CN102796736B - 猪基因组假attP位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪基因组假attP位点及其应用，属于生物技术和生物医学工程领域。本发明从猪基因组中分离到1个假attP位点，与野生型attP位点有40%的序列相似度，具有回文序列特征。该位点能被链霉菌噬菌体фC31整合酶所识别，从而介导含attB位点的外源基因以较高的效率整合于此位点。经蛋白含量测定，该位点维持EGFP基因的表达水平是无外源基因组的50倍。本发明为猪转基因的定点整合与高效表达提供了新的技术方案，为猪功能基因组研究提供了新策略，因此具有重要的科学价值和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物医学工程领域，具体涉及猪基因组的假attP位点及其应用。
背景技术
运用各种分子手段将外源基因整合于猪基因组，赋予猪特定的性状，是推动猪用于基础科学、农业和医学研究的有效途径。从位点特异性的角度考查，外源基因的整合手段可分为非定点和定点两类。非定点型包括裸DNA显微注射、病毒介导、转座子等。虽然病毒介导和转座子在基因转移效率上有较大提高，但是由于识别位点的严谨性较低，整合特异性没有实质性改进，因此难以对整合位点进行严格控制，外源基因的表达也难以预期(马元武等.转座子SleepingBeauty和PiggyBac.中国生物化学与分子生物学报,2010,26(9):783-787)。为了克服上述不足，各种定点型技术应运而生。基因打靶是最为准确的整合策略，但其依赖于同源重组，而自然条件下重组频率很低；此外，猪胚胎干细胞(ES)与诱导多能干细胞(iPS)技术目前尚未成熟,因此通过基因打靶实现外源基因的定点整合难度非常大(闫益波等.猪诱导性多能干细胞技术的研究进展及应用前景.遗传,2011,33(4):307-313.)。研究人员随即转向位点特异重组技术(SSR,site-speccificrecombination),其中应用最为广泛的是Cre/LoxP、FLP/FRT***。二者隶属于位点特异重组酶的酪氨酸家族，作用机理相似，均介导可逆重组反应，这就决定了二者介导外源基因定点整合的净效能仍然较低；而且实际使用中还需将其识别序列“预置”于基因组的特定位点，从可操作性的角度来讲难度反而增大(Nern A,et al.Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(34):14198-14203.)。ZFN(锌指核酸酶)和TALEN(转录激活样因子核酸酶)对识别模块(DNA结构域)和功能模块(FokI核酸酶)进行了巧妙结合，可借助细胞内的双链断裂(double-strand break,DSB)和非同源末端连接(non-homologous endjoining,NHEJ)介导外源基因的定点整合，但实际中要设计和筛选高特异性和高亲和性的核酸酶并不容易(Gabriel R,et al.Anunbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.Nat Biotechnol,2011，29(9):816-823.)。现实的困境促使研究人员开始探询外源基因在猪基因组内高效定点整合的新策略。
在自然界，存在一类能够催化不可逆重组反应的位点特异修饰酶，成员包括фC31、TP901-1、Bxb1、U153等，其中以фC31整合酶的研究背景最为清晰。фC31整合酶来自链霉菌噬菌体，属于位点特异重组酶的丝氨酸家族，可催化两个不同的识别位点attB(细菌附着位点,bacterial attachment site)和attP(噬菌体附着位点,phage attachment site)之间的特异重组(Thorpe HM,et al.In vitro site-specificintegration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of theresolvase/invertase family.Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(10):5505-5510.)。attB和attP位点的主要特征是各在中间位置有一段“TTG”，作为重组“枢纽“，侧翼是两个反向重复序列。重组之后生成的是attL和attR杂合位点，不能再作为фC31整合酶的底物。因此该反应是单向性的，重组之后的基因结构非常稳定，这是该酶具有高效催化活性的一个重要原因。实验证实attB和attP最小活性序列长度分别为34bp和39bp(Groth AC,et al.A phage integrase directs efficient site-specificintegration in human cells.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(11):5995-6000.)。作为原核生物附着位点的attB和attP，理论上在动物基因组内不会出现，但是研究发现фC31整合酶具有修饰未改造动物基因组(unmodified genome)的能力，这是因为动物基因组内存在与野生attP位点具有一定相似度的天然序列，被称为“假attP位点”(pseudo attP site)，可作为фC31整合酶的锚定位点，介导外源基因的定点整合。现已在人、小鼠、果蝇、大鼠、牛、鸡等多个物种内发现了假attP位点。分析相关研究发现该类定点整合反应具有两个重要特点：(1)基因整合效率高。Thyagarajan等将含有attB位点的荧光素酶报告载体和фC31整合酶表达载体共转染人胚肾293细胞。经过抗药性筛选，稳定克隆的数量增加了8.6倍，荧光素酶的表达水平比无фC31组至少高10倍。这比Cre酶或FLP酶介导的整合入LoxP或FRT位点的活性高10~100倍(Thyagarajan B,et al.Site-specific genomicintegration in mammalian cells mediated by phage фC31 integrase.Mol Cell Biol,2001,21(12):3926-3934.)。在牛细胞内，фC31整合酶介导外源基因平均整合率是无фC31组的2.7倍，在小鼠NIH 3T3细胞内，比率达到15.47倍，而在鸡原生殖细胞(PGCs)内的整合率则提高20倍(Ma QW，et al.Identification of pseudo attPsites for phage фC31 integrase in bovine genome.Biochem Biophys Res Commun,2006,345(3):984-988;Leighton PA,et al.Genetic modification of primordial germcells by gene trapping,gene targeting,and фC31 integrase.Mol Reprod Dev，2008,75(7):1163-1175.)。(2)位点特异性好。动物假attP位点的数量有限，而且фC31整合酶有作用于“整合热点”的倾向性，整合特异性高。фC31整合酶可在小鼠体外培养细胞、胚胎以及个体三个层次，有效识别同一位点mpsL1(Chr2)介导基因定点整合，该位点是小鼠基因组的整合热点(Olivares EC,et al.Site-specificgenomic integration produces therapeutic Factor IX levels in mice.Nat Biotechnol,2002,20(11):1124-1128;Hollis RP，et al.Phage integrases for the construction andmanipulation of transgenic mammals.Reprod Biol Endocrinol,2003,1(1):79-83.)。BF4(4q31)是牛基因组的整合热点，74%的整合事件集中于该位点(57个克隆点中有42个是整合于BF4位点)(Ou HL,et al.A фC31 integrase-mediated integrationhotspot in favor of transgene expression exists in the bovine genome.FEBS Journal,2009,276(1):155-163.)。此外，фC31整合酶还具有自主作用和介导单拷贝外源基因整合的优势。上述突出特点使得该酶在基因功能研究、基因治疗、生物反应器、转基因生物研制等领域展现出巨大潜力。
然而，与此形成强烈反差的是，该酶在猪基因组修饰方面的研究尚无公开报道。发明人于2012年3月1日检索PubMed，以关键词“PhiC31 integrase”查询，检出文献113篇；以关键词“PhiC31 integrase pig“查询，检出文献为0篇。分析文献的发表时间，发现有关фC31整合酶的研究呈现迅速增长的态势：1998-2002年间为8篇，2003-2007年间增至38篇，2008-2012年间达到67篇。发明人查询到国家自然科学基金委近12年(1999-2011)共资助有关фC31整合酶的研究项目4项，均为近5年内立项，但没有与猪基因组修饰相关的项目。发明人登陆中国国家知识产权局(SIPO)和美国专利商标局(USPTO)网站，查询到与фC31整合酶有关的专利分别为10件和13件，均未涉及猪的研究。上述查询显示有关фC31整合酶的研究正逐渐引起重视，但其应用范畴有待拓宽。因此，本发明的目的在于分离和鉴定猪基因组假attP位点，并阐释其功能特征，为猪转基因技术提供新策略。
发明内容
本申请的发明人通过构建含有attB序列的绿色荧光蛋白表达载体，并将其与фC31整合酶表达载体按照一定的摩尔比例转染猪肾PK15细胞，以G418筛选单克隆转基因细胞系。提取转基因细胞系的基因组DNA，采用热不对称PCR，分离外源基因的整合位点。通过与野生型attP位点比对，得到猪假attP位点。
本发明所要解决的第一个技术问题是提供猪基因组内可被链霉菌噬菌体фC31整合酶识别的假attP位点，其40bp的识别序列为：5'CCAAGGATTTGGATTTCATC Tgt gtatgctcagtactttt3'（SEQ ID No.1）；该位点在猪基因组的定位是1号染色体，watson链，坐标114220087-114220126。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述假attP位点用于在猪基因组内整合外源基因，操作步骤包括：
(1)构建、制备含有attB位点的外源基因表达载体和фC31整合酶表达载体；
(2)将上述2种载体按照5:1的摩尔比例转染猪细胞；
(3)G418加压筛选单克隆转基因细胞系。
利用本发明提供的假attP位点，可以将外源基因在фC31整合酶的介导下以较高效率整合于猪基因组内。该假attP位点位于猪基因组的基因间隔区，不影响内源基因的表达，不影响猪细胞的正常生理功能，是一个安全位点。本发明将有力促进外源基因定点整合技术在转基因猪研究和生产中的应用。
除非特别指出或是单独定义，本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。本文所提及的所有已公开的专利申请和参考文献均已通过完整引用的方式并入本申请中。
附图说明
图1含attB位点的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-attB酶切鉴定
右侧泳道为Lamda DNA marker，左侧泳道为AseI酶切pEGFP-C1-attB载体产物，可见400bp的***片段释放出来，证明attB核心序列已经成功构建到外源基因表达载体上。
图2整合pEGFP-C1-attB的猪转基因细胞系荧光照片
右侧照片为单克隆转基因细胞系的亮视野，左侧为该细胞系的荧光照片。显示所有细胞发出均匀绿光，证明该细胞系的EGFP表达一致、强烈。
图3染色体步移产物电泳图
M为1kb DNA ladder(Fermentas)，右侧依次为步移第一轮、第二轮、第三轮的PCR产物。第二轮可见清晰的特异产物，第三轮可见单一、锐利的特异产物。
图4整合位点的测序信号图
下划虚线表示猪基因组序列，下划实线表示pEGFP-C1-attB序列。测序结果表明pEGFP-C1-attB在attB枢纽处断裂整合到了猪基因组的特定位点。
图55′整合位点的确认
在整合位点的5′两侧设计跨界引物，扩增猪基因组DNA与外源基因之间的片段，反证外源基因的***位置。M为DL2000 DNA Ladder，1号泳道为水作模板，2号泳道为pEGFP-C1-attB表达载体作模板，3号泳道为未修饰猪基因组DNA为模板，4号泳道为10ng转基因细胞系基因组DNA为模板，5号泳道为100ng转基因细胞系基因组DNA为模板。显示在转基因细胞系中，PCR扩增出540bp的特异片段，而在所有阴性对照中均无该片段。证明外源基因的***位置与理论分析相符。
图63′整合位置的确认
在整合位点的5′两侧设计跨界引物，扩增猪基因组DNA与外源基因之间的片段，反证外源基因的***位置。M为DL2000 DNA Ladder，1号泳道为水作模板，2号泳道为pEGFP-C1-attB表达载体作模板，3号泳道为未修饰猪基因组DNA为模板，4号泳道为50ng转基因细胞系基因组DNA为模板。显示在转基因细胞系中，PCR扩增出1100bp的特异片段，而在所有阴性对照中均无该片段。证明外源基因的***位置与理论分析相符。
图7猪转基因细胞系EGFP表达量
培养基和PK15上清为阴性对照，转基因细胞系的EGFP表达量由GloMax Jr荧光计测定。显示整合于本发明提供的猪假attP位点处的外源基因其EGFP表达量为阴性对照的50倍，证明该假attP位点可维持外源基因的高效表达。
图8猪假attP位点的染色体定位
利用BLAT工具，将本发明提供的猪假attP位点定位于猪基因组，发现该位点位于猪1号染色体的基因间隔区，其5’端邻近基因为LOC100738975，3’端邻近基因为LOC100151775。
具体实施方式
本发明以含有attB位点的绿色荧光蛋白表达载体为外源基因，以猪肾PK15细胞为宿主细胞，实施链霉菌噬菌体фC31整合酶介导的外源基因定点整合，并通过染色体步移技术分离得到猪基因组中可被链霉菌噬菌体фC31整合酶识别的假attP位点。在此基础上，对该位点的序列特征、基因组定位、外源基因表达等做出分析，阐明了该位点的功能特性。
以下结合实施例和附图对本发明做详细的阐释。需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的权利要求做出限制或限定。
实施例1含attB位点的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-attB的构建
(1)主要试剂与材料来源
pBCPB+载体购自Addgene，pEGFP-C1-EGFP购自Clontech。Lamda DNAmarker和AseI限制性内切酶购自Fermentas。高保真DNA聚合酶KOD Plus及其配套的缓冲液(10×buffer)，dNTP，MgSO4均购自东洋纺生物科技有限公司。重组载体按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。测序委托深圳华大基因有限公司完成。
扩增attB序列的引物为AttB-F:gtcattaatCGCCATTCAGGCTGCGCA（SEQ IDNo.2），AttB-R:gtcattaatCTCGGCCTCGACTCTAG（SEQ ID No.3）。下划线序列表示AseI酶切位点。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(pH=8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。
(2)操作步骤
-以KOD Plus扩增attB序列，反应体系组成为：
| 成分 | 初始浓度 | 用量 | 终浓度 |
| PCR缓冲液 | 10× | 5μl | 1× |
| dNTP | 2mmol/L | 5μl | 200μmol/L |
| MgSO4 | 25mmol/L | 2μl | 1mmol/L |
| KOD Plus | 1unit/μl | 1μl | 0.02unit/μl |
| AttB-F | 10μmol/L | 4μl | 800nmo/L |
| AttB-R | 10μmol/L | 4μl | 800nmo/L |
| pBCPB+ | 25ng/μl | 1μl | 0.5ng/μl |
| 双蒸水 | 28μl | ||
| 总体积 | 50μl |
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。
-反应条件如下：
-产物检测：
PCR反应结束后，取5μl产物用1%琼脂糖凝胶做电泳检测，EB染色，紫外成像***拍照记录结果。扩增产物长度为400bp。
-PCR产物割胶回收
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下以锋利刀片割取含400bp目的条带的凝胶，按照Qiagen公司DNA回收试剂盒回收PCR产物。
-限制性内切酶AseI酶切PCR产物，反应体系如下:
| 成分 | 初始浓度 | 用量 | 终浓度 |
| 缓冲液TangoTM | 10× | 3μl | 1× |
| AseI | 10units/μl | 1μl | 0.33unit/μl |
| 回收DNA | 50ng/μl | 26μl | 40ng/μl |
| 总体积 | 30μl |
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中酶切过夜。
-限制性内切酶AseI酶切pEGFP-C1载体，反应体系如下:
| 成分 | 初始浓度 | 用量 | 终浓度 |
| 缓冲液TangoTM | 10× | 3μl | 1× |
| AseI | 10units/μl | 1μl | 0.33unit/μl |
| pEGFP-C1 | 50ng/μl | 26μl | 40ng/μl |
| 总体积 | 30μl |
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中酶切过夜。
-按照Qiagen公司DNA回收试剂盒的步骤回收上述2种酶切产物。
-将回收的酶切产物连接，反应体系如下：
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中连接过夜。结束后置于冰上，用于转化。
-转化大肠杆菌DH5α，转化体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 连接产物 | 10μl |
| DH5α感受态细胞 | 100μl |
| 总体积 | 110μl |
将以上成分混匀，冰浴30min；42℃热激90s；加入不含 有氨苄抗生素的液体LB培养基500μl，置于37℃摇床以200rpm/min的转速复苏45min；在台式离心机上以8000rpm/min的转速离心，将菌体沉淀下来，然后去除450μl LB培养基；将剩余的100μl样品涂布在。氨苄青霉素LB平板上，置于37℃温箱过夜培养16h。挑取细菌单克隆送深圳华大测序。
-阳性重组子的酶切鉴定，用AseI酶切重组载体，体系如下：
| 成分 | 初始浓度 | 用量 | 终浓度 |
| 缓冲液TangoTM | 10× | 3μl | 1× |
| AseI | 10units/μl | 1μl | 0.33unit/μl |
| pEGFP-C1-attB | 50ng/μl | 26μl | 40ng/μl |
| 总体积 | 30μl |
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中酶切过夜。1%琼脂糖凝胶检测片段***情况。
实施例2整合pEGFP-C1-attB的猪转基因细胞系的筛选
(1)主要试剂与材料来源
猪肾PK15细胞系购自ATCC。Fugene HD转染试剂购自Roche。фC31整合酶表达载体pCMV-фC31购自Addgene。无内毒素质粒制备按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。G418抗生素购自Sigma。DMEM、DPBS、胎牛血清、Opti-MEM、DMSO购自Invitrogen。
(2)操作步骤
-细胞铺板
将PK15细胞用胰酶消化为单细胞悬液后，按照104细胞/孔铺于24孔板，生长过夜。转染之前用预热至37℃的DPBS洗涤细胞2次，然后换为新鲜完全培养基。
-细胞转染，体系如下：
| 成分 | 用量 |
| pCMV-фC31 | 1μl(1μg) |
| pEGFP-C1-attB | 1μl(50ng) |
| Opti-MEM | 90μl |
| Fugene HD | 8μl |
| 总体积 | 100μl |
在室温下配制上述转染复合物，孵育20min后逐滴加到PK15细胞上，放回培养箱内继续培养。
-G418筛选
培养24h后，将细胞用胰酶消化为单细胞悬液，按照1:20的密度分盘，传至10cm培养皿，添加800μg/ml的G418，持续培养14天，待单个细胞成长为肉眼可见克隆点。
-单克隆细胞分离
采用胰酶点消化法分离单克隆细胞。将2μl胰酶吸到单克隆细胞上，消化30s后轻轻吸打，将细胞吸起，传至6孔板中。6孔板培养基内含有100μg/ml的G418，用以维持单克隆细胞的生长。带细胞蔓延整个6孔板后，即可冻存、采样，用于后续分析。
实施例3猪基因组假attP位点的分离及定位分析
(1)主要试剂与材料来源
Genome walking试剂盒、pMD18-T TA克隆载体购自Takara公司。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。哺乳动物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪。测序委托深圳华大基因有限公司完成。
pEGFP-C1-attB的巢式特异引物为：SP1，GCTTATAGATACCGTAGACAT（SEQ ID No.4）；SP2，TCCCGTGCTCACCGTGACC（SEQ ID No.5）；SP3，ATCAACTACCGCCACCTCG（SEQ ID No.6）。TA克隆阳性重组子鉴定引物：M13R，CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG（SEQ ID No.7）；M13F，ACG TTGTAA AAC GAC GGC GAC（SEQ ID No.8）。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(pH=8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。
(2)操作步骤
-按照康为世纪提供的哺乳动物基因组DNA提取试剂盒说明书制备单克隆细胞系的基因组DNA，电泳检测其完整性，紫外分光光度计测定浓度和纯度，将浓度调整至20ng/μl。
-按照Takara公司的Genome walking试剂盒说明书，进行三轮热不对称PCR扩增。
第一轮PCR的反应体系为：
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放入PCR仪中按照下述条件运行：
取第一轮PCR的产物1μl作为模板，进行第二轮PCR，反应体系为：
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放入PCR仪中按照下述条件运行：
取第二轮PCR的产物1μl作为模板，进行第三轮PCR，反应体系为：
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放入PCR仪中按照下述条件运行：
-将三轮PCR反应产物电泳，割胶回收特异产物。
-按照pMD18-T说明书进行TA克隆，PCR鉴定阳性重组子。
-阳性重组子委托深圳华大基因有限公司测序。
-BLAT工具将整合序列与猪基因组比对，得到***位点的准确基因组定位。该位点在猪基因组的定位是1号染色体，watson链，坐标114220087-114220126。
实施例4外源基因在猪假attP位点5′端整合的确认
(1)主要试剂与材料来源
采用康为世纪动物组织基因组DNA提取试剂盒制备猪基因组DNA，TaqDNA聚合酶、dNTP均购自Fermentas公司。猪基因组特异引物为attP-LF：GTTGGGATTT GGCTCCAGCC（SEQ ID No.9），载体特异引物为SP1：GCTTATAGATACCGTAGACAT（SEQ ID No.10）。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(pH=8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。
(2)操作步骤
-PCR检测体系组成如下：
| 成分 | 用量 |
| 10×PCR缓冲液(Mg2+plus) | 2μl |
| dNTP混合物(2.5mM each) | 1μl |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 0.5μl |
| attP-LF primer(10μM) | 1μl |
| SP1 primer(10μM) | 1μl |
| 模板 | 1μl |
| 双蒸水 | 13.5μl |
| 总体积 | 20μl |
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放入PCR仪中按照下述条件运行：
-PCR结束后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。
实施例5外源基因在猪假attP位点3′端整合的确认
(1)主要试剂与材料来源
采用康为世纪动物组织基因组DNA提取试剂盒制备猪基因组DNA，TaqDNA聚合酶、dNTP均购自Fermentas公司。猪基因组特异引物为511-RR：ACAGTAACCAACACTGTGTC（SEQ ID No.11）,载体特异引物为IV-F2：CGCCACCTCTGACTTGAGCG（SEQ ID No.12）。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(pH=8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。
(2)操作步骤
-PCR检测体系组成如下：
| 成分 | 用量 |
| 10×PCR缓冲液(Mg2+plus) | 2μl |
| dNTP混合物(2.5mM each) | 1μl |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 0.5μl |
| 511-RR primer(10μM) | 1μl |
| IV-F2 primer(10μM) | 1μl |
| 模板 | 1μl |
| 双蒸水 | 13.5μl |
| 总体积 | 20μl |
在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放入PCR仪中按照下述条件运行：
-PCR结束后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。
实施例6整合于猪假attP位点的EGFP基因的表达水平检测
(1)主要试剂与材料来源
EGFP定量采用荧光计GloMax Jr(Promega)，激发波长为488nm；比色皿材料为聚丙烯，测量体积为1.5ml。表达EGFP的猪转基因细胞系由本发明构建，吸取培养基上清作为检测样品。野生型PK15细胞的培养基上清和未作细胞培养的完全培养基作为阴性对照。
(2)操作步骤
-样品的处理:
对野生型PK15细胞和转染EGFP基因细胞系，培养24h后，取培养液，放于1.5Ml离心管中，即可用于下述测量。
-绿色荧光蛋白的测量：
用完全培养基和培养了PK15而未转染基因的培养基做空白对照进行调零。然后开始测样。比色皿中（蒸馏水1.4ml+0.1ml样品），即样品稀释15倍。每次测样后用蒸馏水清洗比色皿，用纸擦干，继续测样。
SEQUENCE LISTING
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<400> 1
ccaaggattt ggatttcatc tgtgtatgct cagtactttt 40
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcattaatc gccattcagg ctgcgca 27
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtcattaatc tcggcctcga ctctag 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcttatagat accgtagaca t 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcccgtgctc accgtgacc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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atcaactacc gccacctcg 19
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttgtaaa acgacggcga c 21
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<212> DNA
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gcttatagat accgtagaca t 21
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<213> 人工序列
<400> 12
cgccacctct gacttgagcg 20
Claims (1)
1.猪基因组内可被链霉菌噬菌体фC31整合酶识别的假attP位点，其特征在于，所述假attP位点为40bp，序列为：5'CCAAGGATTTGGATTTCATC Tgt gtatgctcagtactttt3'；该位点在猪基因组的定位是1号染色体，watson链，坐标114220087-114220126。
Priority Applications (1)
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