CN102321655A - 一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用，该表达载体包括attB序列、pUC ori和多克隆位点MCS，CMV组成型启动子与attB序列相连接，CMV组成型启动子下游***两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素表达元件。该载体可应用于筛选稳定表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞。

Description

一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异性整合的表达载体，特别涉及一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

转基因动物的研究现在正是科学研究中的热点。通过转基因技术，人们可以打破种间隔离获得具有优良性状的经济动物，可以通过生产生物反应器获得各种生物材料和药用蛋白，可以打破免疫排斥进行器官移植，可以建立各种人类疾病的动物模型以及分析研究特定基因功能。然而，现有的转基因动物生产技术仍然存在一定弊端：外源基因的随机***带来的位置效应，即外源基因随机***到与细胞重要生命活动相关的基因内部引起其异常表达，或者外源基因***异染色质区造成外源基因表达沉默。

近年来，链霉菌噬菌体φC31整合酶能够催化链霉菌基因组中的attB位点和噬菌体基因组attP位点之间的同源重组引人关注[Kuhstoss S，Rao RN.Analysis of the integration function of the streptomycete bacteriophageφC31.JMol Biol，1991，222(4)：897-908.]。φC31整合酶介导的重组具有单向整合、无需外界化学能源和辅助因子、胜任大片段基因有效整合、可在多种高等植物和动物细胞中发挥作用及外源基因可长期高效表达等特点[Calos MP.TheφC31integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther，2006，6(6)：633-645.]，已经成为继Cre重组酶和FLP重组酶之后的又一种基因修饰的有力工具，越来越多的用于转基因研究。

而有关假attP位点在基因组分布规律方面的研究表明，假attP位点多位于基因间或基因内含子内，整合很少发生在基因的外显子中[Thyagarajan B，Liu Y，Shin S，Lakshmipathy U，Scheyhing K，Xue H，

C，Strehl R，Hyllner J，Rao MS，Chesnut JD.Creation of engineered human embryonic stemcell lines usingφC31integrase.Stem Cells，2008，26(1)：119-126.]。这种偏向于转录活跃区的整合有利于基因的表达，这有可能是整合酶介导的整合与随机整合相比普遍有较长时间高水平表达的原因[Calos MP.TheφC31integrasesystem for gene therapy.Curr Gene Ther，2006，6(6)：633-645.]。而且，整合位点不偏好于转录起始位点[Chalberg TW，Portlock JL，Olivares EC，ThyagarajanB，Kirby PJ，Hillman RT，Hoelters J，Calos MP.Integration specificity of phageφC31integrase in the human genome.J Mol Biol，2006，357(1)：28-48.]，Sivalingam等[Sivalingam J，Krishnan S，Ng WH，Lee S S，Phan TT，Kon OL.Biosafety assessment of site-directed transgene integration in human umbilicalcord-lining cells.Mol Ther，2010，18(7)：1346-1356.]发现，超过70％的整合位点位于转录起始位点50kb以外。因此，从这方面来讲，φC31整合酶介导的整合潜在的安全隐患较随机***和病毒载体***要小的多。

体细胞核移植技术作为转基因动物生产的有效有段，其突出优点是将基因转移提前到体细胞培养阶段，可以有效的提高转基因动物的出生率和控制生产成本[M.B.Wheeler and E.M.Walters.Transgenic technology andapplications in swine.Theriogenology2001，56(8)：1345-1369]，但是核供体细胞的准备一般需要经过药物筛选，而最终转基因细胞中抗生素筛选标记的残留，对转基因动物安全及环境安全造成了潜在的威胁。

尽管在转基因动物生产过程中，抗生素筛选标记残留已经逐渐引起人们的重视，其中，Cre/LoxP***最多的被选择用来切离筛选标记[Wang S，Sun X，Ding F，Zhang K，Zhao R，Li S，Li R，Tang B，Zhang L，Liu Y，Li J，Gao F，WangH，Wang L，Dai Y，Li N.Removal of selectable marker gene from fibroblast cellsin transgenic cloned cattle by transient expression of Cre recombinase andsubsequent effects on recloned embryo development.Theriogenology.2009，72(4)：535-41.]。然而鉴于Cre/LoxP***动态、可逆的重组特性，在引入Cre重组酶介导切离后，需要挑取多个阳性克隆进行PCR鉴定和Southernblotting评估Cre的重组效率。但是这一系列常规检测手段工作量巨大，而且耗费大量时间。鉴于此，一种有效检测并指示Cre/LoxP切离效率的***迫切的需要用于转基因动物生产过程中。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用，克服现有基因整合和抗生素筛选方面存在的缺陷，为体细胞核移植构建转基因克隆胚提供无抗生素筛选标记的核供体细胞，提高转基因动物生产的安全性。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于假attP位点整合的通用型表达载体，包括attB序列、pUC ori和多克隆位点MCS，CMV组成型启动子与attB序列相连接，CMV组成型启动子下游***两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。

所述的attB序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的CMV组成型启动子为Pcmv IE启动子。

所述的多克隆位点MCS包括以下限制性内切酶识别位点：

MluI、BamHI、PacI、PspOMI、SacI、FseI、AclI、XhoI、PvuI、KpnI、HindIII、BglII和EcoRI。

所述的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的第一荧光指示蛋白开放阅读框为绿色荧光蛋白eGFP开放阅读框，第二荧光指示蛋白开放阅读框为红色荧光蛋白DsRed开放阅读框，其终止子均为Sv40终止子。

所述的抗生素筛选元件为KanR/neoR表达元件，两个LoxP元件之间以还设有一个阻止CMV组成型启动子对第一荧光指示蛋白泄漏表达的Sv40终止子。

一种基于假attP位点整合的通用型表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.1所示的两端含有AseI酶切位点及保护碱基的attB序列；

2)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.2所示的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点的LoxP2序列；

3)通过SOE-PCR方法，，克隆获得如SEQ.ID.NO.3所示的包含多个克隆位点的MCS序列；

4)用BamHI/BglII双酶切pEGFP-C1载体，凝胶回收载体骨架片段并连接后，获得pEGFP-B2载体；

通过AseI酶切位点将attB序列克隆入pEGFP-B2载体获得pAttB-eGFP载体；

通过NheI/AgeI酶切位点将LoxP2序列克隆入pAttB-eGFP载体获得pAttB-Loxp2-eGFP载体；

5)通过SpeI/AflII酶切位点，将包含KanR/neoR基因开放阅读框、表达KanR基因的原核启动子、表达neoR基因的SV40早期启动子及HSV TKpolyA终止子的KanR/neoR表达元件，克隆入pAttB-Loxp2-eGFP载体中得到pAL2G-neo载体；

然后再通过AflII/NotI酶切位点将Sv40pA终止子克隆入pAL2G-neo载体，得到pAL2G-neopA载体；

6)用MluI/EcoO109I分别双酶切MCS序列和pAL2G-neopA载体，凝胶回收酶切后的片段，然后将回收的片段连接后得到pANG-MCS载体；

7)通过AscI/SpeI酶切位点将DsRed1开放阅读框及其终止子序列克隆入pANG-MCS载体，得到基于假attP位点整合的通用型表达载体pARNG。

所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体在筛选稳定表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞的应用。

所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体在进行细胞转染之后，进行药物筛选，获得表达载体稳定转染的重组细胞；然后对其进行Cre重组剪切LoxP序列的处理，筛选稳定表达第一荧光蛋白的重组细胞，获得表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞。

所述的Cre重组剪切LoxP序列的处理为：

对药物筛选后的重组细胞进行包含Cre元件的表达载体的转染，或者将其在含有连接有穿膜肽的Cre重组酶的环境中进行孵育。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的基于假attP位点整合的通用型表达载体，在进行细胞转染后，在链霉菌噬菌体φC31整合酶介导下，能够位点特异性地整合到真核细胞基因组内假attP位点，其分布偏向于基因间或基因内含子内的转录活跃的区域，避免了质粒随机***引起的基因表达沉默和其他安全隐患，从而使得转基因持续高效表达。

2、本发明提供的基于假attP位点整合的通用型表达载体，由于LoxP-第二荧光标记-抗生素元件的设计，能够通过G418进行药物筛选，获得既具有G418抗性又稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆，一方面排除了因为个别野生型细胞对G418不敏感形成的假阳性克隆，另一方面红色荧光蛋白的持续高效表达也可以反映整合位点位于染色体转录活跃区，筛选适于转基因高效表达的重组体。此时，由于两个同向LoxP之间终止子的作用，第一荧光标记绿色荧光蛋白不表达。

3、本发明提供的基于假attP位点整合的通用型表达载体，在筛选获取阳性的重组细胞后，通过Cre重组剪切作用，去除两个同向LoxP之间的抗生素筛选标记、红色荧光蛋白基因及终止子，使得CMV启动子和eGFP基因拼接，绿色荧光蛋白得以表达，提示Cre重组酶切离成功，重组细胞转换为绿色荧光蛋白作为指示标记。

然后通过对绿色荧光蛋白的筛选(流式细胞仪分选)，得到稳定表达绿色荧光蛋白(转基因生物标签)的无抗生素筛选标记的转基因细胞，可作为核供体细胞通过SCNT生产转基因动物。这样既通过了抗生素的压力选择获得表达稳定的细胞，进而又对其进行切除并转换成绿色荧光标记，排除了抗生素筛选标记对转基因动物安全和环境安全的影响。

4、本发明提供的基于假attP位点整合的通用型表达载体，针对载体整合位点、转基因表达水平和抗生素筛选标记残留等问题，可应用于为体细胞核移植构建转基因克隆胚提供无抗生素筛选标记的核供体细胞，从而建立一种无抗生素筛选标记的转基因动物安全培育体系，为开展动物转基因研究提供有价值的技术平台。

附图说明

图1-a～图1-e为SOE-PCR扩增attB片段、LoxP2片段和MCS片段的凝胶电泳检测图；

图2为本发明构建方法流程图；

图3为本发明载体***构成图；

图4a～图4-c为本发明载体构建中间载体的酶切鉴定和PCR扩增片段的鉴定；

图5a～图5-b为表达载体pARNG的酶切鉴定；

图6为荧光显微镜检测进行重组后表达载体pARNG中构建的双荧光标记的指示情况；

图7为Western Blotting检测进行重组后表达载体pARNG中构建的双荧光标记的指示情况；

图8a～图8-f为流式细胞仪检测进行重组后表达载体pARNG中构建的双荧光标记的指示情况。

具体实施方式

本发明提供的基于假attP位点整合的通用型表达载体，该载体***能够在链霉菌噬菌体φC31整合酶的介导下，位点特异性地整合到真核细胞基因组内假attP位点，从而使得转基因持续高效表达，解决载体整合位点、转基因表达水平的问题；然后经药物筛选得到阳性细胞后，在Cre重组剪切的作用下切除抗生素筛选标记，并通过双荧光报告***检测切离效率，最终经流式细胞仪分选出完全切离筛选标记的转基因细胞，用于体细胞核移植，生产无抗生素筛选标记的转基因动物，从而提高转基因动物安全性，为开展动物转基因研究提供有价值的技术平台。下面结合具体的载体的构建和检测对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一种基于假attP位点整合的通用型表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.1所示的两端含有AseI酶切位点及保护碱基的attB序列；具体操作为：

a、将四对引物attB1 F/attB1 R，attB2F/attB2R，attB3F/attB3R，attB4F/attB4R通过SOE-PCR方法合成片段attB1，attB2，attB3和attB4(图1-a)；该步骤SOE-PCR所用的模板为引物本身，如attB1F/attB1R本身既是引物也是模板，由于这两对引物有15-20bp的反向互补序列，退火时互补序列结合，PCR时在Taq酶作用下延伸补齐片段，形成下一轮SOE-PCR的模板；

attB1F：ttcgacgcgt agttattaat gtcgacgatg taggtcacgg tctcgaagcc gcgg

attB1R：cgcgcccggg gagcccaagg gcacgccctg gcacccgcac cgcggcttcg agac

attB2F：ggctccccgg gcgcgtactc cacctcaccc atctggtcca tcatgatgaa cggg

attB2R：gcgccgcgcg ttcgccggga tcaactaccg ccacctcgac ccgttcatca tgat

attB3F：gcgaacgcgc ggcgcaccgg gaagccctcg ccctcgaaac cgctgggcgc ggtg

attB3R：acccgccgac gccgtcgcac gtcccgtgct caccgtgacc accgcgccca gcgg

attB4F：acggcgtcgg cgggtgcgga tacgcggggc agcgtcagcg ggttctcgac ggtc

attB4R：aacgacgcgt tactattaat gtcgacatgc ccgccgtgac cgtcgagaac ccgc

b、分别以片段attB1和attB2为模板，以attB1F和attB2R为引物，通过SOE-PCR方法合成片段attB12(图1-b)；同样，以片段attB 3和attB 4为模板，以attB3F和attB4R为引物，通过SOE-PCR方法合成片段attB34(图1-b)；

c、最后以片段attB12和attB34为模板，以attB1F和attB4R为引物，通过SOE-PCR方法合成attB序列，其具体的序列如SEQ.ID.NO.1所示(图1-c)。

由于attB序列原本来源于链霉菌噬菌体φC31基因组，考虑到模板制备的困难，所以采用SOE-PCR来扩增attB序列，同时在其两端设计含有AseI酶切位点的序列，以便于克隆入通用型表达载体，从而实现其位点特异性整合。

2)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.2所示的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点(内侧识别位点为AscI、SpeI、AflII和NotI，外侧位点为NheI和AgeI)的LoxP2序列；具体操作为：

a、将引物LoxP2F1和LoxP2R1通过SOE-PCR的方法合成片段LoxP1(图1-a)；该步骤SOE-PCR所用的模板为引物本身，如LoxP2F1/LoxP2R1本身既是引物也是模板，由于这两对引物有15-20bp的反向互补序列，退火时互补序列结合，PCR时在Taq酶作用下延伸补齐片段，形成下一轮SOE-PCR的模板；

b、以片段LoxP1为模板，LoxP2F1和LoxP2R2为引物，通过SOE-PCR的方法合成片段LoxP2(图1-b)，其序列具体如SEQ.ID.NO.2所示，其中LoxP序列为ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat；

LoxP2F1：ctagctagct agataacttc gtatagcata cattatacga agttatttgg cgcgccttg

LoxP2R1：tagtttagcg gccgcaaatg ccttaagatg gactagtcca aggcgcgcca aataac

LoxP2R2：gcgaccggta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatagttt agcggccgc

通过SOE-PCR扩增得到的LoxP2序列：1.得到两个同向的LoxP序列，用于实现Cre重组切离；2.在两个同向LoxP序列外侧增加NheI和AgeI酶切位点使得LoxP2序列可以克隆入载体；3.在两个同向的LoxP序列之间增加AscI、SpeI、AflII和NotI酶切位点便于KanR/neoR表达元件、DsRed开放阅读框及SV40终止子的***。

3)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.3所示的包含多个克隆位点的MCS序列，其中含有13个限制性内酶切识别位点，依次是：MluI、BamHI、PacI、PspOMI、SacI、FseI、AclI、XhoI、PvuI、KpnI、HindIII、BglII和EcoRI；其具体的操作为：

a、将两对引物MCS1F/MCS1R和MCS2F/MCS2R通过SOE-PCR方法合成片段MCS1和MCS2(图1-d)；该步骤SOE-PCR所用的模板为引物本身，如MCS1F/MCS1R本身既是引物也是模板，由于这两对引物有15-20bp的反向互补序列，退火时互补序列结合，PCR时在Taq酶作用下延伸补齐片段，形成下一轮SOE-PCR的模板。

MCS1F：tcgacgcgtc gcggatccgt gccttaatta aggactgggc ccattgcgag ctc

MCS1R：ctcgagggtg caacgttcgc ttggccggcc ttgaccgagc tcgcaatggg ccc

MCS2F：aacgttgcac cctcgagcgg atcgatcgat tggggtaccc cgccaagctt gg

MCS2R：atggcagggc ctgccggaat tcggtgaaga tcttctccca agcttggcgg gg

分别以片段MCS1和MCS2为模板，以MCS1F和MCS2R为引物，通过SOE-PCR方法合成片段MCS(图1-e)；

在进行上述步骤1)～3)的扩增时，对于其扩增的片段同时进行凝胶电泳检测，其检测结果如图1-a～1-e所示：图1-a中泳道1～5分别是凝胶电泳检测片段attB1(93bp)、attB2(93bp)、attB3(93bp)、attB4(91bp)和LoxP1(97bp)；图1-b中泳道1、2为凝胶电泳检测片段attB12(171bp)，泳道3、4为片段attB34(169bp)，泳道5、6为片段LoxP2(141bp)；图1-c中泳道1、2为凝胶电泳检测片段attB(325bp)；图1-d中泳道1、2分别为凝胶电泳电泳检测片段MCS1(89bp)和MCS2(89bp)；图1-e中泳道1、2为凝胶电泳检测片段MCS(161bp)；对MCS检测引物采用如下引物：

EGFP-C for primer：catggtcctg ctggagttcg tg

pUC_ori_rev primer：ggtctgacgc tcagtggaac g

参见图2所示的载体构建流程图，以下说明载体各个元件在载体中的构建流程：

4)用BamHI/BglII双酶切pEGFP-C1载体(Clontech)，去除载体本身的多克隆位点，凝胶回收载体骨架片段，4℃过夜连接，得到重组载体pEGFP-B2；

用BamHI/BglII双酶切pDsRed1-C1载体(Clontech)，去除载体本身的多克隆位点，凝胶回收载体骨架片段，4℃过夜连接，得到重组载体pDsRed1-B2；

上述两个载体的AgeI/HindIII双酶切鉴定如图4-a所示，其中1泳道为阴性对照，即AgeI/HindIII双酶切质粒pEGFP-C1，可切出3900bp和800bp两条带，而泳道2和3分别是AgeI/HindIII双酶切质粒pEGFP-B2和pDsRed1-C1，由于去除了含有HindIII的多克隆位点，故只能切出长度约为4700bp单一条带；

然后通过AseI酶切位点将扩增的attB序列片段克隆入pEGFP-B2载体获得pAttB-eGFP载体；酶切鉴定如图4-b所示：在AseI识别位点两侧设计一对检测引物TaseI F和TaseI R，泳道2为阴性对照pEGFP-C1，PCR产物为135bp，泳道1为pAttB-EGFP，PCR产物为432bp；对AseI单酶切位点***序列鉴定的检测引物如下：

TaseI F：cttttgctca catgttcttt cc

TaseI R：tgtaacgcgg aactccatat a

通过NheI/AgeI酶切位点将扩增的LoxP2序列片段克隆入pAttB-eGFP载体获得pAttB-Loxp2-eGFP载体；

5)通过PCR方法从载体pEGFP-C1上的扩增KanR/neoR完整表达元件(包含KanR/neoR基因开放阅读框，表达KanR基因的原核启动子、表达neoR基因的SV40早期启动子及HSV TK polyA终止子)；扩增所采用的引物对如下：

Kneo F：ggactagtgc gtcaggtggc acttttcg

Kneo R：agccttaagc cccgacgttg gctg

然后通过SpeI/AflII酶切位点，将KanR/neoR表达元件克隆入pAttB-Loxp2-eGFP载体中得到pAL2G-neo载体；酶切鉴定如图4-c所示：得到5091bp和1745bp两条带；

对载体pEGFP-C1上的Sv40pA终止子进行扩增，再通过AflII/NotI酶切位点将Sv40pA终止子克隆入pAL2G-neo载体，得到pAL2G-neopA载体；

6)用MluI/EcoO109I分别双酶切MCS序列片段和pAL2G-neopA载体，去除载体pAL2G-neopA上两个LoxP序列外侧的KanR/neoR表达元件(即骨架载体pEGFP-C1上自带的KanR/neoR表达元件)，凝胶回收酶切后的片段，然后将回收的片段连接(4℃过夜)后得到pANG-MCS载体；

7)PCR的方法从载体pDsRed1-B2上扩增DsRed1开放阅读框及其终止子，扩增采用的引物如下：

DsRedpA F：ataggcgcgc caccatggtg cg

DsRedpA R：ccggactagt cattgatgag tttggacaaa ccac

然后通过AscI/SpeI酶切位点将DsRed1开放阅读框及其终止子序列克隆入pANG-MCS载体，得到基于假attP位点整合的通用型表达载体pARNG。

对于所构建的表达载体pARNG进行以下酶切鉴定：

AscI/SpeI双酶切鉴定结果如图5-a所示，其中，泳道1为AscI/SpeI双酶切鉴定载体pARNG，得到约5000bp和900bp两条带，泳道2为AscI单酶切鉴定载体pARNG，得到长度为5918bp的单一条带。

图5-b所示的鉴定结果，其中，泳道1、2为未处理质粒pARNG作为阴性对照，泳道3为AscI单酶切线性化载体pARNG作为阳性对照，得到5918bp单一条带；泳道4为AseI单酶切载体pARNG，得到5621bp和297bp两条带，证明attB成功连接到载体pARNG的AseI位点；泳道5-17分别为MCS识别位点的单酶切，均得到5918bp单一条带，证明载体pARNG多克隆位点中13个限制性内切酶识别位点均是唯一的。

所构建的通用型表达载体pARNG其***构成图如图3所示，其中包括attB序列、pUC ori(pUC ori是质粒的复制原点，为了质粒能在细菌里复制扩增，来源于pEGFP-C1载体)和多克隆位点MCS；attB序列在链霉菌噬菌体φC31整合酶的介导下可与真核细胞基因组中假attP位点(pseudo attP)发生同源重组，从而使得载体pARNG位点特异性地整合入真核细胞基因组中的转录活跃区，有利于转基因持续高效表达；多克隆位点MCS包含13个唯一的限制性内切酶识别位点，用于目的基因元件的克隆；

同时还设有用于MCS位点***序列测序的测序引物EGFP-C for primer和pUC ori rev primer；

CMV组成型启动子(来源于pEGFP-C1载体)与attB序列相连接，CMV组成型启动子下游***两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框(eGFP)及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框(DsRed)及其终止子和KanR/neoR表达元件，同时还设有一个阻止CMV组成型启动子对第一荧光指示蛋白泄漏表达的Sv40终止子；两个LoxP元件的设计是为了在药物压力下进行阳性细胞的筛选，并在筛选成功后通过Cre重组酶进行切除，去掉抗生素筛选标记，并使得CMV启动子和eGFP基因拼接，转换为绿色荧光蛋白作为指示标记：

表达载体通过attB序列整合到真核细胞基因组假attP位点之后，经过G418药物筛选，获得既具有G418抗性又稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆；然后用Cre重组酶处理阳性细胞克隆，去除两个同向LoxP之间的抗生素筛选标记、红色荧光蛋白基因及终止子，并使得CMV启动子和eGFP基因拼接，绿色荧光蛋白得以表达，提示Cre重组酶切离成功，筛选稳定表达绿色荧光蛋白的无抗生素筛选标记的转基因细胞。

下面说明所构建的pARNG载体在筛选稳定表达绿色荧光蛋白的无抗生素筛选标记的转基因细胞的应用，具体包括通过细胞培养、转染、荧光筛选的操作。

1、基于瞬时转染细胞，对荧光标记物的检测

1)宿主细胞的准备

将HEK293细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，将接种细胞的6孔培养板放入37℃、5％CO₂培养箱中。待细胞生长至70％-90％汇合率时进行转染。

2)转染复合物的准备

a.准备6个1.5mL无菌离心管，分别加入200μl Opti-MEM培养基；

b.向离心管中分别加入Opti-MEM(1μl)、pARNG质粒载体(1μg)、pDsRed1-C1质粒载体(1μg)、pEGFP-C1质粒载体(1μg)、pARNG质粒载体(1μg)+pCAG-Cre-IP质粒载体(1μg)、pCAG-Cre-IP质粒载体(1μg)；

pCAG-Cre-IP质粒载体(Li P，Tong C，Mehrian-Shai R，Jia L，Wu N，Yan Y，Maxson RE，Schulze EN，Song H，Hsieh CL，Pera MF，Ying QL.Germlinecompetent embryonic stem cells derived from rat blastocysts.Cell.2008Dec26；135(7)：1299-310.)的加入是为了实现Cre对Loxp序列的重组剪切；

c.短暂轻柔涡旋(不超过10s)；

d.分别加入8μl X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent；

e.短暂轻柔涡旋；

f.室温(15℃-25℃)孵育15-30min。

3)将转染复合物依次逐滴加入6孔培养板的细胞中，并在6孔培养板上分别标记HEK293、pARNG、pDsRed1-C1、pEGFP-C1、pARNG+pCAG-Cre-IP、pCAG-Cre-IP；

4)孵育细胞24h后，将进行了不同重组方案的重组细胞进行以下检测：

a、将重组细胞分别倒置荧光显微镜下观测。结果如图6所示：阴性对照组HEK293在绿色和蓝色激发光下均观察不到荧光；实验组pARNG和阳性对照组pDsRed1-C1在绿色激发光下可以观察到红色荧光，而在蓝色激发光下观测不到绿色荧光；这表明此时第一荧光标记(绿色荧光)不被表达，第二荧光标记(红色荧光)表达，第二荧光标记(红色荧光)可以作为pARNG载体重组的荧光指示；

阳性对照组pEGFP-C1在绿色激发光下观测不到红色荧光表达，而在蓝色激发光下可以观测到绿色荧光，对照组pCAG-Cre-IP在被激发后均不发光；实验组pARNG+pCAG-Cre-IP在绿色激发光下观测到红色荧光表达，在蓝色激发光下观测到绿色荧光，这说明两个同向Loxp元件之间的序列已被Cre重组剪切掉，绿色荧光标记被启动子激活表达，从而观测到绿色荧光。

以上检测结果证明双荧光报告***可以作为阳性筛选和Cre酶切Loxp-抗生素元件的指示：红色荧光可以作为转染成功的标记，而绿色荧光可以作为抗生素元件被剪切的标记。

b、将重组的细胞分别用于Western Blotting检测。收集各组细胞于1mL预冷的PBS溶液中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，60μl Western及IP细胞裂解液(碧云天)重悬细胞，加入cOmplete Protease Inhibitor CocktailTablets(Roche)调整至工作浓度，冰上裂解30min，将全蛋白加入上样缓冲液，100℃变性5min，12％的SDS-PAGE凝胶电泳，然后将样品通过半干法从SDS-PAGE凝胶上转移至PVDF膜上，一抗4℃过夜孵育，洗涤，二抗孵育2.5h，洗涤后使用eECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒曝光。

二抗：HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(碧云天)，HRP-labeledGoat Anti-Rabbit IgG(H+L)(碧云天)。

Western Blotting检测结果如图7所示：以Living

DsRedPolyclonal Antibody(Clontech)作为一抗进行Western blotting检测，样品pARNG、pDsRed1-C1和pARNG+pCAG-Cre-IP检测到大小约为28KD的特异性条带，提示RFP(红色荧光蛋白)得以表达，而样品HEK293、pEGFP-C1和pCAG-Cre-IP未检测到特异条带，提示不表达RFP；

以Living

GFP Monoclonal Antibody(Clontech)作为一抗进行Western blotting检测，样品pEGFP-C 1和pARNG+pCAG-Cre-IP检测到大小约为30KD的特异性条带，提示GFP得以表达，而其他样品均未检测到特异条带，提示不表达GFP；GAPDH作为Western blot蛋白质标准化的内参。

以上Western blotting检测结果与荧光显微镜观测结果一致，双荧光报告***可以作为阳性筛选和Cre酶切Loxp-抗生素元件的指示。

c、将重组的细胞用于流式细胞检测，以胰酶消化法制备单细胞悬液，细胞计数，用于BD FACSAria流式细胞仪分析。

结果显示：图8-a样品HEK293检测不到任何荧光信号；图8-b样品pARNG只检测到红色荧光信号；图8-c样品pDsRed1-C1只检测到红色荧光信号；图8-d样品pEGFP-C1只检测到绿色荧光信号；图8-e样品pARNG+pCAG-Cre-IP可检测到少量红色荧光信号和大量绿色荧光信号；图8-f样品pCAG-Cre-IP检测不到任何荧光信号。流式细胞分析结论与荧光显微镜观测结果及Western Blotting检测结果一致。

以上检测结果证明双荧光报告***可以作为阳性筛选和Cre切除Loxp-抗生素元件的指示。

2、稳定表达绿色荧光蛋白的无抗生素筛选标记的转基因细胞的筛选：

1)G418最小致死浓度的测定：在牛胎儿成纤维细胞(宿主细胞)的培养液(含血清的DMEM细胞培养液)中分别加入不同浓度梯度的G418筛选12天，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≥600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。

2)细胞转染及筛选：

待宿主细胞生长至70％-90％汇合率，使用X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂，对宿主细胞进行pARNG表达载体的转染；

由于通用型表达载体pARNG包含G418抗性基因neoR，整合到基因组上的neoR基因的阳性细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会被该药物杀死。

通用型表达载体pARNG转染牛胎儿成纤维细胞24h后在含血清的DMEM细胞培养液中添加终浓度为最小致死浓度(600μg/ml)的G418进行筛选；以未转染的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418。

转染细胞G418筛选12d后，对照组的细胞全部死亡；对表现为G418抗性的转染阳性重组细胞在荧光显微镜下进行观测，观察第二荧光指示蛋白RFP是否表达。对既具有G418抗性又稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆，将培养基的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，然后用胰酶-EDTA消化细胞，再添加不加抗生素的DMEM细胞培养液扩大培养。

3)Cre重组酶处理：

将既具有G418抗性又稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，将接种细胞的6孔培养板放入37℃、5％CO₂培养箱中。待细胞生长至70％-90％汇合率时进行Cre重组酶处理。

3.1Cre质粒转染筛选法：

a.准备1.5mL无菌离心管，加入200μl Opti-MEM培养基；

b.向离心管中加入pCAG-Cre-IP质粒载体(2μg)；

c.短暂轻柔涡旋(不超过10s)；

d.分别加入8μl X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent；

e.短暂轻柔涡旋；

f.室温(15℃-25℃)孵育15-30min。

g.将转染复合物逐滴加入6孔培养板的细胞中；

h.孵育细胞24h后，得到重组的无抗生素标记的细胞。

i.将重组细胞倒置荧光显微镜下观测，筛选绿色荧光表达的重组细胞；

j.将重组的细胞用于Western Blotting检测，筛选绿色荧光表达的重组细胞；

k.将重组的细胞用于流式细胞分选绿色荧光表达的重组细胞，并最终得到无抗生素筛选标记的阳性细胞。

3.2Cre蛋白转导法：

为了避免Cre处理步骤中，表达Cre重组酶的质粒载体随机整合到阳性细胞基因组中，带来不必要的风险，可使用连接有穿膜肽的Cre重组酶加入DMEM细胞培养液中，孵育24h，然后进行绿色荧光蛋白的观察检测和流式细胞分选，最终得到无抗生素筛选标记的阳性细胞。

Claims (10)

1.一种基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，包括attB序列、pUC ori和多克隆位点MCS，CMV组成型启动子与attB序列相连接，CMV组成型启动子下游***两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。

2.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的attB序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的CMV组成型启动子为Pcmv IE启动子。

3.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的多克隆位点MCS包括以下限制性内切酶识别位点：

MluI、BamHI、PacI、PspOMI、SacI、FseI、AclI、XhoI、PvuI、KpnI、HindIII、BglII和EcoRI。

4.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

5.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的第一荧光指示蛋白开放阅读框为绿色荧光蛋白eGFP开放阅读框，第二荧光指示蛋白开放阅读框为红色荧光蛋白DsRed开放阅读框，其终止子均为Sv40终止子。

6.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选元件为KanR/neoR表达元件，两个LoxP元件之间以还设有一个阻止CMV组成型启动子对第一荧光指示蛋白泄漏表达的Sv40终止子。

7.一种基于假attP位点整合的通用型表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.1所示的两端含有AseI酶切位点及保护碱基的attB序列；

2)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.2所示的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点的LoxP2序列；

3)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.3所示的包含多个克隆位点的MCS序列；

4)用BamHI/BglII双酶切pEGFP-C1载体，凝胶回收载体骨架片段并连接后，获得pEGFP-B2载体；

通过AseI酶切位点将attB序列克隆入pEGFP-B2载体获得pAttB-eGFP载体；

通过NheI/AgeI酶切位点将LoxP2序列克隆入pAttB-eGFP载体获得pAttB-Loxp2-eGFP载体；

5)通过SpeI/AflII酶切位点，将包含KanR/neoR基因开放阅读框、表达KanR基因的原核启动子、表达neoR基因的SV40早期启动子及HSV TKpolyA终止子的KanR/neoR表达元件，克隆入pAttB-Loxp2-eGFP载体中得到pAL2G-neo载体；

然后再通过AflII/NotI酶切位点将Sv40pA终止子克隆入pAL2G-neo载体，得到pAL2G-neopA载体；

6)用MluI/EcoO109I分别双酶切MCS序列和pAL2G-neopA载体，凝胶回收酶切后的片段，然后将回收的片段连接后得到pANG-MCS载体；

7)通过AscI/SpeI酶切位点将DsRed1开放阅读框及其终止子序列克隆入pANG-MCS载体，得到基于假attP位点整合的通用型表达载体pARNG。

8.权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体在筛选稳定表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，基于假attP位点整合的通用型表达载体在进行细胞转染之后，进行药物筛选，获得表达载体稳定转染的重组细胞；然后对其进行Cre重组剪切LoxP序列的处理，筛选稳定表达第一荧光蛋白的重组细胞，获得表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的Cre重组剪切LoxP序列的处理为：

对药物筛选后的重组细胞进行包含Cre元件的表达载体的转染，或者将其在含有连接有穿膜肽的Cre重组酶的环境中进行孵育。

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