CN102827873A - 一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白。Cre融合蛋白功能检测细胞，宿主细胞为HEK293细胞，将pAcmv-stop-EGFP载体和phiC31整合酶共转染宿主细胞。通过phiC31整合酶的作用，使得携带检测Cre重组酶功能的LoxP元件的载体以单拷贝的形式整合到HEK293细胞系的假attP位点，为研究Cre融合蛋白穿膜效率和生物活性提供稳定可靠的细胞模型。经TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白HNTC，其穿膜效率高、生物活性好，可有效地作为哺乳动物细胞染色体水平上基因操作的工具。

Description

一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白

技术领域

本发明属于重组功能检测细胞技术领域，涉及一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白。 

背景技术

Cre属于重组酶家族，它是来源于P1噬菌体，能够作用于哺乳动物细胞引起DNA序列特异性重组蛋白（Nagy A:Cre recombinase:the universal reagent for genome tailoring.Genesis 2000,26:99-109）,它是由P1噬菌体编码的大小为38kD的蛋白,能识别34bp大小的loxp位点。重组酶对底物的构形要求不严格，可以是超螺旋DNA，也可以是线性DNA。在Cre酶的作用下，两个同向loxp位点之间的DNA片段将会被删除;两个反向loxp位点之间的DNA将会发生翻转(Hoess R H,Abremski K.Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre lox site specific recombination system[J].MolBiol,1985,181(3):351-362.)Cre酶介导的遗传重组可进行定点、定时、定组织的特异性控制。该***于1981年被首次发现，1993年被Gu等（Gu H,Zou Y R,Rajewsky K.Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-LoxP-mediated gene targeting[J].Cell,1993,73(6):1155-1164.）研究人员正式作为一种基因操作手段应用以来已广泛地应用于基因克隆、基因捕获、基因整合、基因删除等研究领域并体现出巨大优势。 

Cre重组酶通过对DNA进行准确切割和重新连接，能够介导靶DNA发生包括倒位、易位、切离或整合等形式的重排，从而使得在染色体水平对真核生物基因组进行遗传改造，以及对转基因动物和植物中转基因的表达进行有效的控制成为可能。该***目前已成为在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的定点整合、基因捕获以及染色体工程等方面进行研究的有 力工具，并在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面得到广泛的应用。 

因此，有必要构建一种哺乳动物细胞检测细胞系。目前用于构建的检测cre/loxp***效率的元件，多为将一个组成型启动子和一种报告基因中间用多个顺式串联的转录终止子阻断，终止子两侧有两个同向LoxP，然后通过细胞转染或者病毒转导等方式，随机整合（或其他方法）或定点打靶到哺乳动物细胞基因组上。但是，这种随机整合（或其他方法）可能产生以下情况：1.***突变：病毒载体介导的整合容易导致***突变引起细胞建系失败；2.基因沉默：而非病毒载体的随机整合也容易整合到异染色质区，引起转基因沉默，使得新建立的细胞系无法正常表达报告基因，而不能正常指示cre切割效率；3.非单拷贝整合：在排除前两种情况的前提下，假定非病毒载体随机整合位点均位于转录活跃区，如果发生了非单拷贝整合，除了可能影响细胞正常生长外，多余的LoxP序列也会影响到Cre重组酶功能的验证。 

而在哺乳动物细胞中，链霉菌噬菌体c31整合酶被证明是可以与基因组DNA中特异性序列（即假attP位点）进行反应的整合酶，它可以将外源基因稳定地整合到哺乳动物细胞基因组的那些特定的序列上，其偏向于以单拷贝整合到基因组转录活跃区，从而极大降低了外源基因随机***造成的基因突变风险。已被发现的c31整合酶识别的细胞基因组特异性位点有一百多个，对整合位点的生物信息学分析表明它们有较好的安全性（T.W.Chalberg,et al.Integration specificity of phiC31 integrase in the human genome.J Mol Biol.2006.357.28-48），提示其作为在哺乳动物细胞中进行基因操作和基因治疗的一个有用的工具，适合用于验证Cre穿膜肽效率细胞系的构建，即介导含有验证元件的载体以单拷贝的形式整合到哺乳动物基因组转录活跃区，从而正常行使其验证Cre融合蛋白穿膜能力和生物学活性的功能。 

发明内容

本发明解决的问题在于一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白，以验证Cre融合蛋白的穿膜效率和生物活性，从而优化Cre融合蛋白在相关基因工程领域的应用。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

一种Cre融合蛋白功能检测载体，包括Pcmv IE启动子，在Pcmv IE启动子的上游设有attB序列，Pcmv IE启动子的下游设有两个同向的Loxp序列，两个同向的Loxp序列之间依次设有BGH终止子、BGH终止子和SV40A终止子，Loxp序列的下游设有荧光标记基因及抗生素筛选基因；当Loxp序列及其之间的三个终止子在Cre重组酶作用下剪切后，Pcmv IE启动子和荧光标记基因拼接，启动荧光标记基因的表达。 

所述的载体为pAcmv-stop-EGFP，包括以下元件及连接顺序：attB序列-Pcmv IE启动子-Loxp序列-BGH终止子-BGH终止子-SV40A终止子-Loxp序列-荧光标记基因-抗生素筛选基因； 

所述的荧光标记基因为EGFP基因阅读框，抗生素筛选基因为neo，该载体称为载体。 

所述pAcmv-stop-EGFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。 

一种Cre融合蛋白功能检测细胞，宿主细胞为HEK293细胞，将pAcmv-stop-EGFP载体和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染宿主细胞；利用G418抗性筛选阳性转染的重组细胞，并筛选其中attB-CMV-stop-EGFP表达载体以单拷贝的形式整合入宿主细胞假attP位点的细胞。 

所述的Cre融合蛋白功能检测细胞在检测Cre融合蛋白剪切活性中的应用。 

所述的Cre融合蛋白是具有蛋白转导功能的穿膜肽和核定位信号修饰的Cre融合蛋白。 

一种经TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白，从N端开始分别为6×His 区域、NLS多肽区域、TAT多肽区域和Cre酶区域；其中NLS多肽区域的氨基酸残基的序列为：Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，AT多肽区域的氨基酸残基的序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。 

所述的TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白的制备方法，具体步骤如下： 

1）PCR扩增得到带有SacI和XhoI识别序列的Cre核苷酸序列，将扩增产物经过SacI和XhoI酶切后，回收连接到同样经过SacI和XhoI酶切的原核表达载体pET28a(+)上，得到pET28a-Cre重组质粒； 

2）由引物退火产生带有NdeI和SacI识别序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列，并将其连接到经过NdeI和SacI酶切的pET28a-Cre重组质粒，得到pET28a-HNTC重组质粒； 

3）将pET28a-HNTC重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，挑选5-8个阳性的菌落接种在卡那霉素抗性的LB培养基中，在16～22℃用0.2mM IPTG诱导表达Cre融合蛋白； 

4）诱导表达蛋白的细菌经过超声波破碎菌体，释放出融合蛋白后，经过Ni离子螯合的亲和层吸柱纯化，得到纯化后的蛋白。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明提供的Cre融合蛋白功能检测载体及细胞排除了：1.***突变：病毒载体介导的整合容易导致***突变引起细胞建系失败；2.基因沉默：而非病毒载体的随机整合也容易整合到异染色质区，引起转基因沉默，使得新建立的细胞系无法正常表达报告基因，而不能正常指示cre切割效率；3.非单拷贝整合：在排除前两种情况的前提下，假定非病毒载体随机整合位点均位于转录活跃区，如果发生了非单拷贝整合，除了可能影响细胞正常生长外，多余的LoxP序列也会影响到Cre重组酶功能的验证。 

本发明提供的筛选得到的经TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白 HNTC，其穿膜效率高、生物活性好，可有效地作为哺乳动物细胞染色体水平上基因操作的工具。 

附图说明

图1是Cre重组酶功能验证细胞系构建示意图及其工作原理； 

图2是在细胞水平上验证载体pACMV-stop-EGFP功能； 

图3-1为平均Ct值对样品拷贝数的对数(log₂N)作图得到绝对定量标准曲线； 

图3-2为特异性扩增引物TGFP的溶解曲线分析结果； 

图4-1～4-2为对检测细胞系293-C31-L2GFP功能验证； 

图5-1～5-5为Cre融合蛋白的表达纯化。其中图5-1为TAT和NLS修饰的不同组合的Cre融合蛋白示意图；图5-2为制备不同修饰的Cre融合蛋白原核表达载体酶切鉴定图；图5-3为以融合蛋白His-NLS-TAT-Cre（HNTC）为例的蛋白纯化结果过程；图5-4为各种cre融合蛋白的SDS-PAGE检测结果；图5-5为利用cre重组酶的专一性抗体的免疫印迹结果。 

图6-1为显微镜观察不同修饰Cre重组蛋白对细胞系293-C31-L2GFP作用表达荧光情况； 

图6-2为流式细胞术定量检测不同修饰Cre融合蛋白的重组效率。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

1.Cre重组酶功能验证细胞系293-C31-L2GFP的建立及功能验证 

1.1载体pACMV-stop-EGFP的构建 

用于建立检测cre重组酶活性细胞系的载体pACMV-stop-EGFP构建过程如下： 

以载体pcdna3.1（+）(Invitrogen公司)为模板，通过PCR方法扩增得到 两段BGH终止子序列，其中一段带有AscI和SpeI酶切位点的片段P1，其扩增引物为： 

上游引物:TTGGCGCGCCACCCGCTGATCAG； 

下游引物：CCGGACTAGTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGCC； 

另一段带有SpeI和AflII酶切位点的片段P2，其扩增引物为： 

上游引物：GGACTAGTACCCGCTGATCAGCC； 

下游引物：AGACTTAAGTGGTTCTTTCCGCCTC； 

以载体pEGFP-C1为模板，通过PCR方法扩增得两端为AflII和NotI酶切位点的SV40A终止子序列P3，其扩增引物为： 

上游引物：CCATCTTAAGTGATCATAATCAGCCATACCAC； 

下游引物：AGACTGCGGCCGCTAAGATACATTG。 

将以上所扩增的三个终止子同向顺次克隆入载体pAttB-LoxP2-eGFP中两个同向LoxP序列间的相应多克隆位点，得到载体pACMV-stop-EGFP。其质粒图谱如图1所示，attB序列位于Pcmv启动子的上游，Pcmv启动子的下游设有两个同向的Loxp序列，两个同向的Loxp序列之间依次设有BGH终止子、BGH终止子和SV40A终止子，Loxp序列的下游设有荧光标记基因EGFP及抗生素筛选基因neo。元件连接顺序为attB序列-Pcmv IE-Loxp序列-BGH终止子-BGH终止子-SV40A终止子-Loxp序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。 

1.2载体pACMV-stop-EGFP功能验证 

按表1分组转染HEK293细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），从细胞水平上验证载体pACMV-stop-EGFP荧光报告功能。 

表1不同载体的分组转染 

以上各组质粒用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent试剂盒（Roche公司）瞬时转染HEK293细胞系，24h后在倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti）下观察各实验组荧光表达情况。检测结果如图2所示，BLK为用H₂O代替质粒作为阴性对照进行转染，结果在蓝光（波长420～485nm）激发下并未观察到荧光；pAcmv-stop-EGFP和pCAG-Cre-IP质粒单独转染组在蓝光激发下并未观察到绿色荧光，这表明表明3×polyA终止子顺式连接构成的stop cassette起到终止Pcmv IE启动子对EGFP基因的转录，此外pCAG-Cre-IP也不会表达绿色荧光蛋白；而pAcmv-stop-EGFP与pCAG-Cre-IP质粒共转染组在蓝光激发下可观察到较强的绿色荧光信号，提示Cre重组酶表达后对pAcmv-stop-EGFP载体上两个LoxP序列之间的stop cassette进行剪切，使得Pcmv IE启动子和EGFP基因阅读框拼接，从而大量表达绿色荧光蛋白（参见图1所示的剪切过程）。这表明载体pAcmv-stop-EGFP中的验证Cre活性的检测元件可用于后续检测。 

1.3细胞系293-C31-L2GFP的建立 

1）G418最小致死浓度的测定：在HEK293细胞（宿主细胞）的培养液（含血清的DMEM细胞培养液）中分别加入不同浓度梯度的G418筛选8天，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≥600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。 

2）细胞转染及筛选： 

待宿主细胞生长至70%-90%汇合率，使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂，对宿主细胞进行cre功能检测质粒pACMV-stop-EGFP和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染； 

由于cre功能检测质粒pACMV-stop-EGFP包含G418抗性基因neoR，整合到基因组上的neoR基因的阳性细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会被该药物杀死。 

转染HEK293细胞系36h后在含血清的DMEM细胞培养液中添加终浓度为最小致死浓度（600μg/ml）的G418进行筛选；以未转染的HEK293细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418。 

转染细胞G418筛选8d后，对照组的细胞全部死亡；对表现为G418抗性的转染阳性重组细胞将培养基的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，然后用胰酶-EDTA消化细胞，再添加不加抗生素的DMEM细胞培养液扩大培养。 

1.4重组细胞的拷贝数鉴定（基于实时定量PCR技术的绝对定量法） 

1）标准品制备 

①实时荧光定量PCR.采用20μl PCR的反应体系(SYBR Premix Ex Taq^TM，TaKaRa)和条件按StepOne plus荧光定量PCR（ABI公司）使用手册设置，95℃10s；95℃5s，60℃30s(40个循环)；95℃15s,60℃30s,95℃15s.反应体系在96孔板(BIOplastics EU 0.2mL Thin-wall 8-tube strip)中混匀并用超净光盖(BIOplastics EU Optical Wide area 8-cap strip)封口.反应结果使用StepOne Software v2.1收集、分析.所有的样品都在同一块板中做3次重复，取均值。 

②标准曲线的建立.按照P.Song（SONG P，CA I C Q,SKOKUTM,et al.Qurntitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number inWH ISKERSTM-derived transgenic maize[J].Plant Cell Rep,2002,20(10):948-954.）构建标准品的方法，将含外源基因的质粒pACMV-stop-EGFP与HEK293细胞基因组DNA混合，设置含有0.5、1、2、4、8和16个转基因拷贝数的标准品对照，具体如下：假设含有转基因片段 的质粒大小为a bp，HEK293细胞基因组DNA用量为b ng，转基因片段完全随机地头尾相连(或头头相连)***一条染色体上，由于人基因组DNA单倍体(haploid)大小为3×10⁹bp，那么b ng的转基因阳性HEK293细胞基因组DNA含有一个转基因拷贝的质量为： 

$\frac{a\×b\×0.5}{3\×{10}^9}\mathrm{ng}.$

具体的是以引物TGFP扩增GFP基因片段，TGFP引物序列为（扩增产物为129bp）： 

上游引物：CGACGGCAACTACAAGAC； 

下游引物：TAGTTGTACTCCAGCTTGTGC。 

2）外源基因拷贝数的检测结果 

①绝对定量标准曲线.为了确定Real-timePCR扩增中Ct值与初始拷贝数N的关系，将转基因质粒与野生型HEK293细胞基因组DNA混和，设置了分别含有0.5、1、2、4、8、16个拷贝的标准品对照，以引物TGFP扩增外源基因片段(129bp)，取平均Ct值，将平均Ct值对样品拷贝数的对数(log₂N)作图得到绝对定量标准曲线(图3-1)，定量方程计算公式为：log2N=-1.3448Ct+37.548，决定系数R²=0.9987，表明标准品制备成功。为了评估反应的特异性并鉴定产物，在扩增后进行了融解曲线分析(图3-2).大约88℃附近有且只有一个单峰，引物扩增的特异性非常好。 

②转基因拷贝数的鉴定.分别取不同重组的HEK293细胞克隆进行实时定量PCR，扩增GFP基因，并进行3次重复实验，数值以 

(平均值±标准差)表示。Real-time PCR对重组HEK293细胞克隆鉴定结果标准差在0.06到0.11之间，表明结果准确可信，结果为：重组细胞2号和5号克隆为单拷贝整合；1号、4号和6号为两个拷贝整合；3号克隆为3个拷贝的整合。 

1.5半巢式反向PCR鉴定整合位点 

鉴于以上分析结果，取单拷贝整合的2号克隆和5号克隆进行整合 位点分析。 

10μg基因组DNA用同尾酶NheI和SpeI 37℃过夜消化。在乙醇沉淀、苯酚/氯仿抽提后，消化过的基因组DNA用1000单位T4-DNA连接酶（NEB公司）4℃过夜连接。连接产物经过乙醇沉淀、苯酚/氯仿抽提后，溶于20μl TE buffer制成模板。 

以制得的模板用引物HNIF1：CCCATAGTAACGCCAATA（上游）和HNIR：CGATGTAGGTCACGGTCT（下游）进行第一轮PCR，按以下条件进行：94℃5min，1个循环；94℃，30s、51-61℃45s、72℃5min，30个循环；72℃，10min，1个循环，得到第一轮PCR产物。 

1μl第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板，用引物HNIF2：TAGCGGTTTGACTCACG (上游)和HNIR：CGATGTAGGTCACGGTCT（下游）进行扩增，按以下反应：94℃5min，一个循环；94℃，30s、50-60℃45s、72℃5min，三十个循环；72℃，10min。 

第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收连接pMD9-T载体送测序。测序结果在NCBI上进行BLAST分析。 

BLAST结果显示，在2号重组细胞中，整合事件发生在第10号染色体上（图4-1），位于INPP5A基因内；而在5号重组细胞中，整合事件发生在22号常染色体上（图4-2），位于CRYBA4基因和MN1基因之间的间隔序列，且都距离大于300kb符合假attP位点特征。 

综合以上，将以单拷贝形式整合到HEK293细胞基因组假attP位点的重组细胞5号克隆命名为293-C31-L2GFP进行后续试验。 

1.6检测细胞系293-C31-L2GFP功能验证： 

1）宿主细胞的准备 

将HEK293细胞系细胞分别接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，将接种细胞的35mm培养皿放入37℃、5%CO₂培养箱中。待细胞生长 至70%-90%汇合率时进行转染。 

2）转染复合物的准备 

a.准备2个1.5mL无菌离心管，分别加入200μl Opti-MEM培养基； 

b.向离心管中分别加入Opti-MEM(1μl)、pCAG-Cre-IP质粒载体(1μg)pCAG-Cre-IP质粒载体的加入是为了实现Cre对Loxp序列的重组剪切； 

c.短暂轻柔涡旋（不超过10s）； 

d.分别加入8μl X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent； 

e.短暂轻柔涡旋； 

f.室温（15℃-25℃）孵育15-30min。 

3）将转染复合物依次逐滴加入35mm培养皿的HEK293细胞中，并在培养皿上分别标记“HEK293”和“HEK293+CrePL”。 

4）同样的方法对细胞系293-C31-L2GFP进行瞬时转染，对应细胞培养皿上标记“293-C31-L2GFP”和“293-C31-L2GFP+CrePL”。 

5）孵育细胞36h后，将进行了不同重组方案的重组细胞在倒置荧光显微镜下观测，结果如图4-2所示。 

荧光显微镜观测结果表明：a.293-C31-L2GFP细胞本身在倒置荧光显微镜蓝光激发下不显示任何荧光；而在经过表达Cre重组酶质粒pCAG-Cre-IP瞬时转染后，Cre重组酶介导切除两个同向LoxP之间的Stop Cassette，使CMV启动子和EGFP阅读框拼接，表达绿色荧光蛋白，因此在荧光显微镜下通过蓝光激发下可以观测到绿色荧光。以上结果证明细胞系293-C31-L2GFP可以用来验证Cre重组酶活性的功能。 

2.基于TAT和NLS修饰的Cre融合蛋白表达、纯化和功能验证 

HIV-1病毒TAT蛋白的47-57位氨基酸组成的多肽（TAT，氨基酸序列为YGRKKRRQRRR），可形成与目的基因融合的蛋白产物，直接转移进入细胞的蛋白转导技术。 

核定位信号(nuclear localization signal,NLS)是一种存在于细胞内许多蛋白质中、并介导蛋白质由细胞质向细胞核内转运的氨基酸序列，其中存在于猿猴病毒40(SV40)的大T抗原中,是一个包含7个氨基酸的短肽（NLS，氨基酸序列为PKKKRKV）。 

TAT或NLS可用于构成cre穿膜肽，其作用分别是介导cre融合蛋白有效地穿过细胞膜和把进入细胞质的cre融合蛋白递送到细胞核，识别染色体上的LoxP靶序列从而发生功能。这种蛋白转导技术因为转移一个瞬时存在的、进入细胞中可降解的活性蛋白形式，因而极大的降低了其他基因转移途径的不利方面。而融合蛋白功能与其高级构象的密切相关，且很难仅凭经验从蛋白质序列预测不同构象的cre穿膜肽在哺乳动物细胞中的穿膜效率和生物活性，所以有必要比较一下各种TAT、NLS修饰的Cre融合蛋白的功能，从而筛选出一种效率最高、活性最好的cre融合蛋白。 

2.1各种基于TAT和NLS修饰的Cre融合蛋白表达和纯化 

考虑到各种cre融合蛋白的表达纯化的需要，采用基本相同的亲和层析方法，所以设置6个组氨酸的标签。按照TAT、NLS与Cre不同的排列组合设计了其不同的修饰方案，具体如图5-1所示，其中：H为6×His，N为NLS，T为TAT，C为Cre酶；在明确其修饰方案后通过各个表达元件的剪切拼接即可完成修饰。下面主要其中一种HNTC（其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示）修饰为例说明其元件的拼接制备方案。 

以质粒pCAG-Cre-IP（Li P，Tong C,Mehrian-Shai R,Jia L,Wu N,Yan Y，Maxson RE,Schulze EN,Song H,Hsieh CL,Pera MF,Ying QL.Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts.Cell.2008 Dec 26;135(7):1299-310）为模板，扩增Cre的pcr扩增反应的条件：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟30秒；引物序列如下： 

Cresx F：TTC ATGTCCAATTTACTGACCG 

Cresx R：CCG 

CTAATCGCCATCTTC 

引物中5’端分别含有SacI和XhoI酶切位点，其后分别为目的基因cre重组酶5‘端和3‘端序列，在50μl的反应体系中含有50mmol/L KCL,10mmol/L Tris-CL,(pH8.5),1,5mmol/L MgCl2,200μmol/L dntp,10pmol引物，1U的LATaq DNA聚合酶（TaKaRa公司产品）。在Veriti 96-well Thermal Cycler(ABI公司)PCR仪上按以下条件反应30个循环：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟30秒。 

扩增产物用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒纯化，用限制性内切酶SacI和XhoI分别对扩增的PCR产物和质粒pET-28a（+）（Novagen公司产品）进行双酶切消化后，分别回收DNA片段，用TaKaRa公司的DNA连接试剂盒连接到表达载体质粒pET-28a（+），16℃连接16小时后，连接产物用转化大肠杆菌DH5a，在卡那霉素（终浓度为50μg/mL）的LB培养基的平板过夜后，对筛选的阳性克隆酶切鉴定后，并进行测序，得到pET28a-Cre重组质粒。 

带有NdeI和SacI识别序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列由引物退火产生，直接连接到经过NdeI和SacI酶切的pET28a-Cre重组质粒，得到pET28a-HNTC重组质粒。DNA序列分析结果表明PCR产物代表的翻译后的氨基酸序列与预先设定的修饰方案完全相同。然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司）。在含卡那霉素（终浓度50μg/mL）的LB液体培养基中，宿主菌BL21（pET28a-HNTC）在37℃培养至对数生长期，加入IPTG到终浓度为0.2mM，18℃继续培养30小时。离心收集菌体，用超声波破菌仪破坏菌体，离心收集上清，用能与组氨酸多肽（6×HIS-Tag）结合的亲和层析柱（Novagen公司产品），得到了纯化的cre融合蛋白。经SDS-PAGE电泳，在大约38kDa处得到单一条带（图5-3）。收集纯化的蛋白样品，利用超滤柱浓缩cre融合蛋白到2mg/mL，储存在-70℃冰箱中。 

应用同样地方法，改变元件的拼接顺序就可以制备表达HTNC、HTCN、HNCT、HCNT、HCTN、HTC、HNC、HCN、HCT、WTCre融合蛋白的重组质粒pET28a-HNTC,pET28a-HTNC pET28a-HTCN,pET28a-HNCT,pET28a-HCNT,pET28a-HCTN,pET28a-HTC,pET28a-HNC,pET28a-HCN,pET28a-HCT,pET28a-WTCre；然后分别表达、纯化和浓缩得到的各种融合蛋白。 

图5-2为制备不同修饰的Cre融合蛋白原核表达载体酶切鉴定图；图5-3为以融合蛋白His-NLS-TAT-Cre（HNTC）为例的蛋白纯化结果过程；图5-4为各种cre融合蛋白的SDS-PAGE检测结果；利用cre重组酶的专一性抗体的免疫印迹结果如图5-5所示。 

2.2基于细胞系293-C31-L2GFP对以上各种Cre融合蛋白功能进行验证 

接种检测细胞系293-C31-L2GFP在含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液的12孔细胞培养板中，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。当细胞密度达到50-70%时，分别加入用0.22μm滤器过滤的各种Cre融合蛋白加入细胞培养液中共孵育3小时，PBS清洗后换上正常细胞培养液，36小时候观测。在倒置荧光显微镜下有绿色荧光细胞则定性说明纯化得到的Cre融合蛋白转导在哺乳动物细胞中的DNA重组功能（图6-1）。用胰蛋白酶-EDTA消化为单个细胞，经流式细胞仪检测有绿色荧光的细胞数目，定量检测出cre融合蛋白的活性和重组效率（图6-2），结果表明HNTC的活性最好。 

Claims (8)

1.一种Cre融合蛋白功能检测载体，其特征在于，包括Pcmv IE启动子，在Pcmv IE启动子的上游设有attB序列，Pcmv IE启动子的下游设有两个同向的Loxp序列，两个同向的Loxp序列之间依次设有BGH终止子、BGH终止子和SV40A终止子，Loxp序列的下游设有荧光标记基因及抗生素筛选基因；当Loxp序列及其之间的三个终止子在Cre重组酶作用下剪切后，Pcmv IE启动子和荧光标记基因拼接，启动荧光标记基因的表达。

2.如权利要求1所述的Cre融合蛋白功能检测载体，其特征在于，所述的载体为pAcmv-stop-EGFP，包括以下元件及连接顺序：attB序列-Pcmv IE启动子-Loxp序列-BGH终止子-BGH终止子-SV40A终止子-Loxp序列-荧光标记基因-抗生素筛选基因；

所述的荧光标记基因为EGFP基因阅读框，抗生素筛选基因为neo，该载体称为载体。

3.如权利要求1所述的Cre融合蛋白功能检测载体，其特征在于，所述pAcmv-stop-EGFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

4.一种Cre融合蛋白功能检测细胞，其特征在于，宿主细胞为HEK293细胞，将pAcmv-stop-EGFP载体和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染宿主细胞；利用G418抗性筛选阳性转染的重组细胞，并筛选其中attB-CMV-stop-EGFP表达载体以单拷贝的形式整合入宿主细胞假attP位点的细胞。

5.权利要求4所述的Cre融合蛋白功能检测细胞在检测Cre融合蛋白剪切活性中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的Cre融合蛋白是具有蛋白转导功能的穿膜肽和核定位信号修饰的Cre融合蛋白。

7.一种经TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白，其特征在于，从N端开始分别为6×His区域、NLS多肽区域、TAT多肽区域和Cre酶区域；其中NLS多肽区域的氨基酸残基的序列为：Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，AT多肽区域的氨基酸残基的序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。

8.一种权利要求7所述的TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）PCR扩增得到带有SacI和XhoI识别序列的Cre核苷酸序列，将扩增产物经过SacI和XhoI酶切后，回收连接到同样经过SacI和XhoI酶切的原核表达载体pET28a(+)上，得到pET28a-Cre重组质粒；

2）由引物退火产生带有NdeI和SacI识别序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列，并将其连接到经过NdeI和SacI酶切的pET28a-Cre重组质粒，得到pET28a-HNTC重组质粒；

3）将pET28a-HNTC重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，挑选5-8个阳性的菌落接种在卡那霉素抗性的LB培养基中，在16～22℃用0.2mMIPTG诱导表达Cre融合蛋白；

4）诱导表达蛋白的细菌经过超声波破碎菌体，释放出融合蛋白后，经过Ni离子螯合的亲和层吸柱纯化，得到纯化后的蛋白。

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