然后置于-80℃保存。

大肠杆菌的电击转化

（1） 使用时将感受态细胞置于冰上融化，同时将电转杯预冷。

（2） 加入2L上述连接产物，混匀后加到冷的转杯内，轻击液体以确保细菌与DNA悬液位于电转杯底部。

（3）启动对细胞的电脉冲，室温下加入1mL SOC培养液。混匀后转入1.5mL离心管中，于37℃培养1h。

（4）按100L平板涂布到含适量相应抗生素的LB固体平.板上，37℃倒置培养过夜(16h-20h)，提取质粒鉴定转化子。

大肠杆菌中质粒的小量制备：

（1）取大肠杆菌单菌落划线分离于LB固体培养基(含相应抗生素)平板上，37℃倒置培养过夜。

（2）挑取单菌落于2mL LB液体培养基中，37℃，180r/min培养过夜。

（3）将1.5mL菌液转入微量离心管中，12000r/min离心30s收集菌体，弃上清。

（4）将沉淀重悬于100μL预冷的溶液I中，混合均匀。

（5）加入200μL新配的溶液II,盖紧管口，轻轻摇匀，确保离心管的整个内表面菌与溶液II接触，将离心管放置冰上1min-2min至液体清亮。

（6）加入150μL预冷的溶液III,温和的转动离心管，使溶液III在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴3min-5min。

（7）12000r/min离心5min，将上清转移到另一管中，加等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混合均匀，12000r/min离心5min,再将上清转移到另一离心管中。

（8）加入2-2.5倍体积的无水乙醇，混匀，冰浴（或-20℃）放置30min。12000r/min离心5min收集沉淀。

（9）用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，弃去残液，空气中干燥10min-20min，用20L无菌的ddH₂O溶解沉淀。

结果：将提取得到的质粒进行酶切电泳鉴定，结果如图6。以BamHI+EcoRI双酶切得到了约l.8kb的***片段条带和约6.5kb的载体条带。酶切结果与理论相符，证明质粒正确，命名为pGH112。

PCR-targeting构建重组质粒pELA

将上述验证正确的重组质粒pGH112–lat电转至Ecoli BW25113/pIJ790感受态中，在含有氯霉素（Cml²⁵）和氨苄青霉素（Amp¹⁰⁰）的LB固体培养基中30℃培养20h进行筛选。挑取E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子，在含有氨苄青霉素（Amp¹⁰⁰）、安普霉素（Apr²⁵）和L-***糖（终浓度为10mmol/L）的LB液体培养基中30℃培养E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子至OD₆₀₀≈0.6，将其制作成感受态细胞。将pGH112-lat转入E.coli BW25113/pIJ790菌株中后。

将实施例3中得到的带有lat基因同源序列的PCR产物安普抗性框电转化至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat感受态细胞中，将电转后菌株的培养温度由30℃提高到37℃，在含有Apr²⁵的抗性平板上培养过夜。在E.coli BW25113/ pIJ790/pGH112-lat的培养基中添加L-***糖可诱导pIJ790中λRED的表达，在λRED功能启动子的作用下，安普抗性框迅速地与重组质粒pGH112-lat发生同源重组，即安普抗性框两端的lat同源序列与pGH112-lat所携带的lat基因发生同源双交换（图7），从而使lat基因中***了含有aac(3)iv基因的安普抗性框，得到了一个lat基因被***突变的重组质粒。由于pIJ790质粒中含有一个温敏型的复制起始子和氯霉素抗性基因，当电转后菌株的培养温度由30℃提高到37℃并且不再向培养基中添加Cml抗生素后，pIJ790质粒的复制子不再转录并且在没有抗生素的选择压力下，它便逐渐丧失了自我复制的能力。所以重组子中仅含有一种带有lat突变基因的重组质粒，挑取克隆子并提取质粒进行PCR验证。

结果：以上述所提取质粒为模板，以实施例3中的引物3、引物4进行PCR验证，结果见图8，由图可以看出，PCR产物大小在1.45kb处（图中箭头所指），与安普抗性框大小相符。表明安普抗性框已成功整合到pGH112-lat的lat基因中，将此lat基因中***安普抗性基因的重组质粒命名为pELA。

实施例 5

lat 基因内部被敲除的重组质粒 pSCAR 的构建

菌种：大肠杆菌DH5α/BT340，BT340为温敏型质粒，带有氯霉素抗性（Cml²⁵），在42℃高温诱导下质粒BT340可以表达FLP重组酶，FLP重组酶可以特异性的识别FRT序列并进行切割。

主要培养基及溶液：参考实施例5。

方法：

将含有安普抗性框的重组质粒pELA（抗性框的两端含有FRT序列，该序列为FLP重组酶的识别位点）电转至E.coliDH5α/BT340中，BT340为温敏型质粒，带有氯霉素抗性（Cml²⁵），因此E.coliDH5α/BT340的感受态细胞的制备及培养过程温度均控制在较低的30℃。

在42℃高温诱导下质粒BT340可以表达FLP重组酶，FLP重组酶可以识别质粒pELA中安普抗性框两侧的FRT序列（图3），将FRT之间的抗性基因敲除，在此过程中质粒BT340自动消失，之后原lat基因***抗性基因的部分仅剩下81bp的scar序列（FRT序列经FLP酶切除后剩余的部分序列），所得为lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR（图9），其大小应为8.27kb的pELA去掉1.29kb（1449bp的安普抗性框减去两个39nt的lat基因同源序列以及81bp的scar序列）的安普抗性基因序列，即6.98kb。将长出的转化子用无菌牙签先后点接于分别含适量氨苄青霉素及安普霉素的LB平板，对能在氨苄抗性平板上生长而在安普霉素抗性平板上不生长的转化子，即Amp^R和Apr^S的转化子，进行提质粒及酶切验证，

结果：将 Amp^R和Apr^S的转化子进行提质粒及酶切验证，结果见图10，由图可知电泳结果与其理论值大小相吻合，所得lat基因内部被敲除的重组质粒命名为pSCAR。

实施例 6

棒状链霉菌与大肠杆菌的接合转移

菌种：大肠杆菌ET12567/pUZ8002；棒状链霉菌B372，实施例1中构建。

质粒：pELA，实施例4中构建。

主要培养基及溶液：2×YT(L^-1)：蛋白胨 16g、酵母提取物 10g、NaCl₂ 5g。 AS-1(L^-1)：酵母提取物 1g、L-丙氨酸 0.2g、L-精氨酸 0.2g、L-天门冬酰胺 0.5g、可溶性淀粉 5g、NaCl₂ 2.5g、Na₂SO4 10g、琼脂粉 20g；调pH至7.5。

其他常规培养基及溶液均参考萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第三版,北京:科学出版社,2002.

方法：

（1）取大肠杆菌ET12567/PUZ8002单菌落接入到LB液体培养基(含50g/mL Kan和25g/mL Chl)，于37℃，180r/min培养过夜。

（2）将重组质粒pELA转化至大肠杆菌ET12567/PUZ8002中，制得具有Kan⁵⁰/Chl²⁵/Apr²⁵三种抗性的克隆子大肠杆菌ET12567/PUZ8002/ pELA。

（3）挑取上述克隆子分别于10mL LB液体培养基（含50g/mL Kan、25g/mL Chl和25g/mLApr）中，于37℃180r/min条件下培养过夜。

（4）按0.1mL接种量将上述培养过夜的菌体转接于10mL含上述三种抗生素的LB中，于37℃180r/min条件下培养约4h使其A600达到0.4～0.6。

（5）用10mL LB培养基洗涤上述菌体，离心条件4000r/min×5min，并重悬于1mL LB液体培养基中。

（6）取10L浓度为10⁸个/mL的棒状链霉菌孢子悬液于500L 2×YT培养基中，50℃热击10min使其萌发，冷却。

（7）取0.5mL E. coli与0.5mL热击后的孢子悬液快速混匀，离心去上清，将沉淀重悬于剩余的约50μL液体中。

（8）将上述沉淀用无菌水依次稀释10^-1～10^-4倍，并按100L涂布量涂布于不含抗生素的AS-1 +10mMMgCl₂平板，30℃恒温培养30h。

（9）用1mL含有0.5mg萘啶酮酸和1.25mgApr的水溶液覆盖上述平板，可用涂布器使其覆盖均匀，继续于30℃恒温培养。

（10）将长出的单菌落分别影印于含有及不含50g/mL Kan的DNA平板（含25g/mL萘啶酮酸和50g/mLApr），筛选Kan^S及Apr^R的双杂交接合体。

（11）将筛选出的上述双杂交接合体检出划线于YMGA（含25g/mL萘啶酮酸和50g/mL Apr）平板。

由于重组质粒pELA中安普抗性框的两端含有lat基因的同源序列，所以将重组质粒pELA接合转移至棒状链霉菌中后，质粒中的lat基因的同源序列与棒状链霉菌中野生型的lat基因将发生双交换，使得棒状链霉菌基因组中的野生型lat基因被安普抗性框所置换（图11），实现了棒状链霉菌中lat基因的双交换突变。

将筛选出的上述转化子用接种环接种在含萘啶酮酸和安普霉素的YMGA平板上，28℃培养3－5天，直至孢子出现，收集孢子，将孢子在不含抗生素的YMGA培养基上进行松弛培养，并在该培养基上传代三次，仍具有抗性的菌株初步确定为发生了双交换的菌株。分别以待验证的链霉菌突变株的基因组和出发菌株S.clavuligerusB372的基因组为模版，lat基因的上下游引物进行PCR验证，检验棒状链霉菌基因组DNA中的lat基因中是否被***了含有aac(3)iv基因的安普抗性框。 S.clavuligerus lat::aac的lat基因中的191～1600bp被1.45kb的安普抗性基因所取代，因此PCR产物理论大小应为1.85kb，

结果：PCR验证结果见图12，由图12可知，以突变株的基因组为模版可以PCR得到一条大小约为1.85kb的特异性片段，与理论值相吻合，而以出发菌株的基因组DNA为模板的对照菌株的PCR产物为1.8kb，表明重组质粒pELA已通过同源性双交换***到棒状链霉菌的lat基因中，将该突变株命名为S.clavuligerus lat::aac。

实施例 7

S.clavuligerus lat::aac 中抗性基因的敲除

菌种：棒状链霉菌lat::aac，实施例6中构建。

质粒：pSCAR，实施例6中构建。

主要培养基及溶液：R2YE培养基、 P-buffer、T-buffer均参考Kieser T, Chater K, Bibb MJ, Buttner MJ, Hopwood DA . Practical Streptomyces genetics[M]. (John Innes Foundation, Norwich, U.K.) (2000).；其他常用溶液参考萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第三版,北京:科学出版社,2002.

方法：

棒状链霉菌原生质体的制备

由于重组质粒pGH112-lat在进行安普抗性框敲除的过程中，安普抗性框中的具有接合转移功能的oriT基因也同时被敲除，所以得到的重组质粒pSCAR为不具有接合转移功能的质粒，须通过原生质体转化的方法转入棒状链霉菌中。因此，首先按如下方法制备棒状链霉菌的原生质体。

（1）向YEME培养基中按0.1mL接种量接入棒状链霉菌孢子悬液，30℃　150r/min培养34h。

（2）于4℃1000g×10min离心，弃上清。

（3）将沉淀重悬于15mL 10.3％的蔗糖溶液中，4℃，1000g×10min离心，小心弃上清液，重复本步骤一次。

（4）将菌体溶于4mL 1mg/mL溶菌酶的 P-buffer溶液中，30℃温育15min。

（5）用移液管吹吸3次，并再温育15min。

（6）向上述体系中加入5mL P-buffer，并重复步骤（5）。

（7）用孢子过滤装置将上述液体过滤，并将滤液收集于离心管中。

（8）1000g×7min离心沉淀原生质体。

（9）所得原生质体用P-buffer洗涤2次，每次均采用4℃，1000g×7min沉淀。

（10）弃上清，沉淀重悬于1mL P-buffer中。

质粒转化棒状链霉菌原生质体：

（1）将原生质体悬液（10¹⁰个/mL）分装于无菌小EP管中，50μL/管，将棒状链霉菌原生质体在转化前于45℃温育10min，降低链霉菌的限制性酶的活性，使外源DNA免遭限制酶降解而更易于转入链霉菌中。

（2）加入5μL质粒DNA溶液，轻拍管壁迅速混匀。

（3）加入200μL 含25%PEG1000的T-buffer，反复吹吸四次混匀，吸取100～200μL转化液涂布于两干燥的R2YE平板上，若需稀释则用P-buffer进行稀释。

（4）30℃培养36h长出微小克隆子后， 用含8μg/mL硫链丝菌素（安普抗性框被敲除后采用重组质粒pSCAR所携带的硫链丝菌素抗性基因tsr进行筛选）的营养琼脂覆盖各转化平板，继续于30℃培养3天。用无菌牙签挑取转化子于不含抗生素的YMGA平板，30℃培养3～4天后，将长出的菌落分别于含有硫链丝菌素（Thio⁸）的营养琼脂平板及含有安普霉素（Apr²⁵）的营养琼脂平板上影印妥当，对两种抗生素都敏感的菌落可初步断定为lat基因中抗性基因被敲除的突变菌株。

转化子的验证：

对所得Apr^S和Thio^S突变菌株按上述实施例2中的方法提取基因组DNA作为模板，并以出发菌株S.clavuligerusB372的基因组DNA作为对照模板，以实施例1中所述lat基因上下游引物进行PCR验证，S.clavuligerusB372的lat基因未发生突变，所以PCR产物理论值应为1.8kb，S.clavuligerus lat::aac的lat基因中的191～1600bp被1.45kb的安普抗性基因所取代，因此PCR产物理论大小应为1.85kb，而抗性标记被敲除的突变株的PCR产物理论大小应为481bp（安普抗性框两侧的39bp距lat基因的上下游分别为230bp和170bp，以及81bp的scar序列）。

结果：转化子的验证结果见图12。

由图12可知以抗性标记被敲除的突变株基因组为模板的PCR产物大小在400bp－500bp之间，与理论值481bp相一致，而对照菌株基因组的PCR产物为1.8kb，以lat基因双交换突变株的基因组DNA作为模板的PCR产物为1.85kb，证明lat基因中的抗性基因已经被敲除，所得的抗性标记被敲除的lat基因突变菌株，命名为S.clavuligerus lat::Δ。

实施例 8

棒状链霉菌头霉素 C 及克拉维酸产量的测定

菌种：大肠杆菌ESS，头霉素C生物活性指示菌，加拿大阿尔伯塔大学S.E. Jensen教授提供。棒状链霉菌B372，实施例1中构建；棒状链霉菌lat::Δ，菌种保藏号。

主要培养基及溶液：ISP培养基、TSB液体培养基、SS液体培养基参考上述实施例1。

方法：

棒状链霉菌发酵液中头霉素C及克拉维酸的含量测定

对突变菌株lat::Δ及出发菌株对照菌株进行发酵培养，发酵培养方法参考实施例1。取不同发酵时间的发酵液进行头霉素C及克拉维酸含量的测定。

其中发酵液中头霉素C的测定采用生物法，以E.coli ESS为指示菌，测定头霉素C产量的相对高低。在直径90mm的培养皿内加入含适量菌悬液的TSB培养基15mL，凝固后将无菌滤纸片贴在已制备好的平板中，每板放四片。用加样枪精密吸取各发酵液3μL于滤纸片上，待纸片稍干后置于37℃培养箱培养过夜测量各剂量抑菌圈的直径。

发酵液中克拉维酸含量的测定采用HPLC法，具体方法参考实施例1。

结果：见图13和表2。由图13可知在同样的培养条件下，突变菌株的头霉素C产量较原始菌株明显下降，表明lat基因的突变抑制头霉素C的生物合成。

由表3可知，对同样的发酵液测定其克拉维酸的产量，结果突变菌株的克拉维酸产量最高可达650.15 mg/L，较对照菌株提高了22％，表明棒状链霉菌突变菌株头霉素C代谢支路的阻断，有效提高了棒状链霉菌克拉维酸的产量。

表3 突变菌株及原始菌株发酵液中克拉维酸产量的HPLC测定结果

菌株	发酵96h (mg/L)	突变株为原始菌株的倍数
			W	532.91	1.00
M-1	635.87	1.19
			M-2	650.15	1.22
M-3	618.71	1.16
			M-4	598.99	1.12

注：W代表原始对照菌株，M代表突变菌株。

由于抗生素的大量使用导致的细菌对很多药物的抗药性问题，己成为临床上治疗细菌性疾病的一个棘手问题。据我国细菌耐药监测中心报道，不但一些老抗生素如某些种类青霉素已经接近失效，即使用于临床时间并不长的新型抗生素，如沙星类和头孢类，对于某些常见细菌的耐药性也达到了令人吃惊的程度。病原菌对β－内酰胺类抗生素的耐药性，已成为临床上难治性感染的重要因素之一。克拉维酸等β－内酰胺酶抑制剂同β－内酰胺类抗生素联合使用对于杀灭产生β－内酰胺酶的耐药菌有良好的作用：既抑制了β－内酰胺酶的活性，又增强了这类抗生素的广谱抗菌作用。

然而，目前我国所使用的克拉维酸的原料大部分都是来源于进口，主要原因是由于国内改造和筛选菌株的水平较落后，没有好的高产菌株可以应用于生产，因此研究和开发克拉维酸产生菌，提高克拉维酸产量，降低生产成本，有着非常广阔的市场前景。

本研究选择菌株Streptomyces clavuligerus NRRL3585为研究出发菌株，通过传统诱变育种、分子生物学等技术对菌株进行改造，从而使菌株的代谢途径发生改变，克拉维酸产量明显提高，为链霉菌这一类抗生素生产菌的不同水平进行改造提供理论依据，具有一定的科学价值和实际应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种棒状链霉菌的工程菌株及其制备方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1771

<212> DNA

<213> lat基因

<400> 1

ccataattca gcctgatccc ccaggagttc tcacccatgg gcgaagcagc acgccacccc 60

gacggcgatt tctcggacgt gggaaacctc cacgctcagg acgtgcacca ggcacttgag 120

cagcatatgc tcgtcgacgg gtacgacctc gttctcgacc tcgacgccag ctccggcgtc 180

tggctcgtcg acgccgtcac ccagaagcgg tatctcgacc tcttttcctt ctttgcctcg 240

gcgccgctcg gaatcaaccc gcccagcatt gtcgaggacc cggcattcat gcgggagctg 300

gccgtggccg cggtcaacaa gccgtcgaac cccgatcttt attcggtgcc gtacgcccgt 360

ttcgtcaaga ccttcgcccg ggtcctcggc gacccccggc tgcggcggct gttcttcgtg 420

gacggcgggg cgctggccgt ggagaacgcg ctcaaggcgg ccctcgactg gaaggcccag 480

aagctgggcc tcgccgagcc ggacaccgac cggctccagg tgctgcatct ggagcgctcg 540

ttccacggcc gcagcggcta caccatgtcg ctgacgaaca ccgagccgtc caagaccgcc 600

cgcttcccca agttcggctg gccacggatc tcgtcccccg ccctccagca cccgccggcc 660

gagcacaccg gcgccaacca ggaggccgag cgacgggcgc tggaggccgc ccgggaggcg 720

ttcgcagcgg cggacggcat gatcgcctgc ttcatcgcgg agcccatcca gggcgagggc 780

ggcgacaacc acctcagcgc ggagttcctc caggccatgc agcggctctg ccacgagaac 840

gacgccctgt tcgtcctgga cgaggtgcag agcggctgcg gcatcaccgg taccgcctgg 900

gcctaccagc agctcggcct ccagcccgac ctggtggcct tcggcaagaa gacccaggtc 960

tgcggggtga tgggcggcgg ccggatcgac gaggtccccg agaacgtctt cgccgtctcc 1020

tcccggatca gctccacctg gggcggcaac ctcgccgaca tggtccgcgc cacccggctg 1080

ctggagacga tcgagcgcac ccaggtcttc gacaccgtcg tccagcgcgg caagtacttc 1140

cgggacggcc tggaggacct ggccgcccgc cacccctccg tcgtgaccaa cgcccgcggc 1200

cggggcctga tgtgcgcggt cgacctgccg gacacccgga cccgcaatga ggtgctgcgg 1260

ctcatgtaca cggagcacca ggtcatcgcc ctgccctgcg gcgggcgcag cctccggttc 1320

cgccccgcgc tgacgatcgc ggagcacgag atcgaccagg cccttcaggc gctggcgagc 1380

agtgtcacgc cggtcgccga gagcgtctga cgcccggccg gccgggtgcc ccagcggggc 1440

ccggccggcc gcaccgcgga acggaacacc cctggcgcgt cgcccggtga cacgctctcc 1500

gggcggctca accgcgccac ccccacggca cgttcgcctt cacccgcacg gagagcccac 1560

gaatgatgtc agcacggtac ccgaggaccg cagcggagtg gaccactcgc attcaaggag 1620

tgtcgagcga gcgttgcgat cttgaaatgc tgctgaagga cgagtggcgc aacaggatcg 1680

cggtacggga cgacgacccc ggtgtccgtg cgacgaggca gcgggacatc gtcgtcgacg 1740

ggcgggagta caccgctctg aaggacgcgc t 1771

<210> 2

<211> 1457

<212> DNA

<213> 安普抗性框基因

<400> 2

ccataattca gcctgatccc ccaggagttc tcacccatgt gtaggctgga gctgcttcga 60

agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aacttatgag ctcagccaat 120

cgactggcga gcggcatcgc attcttcgca tcccgcctct ggcggatgca ggaagatcaa 180

cggatctcgg cccagttgac ccagggctgt cgccacaatg tcgcgggagc ggatcaaccg 240

agcaaaggca tgaccgactg gaccttcctt ctgaaggctc ttctccttga gccacctgtc 300

cgccaaggca aagcgctcac agcagtggtc attctcgaga taatcgacgc gtaccaactt 360

gccatcctga agaatggtgc agtgtctcgg caccccatag ggaacctttg ccatcaactc 420

ggcaagatgc agcgtcgtgt tggcatcgtg tcccacgccg aggagaagta cctgcccatc 480

gagttcatgg acacgggcga ccgggcttgc aggcgagtga ggtggcaggg gcaatggatc 540

agagatgatc tgctctgcct gtggccccgc tgccgcaaag gcaaatggat gggcgctgcg 600

ctttacattt ggcaggcgcc agaatgtgtc agagacaact ccaaggtccg gtgtaacggg 660

cgacgtggca ggatcgaacg gctcgtcgtc cagacctgac cacgagggca tgacgagcgt 720

ccctcccgga cccagcgcag cacgcagggc ctcgatcagt ccaagtggcc catcttcgag 780

gggccggacg ctacggaagg agctgtggac cagcagcaca ccgccggggg taaccccaag 840

gttgagaagc tgaccgatga gctcggcttt tcgccattcg tattgcacga cattgcactc 900

caccgctgat gacatcagtc gatcatagca cgatcaacgg cactgttgca aatagtcggt 960

ggtgataaac ttatcatccc cttttgctga tggagctgca catgaaccca ttcaaaggcc 1020

ggcattttca gcgtgacatc attctgtggg ccgtacgctg gtactgcaaa tacggcatca 1080

gttaccgtga gctgcatttt ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt 1140

ttcggtatat ccatcctttt tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga 1200

ctttccttgg tgtatccaac ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc 1260

gagcgggtgt tccttcttca ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc 1320

tgctctgcga ggctggcggg aacttcgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc 1380

gaactgcagg tcgacggatc cccggaatat caagcttatg acgcccggcc ggccgggtgc 1440

cccagcgggg cccggcc 1457

Claims (10)

1.棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株 ，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No。

2.权利要求1所述的菌株，其中棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 是由野生菌株Streptomyces clavuligerus NRRL3585突变而来，其是由所述野生菌株经紫外线诱变及基因工程改造筛选得到的克拉维酸高产的突变株。

3.权利要求1或2所述棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株在制备用于提高抑制耐药细菌产生β－内酰胺酶的活性增强抗生素广谱抗菌药物中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中所述的提高抑制耐药细菌产生β－内酰胺酶的活性指的是提高克拉维酸产量抑制β－内酰胺酶活性。

5.一种紫外线诱变选育高产棒状链霉菌突变株B372(Streptomyces clavuligerus B372) 菌株的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）棒状链霉菌孢子悬液的制备；

（2）紫外线诱变；

（3）初筛:通过琼脂块法对高产克拉维酸的棒状链霉菌进行初筛；

（4）复筛:用摇瓶发酵，HPLC法检测发酵液克拉维酸量的多少来进行复筛；

（5）验证高产菌株:将复筛后得到的高产菌株传代培养6次，每次都用与复筛一样的方法对菌株产酸稳定性进行验证。

6.根据权利要求5所述的诱变育种方法，其特征在于：紫外照射诱变采用15W或30W紫外线，提前预热20—30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20—30cm处进行紫外照射30—45秒。

7.根据权利要求5所述的诱变育种方法，其特征在于按以下的步骤进行:

（1）构建lat 基因中***安普抗性框的重组质粒pELA；

（2）将含有lat基因的重组质粒pELA转化宿主细胞，获得转化子；

（3）构建 lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR；

（4）将棒状链霉菌B372作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，获得接合子，即棒状链霉菌的lat基因阻断突变菌S.clavuligeruslat::aac；

（5）将棒状链霉菌S.clavuligeruslat::aac作为受体，将步骤3）所述的重组质粒pSCAR转入受体菌，获得不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株S.clavuligeruslat::Δ。

8.根据权利要求7所述的诱变育种方法，其特征在于，所述的棒状链霉菌突变株B372的lat基因的第191～1600位之间的核苷酸片段被一段安普抗性基因置换掉，不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（1）和（3）所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pGH112；步骤（2)所述的宿主细胞是大肠杆菌ET12567。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（5)所述的受体是棒状链霉菌lat::aac的原生质体，原生质体的制备条件为采用1mg/mL的溶菌酶浓度，酶解45min，原生质体的转化条件为采用25%的PEG1000介导转化，转化前将棒状链霉菌原生质体于45℃温育10min，以降低链霉菌的限制性酶的活性。

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