CN102851307A

CN102851307A - 在蜂房哈夫尼菌中稳定的重组表达质粒载体及其应用

Info

Publication number: CN102851307A
Application number: CN201210177392XA
Authority: CN
Inventors: 庞振华; 李乃强; 刘驰
Original assignee: JILIN CATHAY BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD; SHANDONG CATHAY BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD; SHANDONG CATHAY BIOTECHNOLOGICAL MATERIAL CO Ltd; Shanghai Cathay Industrial Biotech Ltd; Shanghai Cathay Biotechnology Research and Development Center Co Ltd; Cathay Industrial Biotech Ltd
Current assignee: Shanghai Kaisai Biotechnology Co., Ltd.; CIBT America Inc
Priority date: 2012-05-02
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: CN102851307B; CN103667167A

Abstract

本发明所公开的内容涉及到一个稳定的重组表达质粒载体，包括一段编码重组型抗毒素基因的聚核苷酸，其表达一种多肽，来中和对宿主细胞有毒的多肽，该有毒的多肽由一段编码毒素基因的聚核苷酸在宿主细胞中表达；一段编码多肽表达产物的聚核苷酸，其中，该稳定的重组表达质粒载体由在蜂房哈夫尼菌中可复制骨架质粒衍生而成。本发明所公开的内容还包括带有上述稳定的重组表达质粒的转化子，和利用该转化子制造生物基戊二胺的方法，以及按本发明所述方法制备的生物基戊二胺。本发明公开的内容还包括用上述方法制造的生物基戊二胺为原料制造的聚酰胺及含有该物质的组合物。本发明公开的内容也包括制备五亚甲基-1,5-异氰酸酯的方法，包括用本发明中的方法制备生物基戊二胺，再将生物基戊二胺转化为五亚甲基-1,5-异氰酸酯。

Description

在蜂房哈夫尼菌中稳定的重组表达质粒载体及其应用

技术领域

本申请属于分子生物学领域，具体涉及一种稳定的重组表达质粒载体及其用途。

背景技术

戊二胺是一种可用于生产多种化学品的平台化合物。自20世纪80年代以来，用生物法生产戊二胺的研究领域获得了广泛关注。在生物法中，戊二胺可以通过赖氨酸脱羧生成。目前，用生物法生产戊二胺主要采用以下两种方法：微生物发酵生产或生物体外酶催化生产。

在发酵生产赖氨酸的方法中，将赖氨酸脱羧酶基因加到赖氨酸生产菌株（如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌）中，将生物合成赖氨酸的途径进一步延伸为合成戊二胺的途径。然而，已报告的戊二胺产率低于使用相同的不含赖氨酸脱羧酶基因的菌种生产赖氨酸的产率。产率低可能是由于戊二胺对生产菌株的毒性抑制作用。

此外，可以对细菌进行改造或利用诱导来表达赖氨酸脱羧酶，用于催化生物体外的赖氨酸脱羧反应。一种方法是在未经改造的蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei，H.alvei)菌株中对染色体编码的赖氨酸脱羧酶基因进行诱导表达。然而，此种方法所报道的酶产量低。另一种方法涉及重组细菌的构建。例如，日本一些公司（JP2009028045，US7189543，CN102056889）相继报道能够过量表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌重组菌的构建，并利用全细胞或者细胞裂解液催化赖氨酸脱羧得到戊二胺。然而，大量表达对宿主细胞有毒的蛋白质使得表达质粒在几次传代后不稳定。必须在发酵液中使用抗生素以确保在培养过程中重组质粒的稳定。

抗生素的使用可能导致对抗生素有抗药性的细菌的发展，也会在环境中保持高水平的抗药性微生物。例如，见Martinez,"Environmental pollutionby antibiotics and by antibiotic resistance determinants,"EnvironmentalPollution(2009),Vol.157,Issue 11,2893–2902。由于对抗生素有抗药性的细菌对健康和生态环境的危害，抗生素的使用是不环保的。因此，我们需要一个更有效的重组质粒载体，能够在没有抗生素筛选的条件下，多次连续传代仍然保持稳定。

发明内容

详细说明

下面描述中的具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例。但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。

在本发明中所使用的氨基酸，多肽，碱基序列，核酸的缩写，是基于国际理论和应用化学联合会及国际生物联合会对生物化学命名的规定，发表在European Journal of Biochemistry 1984年第138卷第9期的“准备含碱基序列和氨基酸序列的说明书的指导”（美国专利和商标局）一文中的缩写，以及在生物技术领域中通用的缩写。

在本公开中所讨论的“核苷酸序列”，“聚核苷酸”或“DNA分子”，可能包括双链DNA（即，由正义链和反义链组成的双链DNA）或单链DNA，及其片段。在此“其片段”是指该核苷酸序列的一部分，其编码的多肽与该核苷酸序列的完整序列所编码的多肽的功能基本相同。例如，一种编码抗毒素基因的核苷酸表达可以中和毒素多肽的多肽。编码抗毒素基因的核苷酸的一个片段所表达的多肽也能中和该毒素多肽，因此与编码抗毒素基因的核苷酸的全序列所表达的多肽相比提供了大致相同的功能。同样，编码毒素基因的核苷酸的一个片段所表达的多肽与编码毒素基因的核苷酸的全序列所表达的多肽对与细胞有基本相同的毒性。

这里提到的核苷酸序列，聚核苷酸或DNA分子不仅限于功能区，可能包括至少一个表达调控区，编码区，前导序列，外显子，内含子和表达盒（见，例如Papadakis et al.,"Promoters and Control Elements：DesigningExpression Cassettes for Gene Therapy,"Current Gene Therapy(2004),4,89-113）。此外，核苷酸序列或聚核苷酸的例子可能指RNA或DNA。具有特定的氨基酸序列的多肽和具有特定的DNA序列的聚核苷酸可能包括该序列的片段、同源序列、衍生序列和突变序列。核苷酸序列或聚核苷酸的突变体（如突变DNA）的例子，包括自然发生的突变、人工突变，和/或删除，替换，添加和/或***等突变。这种突变体所编码的多肽应该理解为与未突变的原核苷酸序列编码的多肽实质上具有相同的功能。

本发明所公开的内容包括一个稳定的重组表达质粒载体，包括以下部分：

一段编码抗毒素基因的聚核苷酸，其表达一种多肽，来中和一种对宿主细胞有毒的多肽，与之对应的有毒的多肽由一段编码毒素基因的聚核苷酸在宿主细胞中表达，

一段编码多肽表达产物的聚核苷酸，其中，

该稳定的重组表达质粒载体由在宿主细胞中可复制骨架质粒衍生而成。

在一些实施例中，该毒素基因在宿主细胞的染色体基因组中编码。

在一些实施例中，该稳定的重组表达质粒载体进一步包括编码毒素基因的聚核苷酸。

在一些实施例中，该编码毒素基因的聚核苷酸和/或编码抗毒素基因的聚核苷酸是重组的。

在一些实施例中，毒素基因，抗毒素基因和编码多肽表达产物的聚核苷酸中的一个或多个基因被进一步用密码子优化技术进行优化，以在宿主细胞中对相应多肽提供更好的表达。例如，优化毒素基因可以包括DNA序列的优化，以与序列SEQ ID NO：1或SEQ ID：3相比更好地表达多肽毒素。在某些实施例中，抗毒素基因包括进一步优化的DNA序列，以与序列SEQ ID NO：2或SEQ ID：4相比更好地表达抗毒素多肽。在某些实施例中，多肽表达产物的基因包括进一步优化的DNA序列，以与序列SEQ IDNO：5或SEQ ID：6相比更好地表达多肽表达产物。

密码子优化是一种技术，其通过增加感兴趣的基因在宿主细胞内的翻译效率来得到最大限度的蛋白表达。一个物种的DNA核苷酸序列被优化成为另一个物种的DNA核苷酸序列。DNA序列被分成三个一组（密码子）。一种氨基酸的低频率密码子被宿主细胞中相同氨基酸的高频率密码子所取代。由此，优化的DNA序列在宿主细胞中的表达得到改善。例如见http://www.guptalab.org/shubhg/pdf/shubhra_codon.pdf，关于密码子优化技术介绍，在此作为参考全部纳入。

这里使用的毒素/抗毒素基因对有两个基因，其中一个是毒素基因，表达对宿主细胞有毒性的多肽，另一个是抗毒素基因，表达的多肽能够中和该毒素多肽对宿主细胞的毒性。

某些原核生物含有一个或多个染色体编码的毒素基因。某些原核生物含有编码特定毒素/抗毒素基因对的内源性质粒。（见，Wertz et al.“Chimericnature of two plasmids of Hafnia alvei encoding the bacteriocins alveicins Aand B.”Journal of Bacteriology.,(2004)186：1598-1605.）毒素/抗毒素基因对通常在维持遗传信息的稳定和应激反应中发挥作用。当细胞中有染色体或质粒编码的抗毒素基因时，抗毒素蛋白能够持续表达，中和毒素蛋白，维持细胞的存活。在某些原核生物中，抗毒素蛋白的降解速度比毒素蛋白快。如果带有抗毒素基因的质粒从细胞内丢失，已合成的毒素蛋白遗留的时间会比抗毒素蛋白长，能够杀死细胞或抑制细胞生长。因此，在保持细胞存活的前提下，带有抗毒素基因或毒素/抗毒素基因对的质粒不易丢失。

毒素/抗毒素基因对包括但不限于，abt/abi基因对，aat/aai基因对，及其片段。在某些实施例中，毒素基因包括DNA序列SEQ ID NO：1，或SEQID NO：3。在某些实施例中，抗毒素基因包括DNA序列SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：4。

这里使用的宿主菌是指可以被稳定的重组质粒载体转化的微生物。宿主菌包括，但不限于，蜂房哈夫尼菌（H.alvei）。

在某些实施例中，宿主菌天然不含有内源性质粒或消除了原有的内源性质粒。术语“消除”(cured)在此指将内源性质粒从宿主菌中消除。所得到的不含内源性质粒的宿主菌被称为“已消除的”宿主菌。

在一些实施例中，作为宿主的H.alvei菌株可以从任何已知的H.alvei株中选择。例如，无内源性质粒的H.alvei株，有pAlvA内源性质粒的H.alvei株和其质粒消除株（pAlvA-株），有pAlvB内源性质粒的H.alvei株和其质粒消除株（pAlvB-株）。

在某些实施例中，宿主菌是适合应用于工业规模或大规模生产的工业菌株。例如，工业菌株可以在发酵器中培养。培养的规模可以从几百升至几百万升。相反实验室菌株通常在几升或更小的规模中培养。在一些实施例中，工业菌株可以在相对实验室菌株更简单和更经济的培养液中生长。

多肽表达产物是由宿主菌产生的一种多肽。多肽表达产物包括但不限于，任何大肠杆菌可以生产的多肽表达产物，例如，酶（如脱羧酶，水解酶，磷酸化酶）。例如，脱羧酶为氨基酸脱羧酶。例如，脱羧酶为赖氨酸脱羧酶，酪氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，或谷氨酸脱羧酶。在一个实施例中，脱羧酶是赖氨酸脱羧酶。在另一个实施例中，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因，haldc基因或其片段。在另一个实施例中，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括DNA序列SEQ ID NO：5或SEQID NO：6。在另一个实施例中，水解酶为葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，甘露糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β-甘露糖苷酶，果糖苷酶，β-果糖苷酶，木糖苷酶，α-木糖苷酶，β-木糖苷酶，半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，乳糖酶，淀粉酶，α-淀粉酶，β-淀粉酶，芥子酶，几丁质酶，蔗糖酶，麦芽糖酶，转化酶，透明质酸酶，或神经氨酸酶。在一个优选的实施例中，编码β-半乳糖苷酶的聚核苷酸包括lacZ基因或其片段。

可复制骨架质粒可以是能够在宿主菌中复制的任何一种质粒。在一个实施例中，稳定的重组表达质粒是由一个可以在蜂房哈夫尼菌中复制的骨架质粒衍生而成的。骨架质粒包括但不限于，pUC（例如pUC18和pUC19质粒），pBR322，pACYC质粒，和它们的衍生质粒。

此处使用的，所谓重组质粒“由在宿主细胞中可复制骨架质粒衍生而成”，是指该重组质粒通过在骨架质粒中***一个或多个编码抗毒素基因的聚核苷酸，一个或多个编码毒素基因的聚核苷酸，和/或一个或多个编码多肽表达产物的聚核苷酸，和它们的任意组合来构建重组质粒。

本发明所公开的内容还包括将一个或多个在此公开的稳定的重组质粒载体转化进宿主菌而得到的转化子。

这里提到的转化子是指通过引入一个或多个稳定的重组质粒载体而改变的宿主菌。在某些实施例中，转化子是通过转化向具备感受态的宿主细胞引进重组质粒载体而获得的。

所述转化子中带有抗毒素基因或毒素/抗毒素基因对的质粒的稳定性高于同样宿主菌中不含有抗毒素基因或者毒素/抗毒素基因对的重组质粒的稳定性。

在一个实施例中，宿主菌是一株不含有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌。不含有内源性质粒的H.alvei株可以是天然没有内源性质粒的菌株，也可以如前文所述是一个质粒消除后的菌株。稳定的重组质粒载体带有一个或多个抗毒素基因，选自abi基因，aai基因，及其片段，和/或带有一个或多个毒素/抗毒素基因对，选自abt/abi基因对，aat/aai基因对及其片段。

本发明所公开的内容还包括一个生产戊二胺的方法：

1a）培养一个具有在此公开的稳定的重组表达质粒的转化子;

1b）用步骤1a中得到的菌液催化赖氨酸脱羧生成戊二胺；

1c）从步骤1b的反应液中回收戊二胺。

在此处提到的“使用步骤1a获得的菌液”可能包括对步骤1a获得的菌液的进一步处理。例如用缓冲溶液稀释菌液，或离心获得菌体、再将菌体重悬于缓冲溶液中，或将菌体裂解制得裂解液，或/和从菌体裂解液中提纯赖氨酸脱羧酶。

转化子可以在含有碳源和非碳营养源的培养基中培养。碳源包含但不限于糖（碳水化合物，如葡萄糖和果糖），油和/或脂肪，脂肪酸，和/或其衍生物。油和脂肪包括十碳以上的饱和和/或不饱和脂肪酸，如椰油，棕榈油，棕榈仁油等。脂肪酸可以是饱和和/或不饱和脂肪酸，如己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，油酸，棕榈酸，亚油酸，亚麻酸，肉豆蔻酸等。脂肪酸衍生物包括但不限于脂肪酸酯和脂肪酸盐。非碳营养源包括但不限于氮源，无机盐和其他有机营养源。

例如，培养基包含转化子可吸收的碳源，还可以包含一种或一种以上的其他营养源，如氮源、无机盐和其他有机营养源。在某些实施例中，培养基中氮源的重量百分比占0.01至0.1％。氮源包括氨，铵盐（如氯化铵，硫酸铵和磷酸铵），蛋白胨，肉类提取物，酵母提取物等。无机盐包括但不限于，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸镁，硫酸镁，氯化钠等。其他有机营养源包括，但不限于，氨基酸（如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和脯氨酸），维生素（如维生素B1，维生素B12和维生素C），等等。

菌液培养可以在任何能够让菌细胞生长的温度下进行。较适宜的温度在约20至40°C，或约35°C。培养时间可以是约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天左右。

在一个实施例中，转化子的培养基含有肽，蛋白胨，维生素（如B族维生素），微量元素（如氮，硫，镁），和矿物质。这样的培养基包括，但不限于众所周知的LB培养基（由胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl溶解于水（如蒸馏水或去离子水）制成）。

在一个实施例中，步骤1c还包括以下步骤：

1d）分离由步骤1b所得到的反应液的固体和液体部分;

1e）将步骤1d中得到的液体部分的pH调节到约14或更高;

1f）除去步骤1e中得到的液体中的水分;

1g）回收戊二胺。

在步骤1d中，分离步骤1b反应液的固液部分，可以通过传统的离心和/或过滤来实现。

在步骤1e中，步骤1d中所得的液体成分的pH值可以通过添加碱，如氢氧化钠来调节。氢氧化钠可以以固体或溶液（如水溶液）的形式来添加。

在步骤1f中，水份可以通过常压或者真空蒸馏除去。

在步骤1g中，戊二胺可以通过常压或者真空蒸馏回收。

本发明所公开的内容，还包括用在此公开的方法所制得的生物基戊二胺。

这里提到的“生物基”的化合物是指根据ASTM D6866标准被认为是生物基的化合物。所述ASTM D6866标准指美国材料试验标准协会ASTMD6866测试标准，其名称为“用放射性碳分析法测定固体、液体和气体试样生物含量的试验方法”（Standard Test Methods for Determining theBiobased Content of Solid,Liquid,and Gaseous Samples Using RadiocarbonAnalysis），ASTM D6866是工业利用碳14测定生物质含量的标准方法。

本发明所公开的内容还包括一种聚酰胺，其包括结构式1的结构：

结构式1

及其立体异构体，其中：

m=4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22；

n=4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22；

j＝约100~约1,000,000；

所述的聚酰胺由碳原子数为m的一种或多种二元胺和碳原子数为n的一种或多种二元酸聚合制得，二元胺、二元酸中的至少一种包含符合ASTMD6866标准的可再生来源的生物基碳，且该二元胺或二元酸的m或n可以相同或不同。

在一个实施例中，二元胺为生物基戊二胺，优选用本发明中所公开的方法制备的生物基戊二胺。二元酸的例子包括，但不限于：十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十六碳二元酸、十八碳二元酸，以及它们的任意组合。在某些实施例中，全部或部分的二元酸是生物基的。

在另一个实施例中，聚酰胺所含结构同上文所述，是由生物基戊二胺与一种或多种二元酸聚合制得，且优选按照本发明所提供的方法制备的生物基戊二胺；

n=4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22；

j＝约100～约100万或者j＝约1000～约10万或者j＝约1000~约1万；且

二元酸包含符合ASTM D6866标准的生物基碳。

本发明亦公开了在此公开的聚酰胺的制备方法，包括：

按照本发明所提供的方法制备生物基戊二胺，用作二元胺。

在一个实施例中，该方法进一步包括制备一种或多种生物基二元酸。

在另一个实施例中，该方法进一步包括反应生物基戊二胺和一种或多种生物基二元酸来制备聚酰胺。

本发明中所公开的内容还包括含有在此公开的一种或多种聚酰胺的组合物。

n=4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22；

二元酸包含符合ASTM D6866标准的生物基碳。

本发明亦公开了一种制备五亚甲基-1,5-异氰酸酯(1,5-diisocyanatopentane)的方法，包括：

2a）按照本发明所公开的方法制备生物基戊二胺；

2b）将步骤2a中所得到的生物基戊二胺转化为五亚甲基-1,5-异氰酸酯。

步骤2b的方法可以采用公知的二元胺转化为异氰酸酯的方法。例如传统的光气法，包括一步高温光气法，即在高温下将光气与二元胺混合制得异氰酸酯，以及由此改进的两步光气法，和用三光气代替光气的三光气法。此外还有不采用光气作为原料的方法，例如用CO₂代替光气的己二胺羰基化法：在伯胺和有机碱溶液中通入CO₂，向反应混合物中再加入适量的含磷亲电试剂，发生脱水放热反应，制得异氰酸酯。又例如，氨基甲酸酯热分解法，先用伯胺制备氨基甲酸酯，再加热分解氨基甲酸酯制得异氰酸酯。

以下结合具体的实施例对本发明做进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更、修改、或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明的涵盖范围内。此外，正如本发明所阐述的，本发明所引用的所有参考文献都是以完整形式纳入本发明中的。

附图说明

图1为例1中所述的pPlac-cadA-abtabi重组表达质粒的构建。a）使用大肠杆菌BL21染色体为模板得到的cadA的PCR产物;b）将cadA PCR产物连接到pMD18-T载体上得到的pMD18-T-cadA质粒，其中，cadA基因的5'位置有一段lacZ基因片段;c）用PCR定点诱变删除lacZ基因片段后，形成的pPlac-cadA质粒;d）用H.alvei质粒pAlvB为模板，得到的具有HindIII位点及abt/abi的PCR产物，该PCR产物随后被连接到pMD18-T载体；e）用HindIII酶切pPlac-cadA和含abt/abi片段的pMD18-T质粒，将pPlac-cadA质粒的主体和abt/abi片段连接，得到pPlac-cadA-abtabi重组表达质粒。

图2为实施例3中所述的重组菌JM109/pPlac-cadA，连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在LB和LB/AMP平板上的菌落生长状况。

图3为实施例3中所述的重组菌Ha/pPlac-cadA，连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在LB和LB/AMP平板上的菌落生长状况。

图4为实施例3中所述的重组菌Ha^c/pPlac-cadA-abtabi，连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在LB和LB/AMP平板上的菌落生长状况。

具体实施方式

实施例1-CadA重组表达质粒的构建

以大肠杆菌BL21（Biomed公司）染色体DNA为模板，用引物1和2（引物1，SEQ ID：NO 7：ATGAACGTTATTGCAATATT，引物2，SEQ ID：NO8：ACTGAAAGCTTCCACTTCCCTTGTACGAGCT）复制cadA基因（图1a）。将该PCR产物与pUC18-衍生的T载体，pMD18-T（TaKaRa公司）连接。选择cadA基因和lac启动子（Plac）同向的连接产物。产生的质粒命名为pMD18-T-cadA（图1b）。

pMD18-T-cadA所载cadA基因与其5’端的一小段lacZ基因处于同一阅读框。因此，通过定点诱变PCR删除该多余的lacZ片段。PCR反应包括：50ng质粒DNA，10pmole引物3（SEQ ID：NO 9：ATTCAATATTGCAATAACGTTCATAGCTGTTTCCTGTGTG），dNTPs（每种0.25mM），1μL Pfu DNA聚合酶（Biomed公司），1μL Taq DNA连接酶（NEB），4μL Pfu DNA聚合酶10×缓冲液，5μL Taq DNA连接酶10×缓冲液，加去离子水至总体积为50μL。热循环条件与常规PCR相同。在PCR反应结束后，加入1μL DpnI（NEB）内切酶，在37℃反应1hr。用10μL该PCR反应液转化100μL大肠杆菌BL21感受态细胞。从转化子菌落中提取质粒，用引物4（SEQ ID：NO 10：AGGAAACAGCTATGAACGTT）测序。预期质粒上cadA基因5’端的lacZ片段应被删除。经过测序验证得到的预期质粒，命名为pPlac-cadA（图1c）。

本实施例中使用的H.alvei菌株含有pAlvB内源性质粒。pAlvB质粒上的毒素/抗毒素基因对为abt/abi基因对。根据公布的pAlvB序列（GenBank：AY271829）设计引物5和6（引物5，SEQ ID：NO 11：ACTGAAAGCTTTACTTTCATCACAAGCCTCT，引物6，SEQ ID：NO 12：ACTGAAAGCTTAGATTCAGCGCGAGAGTGAT），这两个引物在片段的两端引入了一对HindIII酶切位点（图1d）。以pAlvB为模板，复制一段含有abt/abi基因的片段。将PCR产物连接到pMD18-T载体。然后将该连接产物用HindIII酶切，得到一段含有abt/abi基因的约1.8kb的片段。再将pPlac-cadA质粒也用HindIII酶切，得到一段约4.8kb的片段。最后，将pPlac-cadA片段和abt/abi片段连接在一起，形成重组表达质粒，pPlac-cadA-abtabi（图1e）。

由于本实施例中使用的H.alvei菌株含有内源性质粒，首先对该H.alvei菌株进行质粒消除，得到无内源性质粒的H.alvei株（H.alvei^c）。再将重组表达质粒pPlac-cadA-abtabi转化进H.alvei^c。这种重组表达质粒在无抗生素筛选的条件下经过5次或更多次连续传代培养仍能保持稳定。

实施例2-蜂房哈夫尼菌内源性质粒的消除

对一株带有pAlvB内源性质粒的H.alvei（Ha）做质粒消除。先用一个重组表达抗毒素的pUC衍生质粒解除宿主对pAlvB的生存依赖。使用pUC衍生的质粒作为骨架质粒，是因为它能够在H.alvei内复制，并且其拷贝数可以随培养温度升高而提高。因此，在有抗生素筛选和较高培养温度的条件下，pUC质粒在与pAlvB的竞争中处于优势，使后者易于丢失。pUC质粒上重组表达的Abi抗毒素蛋白可以中和pAlvB遗留的Abt毒素蛋白，使宿主细胞不会死亡。

以pAlvB为模板，用引物6和7（引物7，SEQ ID：NO 13：ACTGAAAGCTTTTTAATTGTGTGACCACTAT）复制abi基因。将PCR产物连接到pMD18-T载体（含有氨苄青霉素抗性基因），该连接产物被命名为pMD18-T-abi。用该质粒转化以CaCl₂法制备的H.alvei感受态细胞。H.alvei感受态细胞的制备方法与常用的E.coli感受态细胞的制备方法相同。

所得的转化子中包含两个质粒：pAlvB和pMD18-T-abi。将转化子划线于LB/AMP平板上，在40℃过夜培养。对于长出来的菌落，用引物5和6做菌落PCR。消除了pAlvB的菌落没有PCR产物。

下一步是从消除了pAlvB的H.alvei菌株中去除pMD18-T-abi质粒。将该菌株划线于不含氨苄青霉素的LB平板上，在40℃过夜培养。将长出来的菌落再次划线于不含氨苄青霉素的LB平板上，在40℃过夜培养。对长出来的菌落用引物6和7做菌落PCR。消除了pMD18-T-abi的菌落没有PCR产物。用质粒抽提试剂盒（Axygen公司）对质粒消除的菌株进行DNA提取，没有得到质粒DNA。

该质粒消除的菌株被命名为H.alvei^c（Ha^c）。

实施例3-毒素/抗毒素基因对使H.alvei中的CadA表达质粒稳定

重组质粒在宿主中的稳定性通过如下方法检测：在非选择性培养液中连续传代重组菌株，将每次培养所得的菌液进行梯度稀释，分别涂在非选择性和选择性平板上，估算和比较菌液中的总细胞数和含质粒的细胞数。

将3个重组菌株（JM109/pPlac-cadA，Ha/pPlac-cadA，Ha^c/pPlac-cadA-abtabi）的单菌落分别接种于含有氨苄青霉素的LB培养液中（JM109为E.coli JM109菌株（Biomed公司）；Ha为含有内源性质粒pAlvB的H.alvei菌株；Ha^c为消除了内源性质粒的H.alvei菌株），于35℃摇床内生长1天（种子液）。然后以0.1％的接种率接种于新鲜的无氨苄青霉素的LB培养液内。于同样温度生长1天（第1次传代）。接着用相同的接种率和相同的生长条件连续传代和培养（第2至第5次传代）。每次培养结束的菌液用无菌的0.85％氯化钠溶液进行10×梯度稀释。取5μL稀释后的样品分别点于LB平板和LB/AMP平板上。在35℃温育1天。在无氨苄青霉素的平板上可以估计菌液的细胞总数，在有氨苄青霉素的平板上可以估算菌液中带有质粒的细胞的数量（图2（JM109/pPlac-cadA），图3（Ha/pPlac-cadA），图4（Ha^c/pPlac-cadA-abtabi））。

在非选择性培养液中经过2到3次连续传代，JM109/pPlac-cadA和Ha/pPlac-cadA菌液中含有质粒的菌的比例下降到1%左右（图2和3）。与此相反，经过5次连续传代，Ha^c/pPlac-cadA-abtabi菌液中含有质粒的菌的比例仍为100％（图4）。因此，在H.alvei中，毒素/抗毒素基因使重组表达质粒在没有抗生素筛选的情况下也能保持稳定。

参考文献

本专利申请书提及的所有文件，虽仅提到其名称，却视同全文引用，纳入此申请书中。

序列表

SEQ ID：NO 1(aat gene)

>gb|AY271828.1|:385-1717 Hafnia alvei plasmid pAlvA,completesequence

1 atgagtggtg gagatggcaa gggtcacaat agtggagcac atgattccggtggcagcatt

61 aatggaactt ctgggaaagg tgggccatca agcggaggag catcagataattctgggtgg

121 agttcggaaa ataacccgtg gggcggtggt aactcgggaa tgattggtggcagtcaagga

181 ggtaacggag ctaatcatgg tggcgaaaat acatcttcta actatgggaa agatgtatca

241 cgccaaatcg gtgatgcgat agccagaaag gaaggcatca atccgaaaatattcactggg

301 tactttatcc gttcagatgg atatttgatc ggaataacgc cacttgtcag tggtgatgcc

361 tttggcgtta atcttggcct gttcaataac aatcaaaata gtagtagtga aaataaggga

421 tggaatggaa ggaatggaga tggcattaaa aatagtagcc aaggtggatggaagattaaa

481 actaatgaac ttacttcaaa ccaagtagct gctgctaaat ccgttccaga acctaaaaat

541 agtaaatatt ataagtccat gagagaagct agcgatgagg ttattaattc taatttaaac

601 caagggcatg gagttggtga ggcagctaga gctgaaagag attacagagaaaaagtaaag

661 aacgcaatca atgataatag tcccaatgtg ctacaggatg ctattaaatt tacagcagat

721 ttttataagg aagtttttaa cgcttacgga gaaaaagccg aaaaactagc caagttatta

781 gctgatcaag ctaaaggtaa aaagatccgc aatgtagaag atgcattgaa atcttatgaa

841 aaacacaagg ctaacattaa caaaaaaatc aatgcgaaag atcgcgaagctatcgccaag

901 gctttggagt ctatggatgt agaaaaagcc gcaaaaaata tatccaagttcagcaaagga

961 ctaggttggg ttggcccagc tatcgatata actgattggt ttacagaatt atacaaagca

1021 gtgaaaactg ataattggag atctctttat gttaaaactg aaactattgc agtagggcta

1081 gctgcaaccc atgtcaccgc cttagcattc agtgctgtct tgggtgggcc tataggtatt

1141 ttaggttatg gtttgattat ggctggggtt ggggcgttag ttaacgagac aatagttgac

1201 gaggcaaata aggtcattgg gatttaa

SEQ ID：NO 2(aai gene)

>gb|AY271828.1|:1734-2069 Hafnia alvei plasmid pAlvA,completesequence

1 atgacaagga aatattacat acataatatg ttttggggat actttatggc tgcttgtatt

61 ctttacgcca gttatggtga tgacgaacct aaaataattg cgctcagaat ctttggtttg

121 gctagcgcta ttctatttcc tttctctcgg tttctaatag agaaagcagc gcttagatat

181 acgaaaaaag aattttggaa aacaggtttt tttaaggatg gtgtgccaaa aacatattta

241 atgactttgt attttatttt tatttttatg acatcaattc ctattggtgt tctttctgtt

301 tgttttgaaa taaaaaatgt gaccgctaaa atatag

SEQ ID：NO 3(abt gene)

>gb|AY271829.1|:384-1566 Hafnia alvei plasmid pAlvB,completesequence

1 atgagtggtg gagacggtaa aggtcacaat agtggagcac atgattccgg tggcagcatt

61 aatggaactt cggggaaagg tggacctgat tctggtggcg gatattggga caaccatcca

121 catattacaa tcaccggtgg acgggaagta ggtcaagggg gagctggtat caactggggt

181 ggtggttctg gtcatggtaa cggcgggggc tcagttgcca tccaagaata taacacgagt

241 aaatatccta acacgggagg atttcctcct cttggagacg ctagctggct gttaaatcct

301 ccaaaatggt cggttattga agtaaaatca gaaaactcag catggcgctc ttatattact

361 catgttcaag gtcatgttta caaattgact tttgatggta cgggtaagct cattgatacc

421 gcgtatgtta attatgaacc cagtgatgat actcgttgga gcccgcttaa aagttttaaa

481 tataataaag gaaccgctga aaaacaggtt agggatgcca ttaacaatga aaaagaagca

541 gttaaggacg ctgttaaatt tactgcagac ttctataaag aggtttttaa ggtttacgga

601 gaaaaagccg agaagctcgc taagttatta gcagatcaag ctaaaggcaa aaaggttcgc

661 aacgtagaag atgccttgaa atcttatgaa aaatataaga ctaacattaa caaaaaaatc

721 aatgcgaaag atcgcgaagc tattgctaaa gccttggagt ctatggatgt aggaaaagcc

781 gcaaaaaata tagccaagtt cagtaaagga ctaggttggg ttggccctgc tatcgatata

841 actgattggt ttacagaatt atacaaggca gtggaaactg ataattggag atctttttat

901 gttaaaactg aaactattgc agtagggcta gctgcaaccc atgttgccgc cttggcattc

961 agcgctgtct tgggtgggcc tgtaggtatt ttgggttatg gtttgattat ggctggggtt

1021 ggggcgttag ttaatgagac aatagttgac gaggcaaata aggttattgg gctttaa

SEQ ID：NO 4(abi gene)

>gb|AY271829.1:1583-1918 Hafnia alvei plasmid pAlvB,completesequence

1 atgacaagga aatattatat acataatatg ttttgggggt actttatggc tgtttgtatt

61 ctttacgcca gttatgggga taacgaacct aaaataattg cgctcagaat ctttggtttg

121 gctagtgcta tcctattccc tttctctcgg tttttaatag agaaaaccgc gcttagatat

181 acgaaaaaag aattttggga aactggtttt tttaaggatg gcgtgccaaa aacatattta

241 atgactttgt atttaatttt tatttttatg acatcaattc ctataggtgt tatttctgtt

301 ttttttgaaa taaaaaatgt gaccgctaaa ttatag

SEQ ID：NO 5(E.coli gene for lysine decarboxylase(cadA))

>gi|253771435:4076771-4078918 Escherichia coli′BL21-Gold(DE3)pLysS AG′chromosome,complete genome

1 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt

61 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac

121 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat

181 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacctgccgttgtac

241 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt

301 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc

361 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt

421 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa

481 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt

541 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca

601 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgaccaacggtact

661 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt

721 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgttacgccaatc

781 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc

841 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctggccggtacat

901 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa

961 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca

1021 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaaagtgatttac

1081 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt

1141 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacaccaccacttct

1201 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaagggtaatgct

1261 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa

1321 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat

1381 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaaaaacatcgat

1441 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggggatggaaaaa

1501 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaatacctcgacgaa

1561 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt

1621 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc

1681 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc

1741 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac

1801 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg

1861 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacctcgacgaaatg

1921 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg

1981 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgcagatgctgtgt

2041 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct

2101 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa

SEQ ID：NO 6(Hafnia Alvei gene for lysine decarboxylase(haldc)

>gi|43438|emb|X03774.1|Hafnia alvei gene for lysine decarboxylase(LDC)

1 atgaatatca ttgccatcat gaacgattta agcgcttatt ttaaggaaga acccctgcgc

61 gagctgcatc aagagttaga gaaggaaggc ttccgtattg cttatcccaa agaccgcaac

121 gatctgctga agctgattga aaacaactcc cgcctgtgtg gcgtcatttt cgactgggat

181 aaatataacc tcgaactcag cgctgaaatc agcgagctca acaaactgct gccaatttat

241 gccttcgcca atacctattc gacgcttgac gtcaacatga gcgacctgcg tcttaatgtt

301 cgcttctttg aatatgcatt aggcagcgcg caagacattg ccaccaagat ccgccaaagc

361 accgatcagt atattgatac cattctgcca ccgctgacca aggcgctgtt caaatacgtc

421 aaagaagaga aatacacagt ctgtacgccg gggcatatgg gcggaactgc gttcgataaa

481 agccctgtcg gtagcctgtt ctatgatttc ttcggtgaaa acaccatgcg ttcggatatc

541 tcgatctccg tatctgagct cggatcgctg ctcgatcata gcggcccaca ccgtgacgcc

601 gaagagtata tcgcgcgcac gttcaacgcc gatcgcagct atatcgtaac caacggaaca

661 tctacggcga ataaaattgt cggcatgtat tcatctcctg ccggtgccac tattctgata

721 gaccgtaact gccataaatc attgacccat ttgatgatga tgagcaacgt tgtccccgtc

781 tatctgcgcc caacccgtaa cgcctacggc attttaggcg ggataccgca aagcgagttc

841 acccgcgcca gcattgaaga gaaagtgaaa aatacgccca atgcgacatg gccggtgcat

901 gcggtagtca ccaactctac ctatgacggc ctgttctaca ataccgaata catcaaaaac

961 acgcttgatg ttaagtcgat tcacttcgat tcggcatggg tgccttacac caacttccat

1021 ccgatttacc aaggcaaagc agggatgagc ggtgaacgtg tgccggggaa aatcatctac

1081 gagactcagt ccacccacaa actgctggcg gcattctcgc aggcatcgat gatccacgtg

1141 aaaggtgaga tcaacgaaga aaccttcaat gaagcctata tgatgcatac ctcaacatca

1201 ccgcattacg ggatcgttgc gtcgacggaa accgcggcgg ctatgatgaa gggcaacgcc

1261 ggtaagcgtt taattaacgg ttcaattgaa cgagcgatcc gcttccgtaa agagatccgc

1321 cgcttacgta cagaatctga tggctggttc tttgacgtat ggcagccgga taacattgac

1381 gaggttgctt gctggccact caatccacgt aatgaatggc atggattccc gaacatcgac

1441 aacgatcata tgtatcttga tccgatcaaa gtcactctgc tgaccccagg tttaagcccc

1501 aatggcactc tggaagagga agggataccg gcgtcgatcg tgtcgaaata tctggatgag

1561 cacggcatca tcgtggaaaa aaccgggcca tataacctgc tcttcctgtt tagtatcggg

1621 atcgataaaa ccaaggcgtt gagcttgttg cgggcattaa ccgatttcaa acgcgtgtat

1681 gacctcaacc tgcgcgtgaa aaacgtgttg ccatcgctct ataacgaggc gcctgatttc

1741 tataaagaga tgcgaattca ggagttggct caggggattc atgctctggt gaaacaccac

1801 aatctaccag acctgatgta tcgtgcattt gaggtattac caaagctggt gatgacgccg

1861 catgatgcgt tccaagaaga agtgcgtggc aatattgagc catgtgcctt ggatgatatg

1921 ttagggaaag ttagcgccaa catgatcttg ccgtatcctc cgggtgttcc ggtggttatg

1981 ccgggagaaa tgctcactaa ggagagccgc cctgttctga gcttcttgca gatgctatgt

2041 gaaattggcg cacactatcc gggctttgaa acggatattc acggcgttca tcgtgatggt

2101 gcaacgggta aatacatggt cgtggtgctc aaacaaggcg cagatgaacc gggtgataaa

2161 ccgagtgata cggtgaagaa agcgccgggt aaaaaaccat cagcggcgaa gaagtcataa

SEQ ID：NO 7

1 ATGAACGTTA TTGCAATATT

SEQ ID：NO 8

1 ACTGAAAGCT TCCACTTCCC TTGTACGAGCT

SEQ ID：NO 9

1ATTCAATATT GCAATAACGT TCATAGCTGT TTCCTGTGTG

SEQ ID：NO 10

1 AGGAAACAGC TATGAACGTT

SEQ ID：NO 11

1 ACTGAAAGCTT TACTTTCATC ACAAGCCTCT

SEQ ID：NO 12

1 ACTGAAAGCTT AGATTCAGCG CGAGAGTGAT

SEQ ID：NO 13

1 ACTGAAAGCT TTTTAATTGT GTGACCACTA T

Claims

1.一种稳定的重组表达质粒载体，包含：

一段编码重组型抗毒素基因的聚核苷酸，其表达一种多肽，来中和对宿主细胞有毒的多肽，该有毒的多肽由一段编码毒素基因的聚核苷酸在宿主细胞中表达；

一段编码多肽表达产物的聚核苷酸，其中，

该稳定的重组表达质粒载体由在蜂房哈夫尼菌中可复制骨架质粒衍生而成。

2.根据权利要求1所述的重组质粒载体，其进一步包括编码毒素基因的聚核苷酸。

3.根据权利要求2所述的重组质粒载体，其特征在于所述的毒素基因和抗毒素基因包括任一选自aat/aai基因对，abt/abi基因对及其片段的基因对。

4.根据权利要求1，2，或3所述的重组质粒载体，其特征在于所述的毒素基因包含选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的DNA序列，或其片段。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组质粒载体，其特征在于所述的抗毒素基因包含选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA序列，或其片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组质粒载体，其特征在于所述的骨架质粒为包含pUC（pUC18/19），pBR322，pACYC和其衍生质粒的任一质粒。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组质粒载体，其特征在于所述的多肽表达产物包含脱羧酶，水解酶和磷酸化酶中至少一种。

8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于脱羧酶为氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶，酪氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，或谷氨酸脱羧酶。

9.根据权利要求8所述的重组质粒载体，其特征在于编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括haldc基因，cadA基因以及其片段。

10.根据权利要求9所述的重组质粒，其特征在于所述的重组载体包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的DNA序列，或其片段。

11.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于所述的水解酶为β-半乳糖苷酶。

12.根据权利要求11所述的重组质粒，其特征在于编码所述β-半乳糖苷酶基因的聚核苷酸包含lacZ基因及相关DNA片段。

13.根据权利要求1-12任一项所述的重组质粒载体转移进入宿主细胞而获得的转化子，其特征在于所述的宿主细胞是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌。

14.根据权利要求13所述的转化子，其特征在于所述的蜂房哈夫尼菌为蜂房哈夫尼菌的工业菌株。

15.一种生产1,5-戊二胺的方法，包括：

1a）培养权利要求13或者14所述的转化子；

1b）用步骤1a中得到的菌液催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺

1c）从步骤1b中得到的反应液中提取纯化得到1,5-戊二胺。

16.权利要求一种按权力要求14方法制得的生物基1,5-戊二胺。

17.一种聚酰胺，包括结构式1的结构：

结构式1

及其立体异构体，其中：

m=4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22；

n=4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22；

j＝100~1000000；

所述的聚酰胺由碳原子数为m的二元胺和碳原子数为n的二元酸聚合制得，二元胺、二元酸中的至少一种包含符合ASTM D6866标准的可再生来源的有机碳，且该二元胺或二元酸的m或n可以相同或不同。

18.根据权利要求17所述的聚酰胺，其特征在于，二元胺为根据权利要求15所述的方法制得的生物基1,5-戊二胺。

19.根据权利要求17或者18所述的聚酰胺，其特征在于，二元酸包含符合ASTM D6866标准的生物基碳。

20.一种组合物，包含权利要求17-19任一所述的聚酰胺。

21.一种制备五亚甲基-1,5-异氰酸酯的方法，包含：

2a)根据权利要求15所述的方法制备生物基1,5-戊二胺；

2b)转化步骤2a中制得的生物基1,5-戊二胺为五亚甲基-1,5-异氰酸酯。