CN102250902A - 水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用，所述水稻miR390的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将水稻miR390转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代种子播种在含镉培养液中，发现过表达miR390的水稻植株对镉敏感。

Description

水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用

技术领域

本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用。

背景技术

近年来，随着我国工业化和城市化进程的不断发展，重金属污染事件亦呈现出愈演愈烈的趋势。因重金属造成的水源和土壤污染已对中国的生态环境、食品安全、百姓身体健康和农业可持续发展构成严重威胁。据估算，目前全国耕种土地面积的10％以上已受重金属污染，全国每年因重金属污染的粮食高达1200万吨，造成的直接经济损失超过200亿元。由于重金属在土壤中的存留时间短则数十年(如镉)，长则数万年(如铅)，要彻底解决现有问题并非易事。水稻是世界上最重要的农作物，全球一半以上的人口以稻米为主食，我国是世界上第一种稻大国，目前我国稻米中重金属超标，如各地出现的镉米、汞米等事件已引起了国家各部委的高度重视。因此，如何在轻度重金属污染的土壤中进行农作物的安全生产，如何利用植物进行大规模污染土壤的修复，这对保障农产品安全、生态安全和人们的健康，促进农业生产的可持续发展意义重大。

植物在长期的进化过程中产生了对重金属的多种抗性以及对重金属的超积累。近年来科学家对重金属胁迫的抗性机理从生理生化与分子水平上开展了大量的研究工作，一些与植物重金属耐性相关的基因也得到了鉴定与功能的描述，如植物螯合肽和金属硫蛋白在植物对重金属的解毒作用中发挥了重要功能。近年来发现植物参与环境胁迫响应还有另一类重要的功能基因即调节基因，它们通过调控其下游许多逆境诱导基因的表达而间接影响代谢与生理过程，但有关这一类与重金属耐性相关的调节基因研究报道甚少。对此问题的探索将有利于加深人们对基因调控和重金属胁迫耐受性以及重金属超积累的理解与生理分子机理的阐明。

随着生长和环境条件的变化，正确调节基因表达是植物正常生长和适应各种胁迫的基础，过去基因表达的研究主要集中在转录水平，随着众多内源小RNA不断发现及其功能研究，人们开始认识到基因转录后水平的调节在植物逆境反应中也起着非常重要的作用，尤其是内源小RNA对基因转录后水平的调节。MicroRNA(miRNA)就是一种新型调控基因表达的小分子RNA。miRNA自从发现以来就成为生命科学领域的研究热点。目前已知的植物miRNA的功能主要表现在调控植物发育的各个方面，其中靶基因多数是植物发育模式的细胞分化中相关转录因子。而这些靶基因调控的植物生长发育过程主要包括激素信号传导、细胞代谢、器官分化、育性转换、花器官的形成与生殖。这显示出在生物体内miRNA组成了一个巨大的分子调控网络，它处于基因表达调控的中心位置，是基因进行精细调控必不可少的重要手段，在不同层次上(转录、转录后、翻译等)对靶基因进行调控，并与蛋白-蛋白相互作用网络相对应，调节细胞的生命活动。研究发现miRNA在干旱、冷害、重金属等环境胁迫的响应过程中发挥重要作用。并且，随着内源小RNA的发现及其功能研究，利用小RNA技术改良植物对生物与非生物胁迫的耐性成为了一个重要的技术手段。miRNA对重金属胁迫应答调控机制的研究，可从基因表达调控网络方面进一步探明植物重金属胁迫应答的分子机制；同时也可通过转基因技术改良作物，增强作物对重金属的耐性与环境适应，培育可食部分重金属低积累的品种，及优良重金属超积累型植物，为土壤重金属污染的植物修复技术提供材料。

近年来的研究表明，miRNA在植物重金属胁迫响应过程中扮演着重要角色。杨志敏等发现在甘蓝型油菜和蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表达可受重金属镉的诱导与调节(Xie，F.L.，Huang，S.Q.，Guo，K.，Xiang，A.L.，Zhu，Y.Y.，Nie，L.，Yang，Z.M.Computational identification of novelmicroRNAs and targets in Brassica napus.FEBS Lett，2007，581：1464-1474.)。他们还构建镉胁迫下水稻幼苗的small RNA文库，克隆了19个新的miRNA，并发现其中多数miRNA在镉胁迫下表达发生变化，如miR604在镉处理下表达下调，其靶基因脂转移蛋白表达上升。而且脂转移蛋白参与植物多种抗逆性反应并介导植物激素信号转导等过程(Huang，S.Q.，Peng，J.，Qiu，C.X.，Yang，Z.M.Heavy metal-regulated newmicroRNAs from rice.J.Inorg.Biochem，2009，103：282e287.)。朱健康等在2006年研究发现miR398在拟南芥抵抗强光、重金属Cu、Fe等氧化胁迫中发挥作用：在氧化胁迫条件下，miR398的表达量被诱导降低，miR398调控的Cu/Zn超氧化物歧化酶(CSDs)mRNA的表达量升高，Cu/Zn超氧化物歧化酶可快速地将超氧化物转变成过氧化物和分子氧，组成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防线，导致拟南芥对重金属胁迫的耐受性也大大增加(Sunkar，R.，Kapoor，A.，Zhu，J.K.Posttranscriptional induction of twoCu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated bydownregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance.PlantCell，2006，18：2051-2065)。

miR390在拟南芥、玉米、水稻等植物中保守。拟南芥中miR390的靶基因为TAS3，TAS3可在miR390的介导下产生系列ta-siRNA，其作用于生长素响应因子(ARF3和ARF4)的mRNA。即miR390通过介导miR390-TAS3-ARF2/ARF3/ARF4途径，从而参与生长素信号转导。水稻中miR390的靶基因为富含亮氨酸的类受体蛋白激酶(receptor-like proteinkinase，RLK)。由于miRNA及其靶基因的共同保守性，可推测水稻中miR390及靶基因可能与生长素应答途径相关。另外文献报道，miR390的靶蛋白RLK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它参与植物抗逆性反应、调节植物发育和介导植物激素信号转导等过程。如水稻的LRR型类受体蛋白激酶OsRLK1基因受低温和盐胁迫诱导表达，但有关RLK蛋白激酶在重金属胁迫中的作用尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用。

一种水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用，所述水稻miR390的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述植物为水稻。

具体方法为：将包含所述水稻miR390的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选，培养，获得转基因株系。

由于miRNA本身序列很短，只有20几个bp，而前体序列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选的，所述前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过将水稻miR390转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代种子播种在含镉培养液中，发现过表达miR390的水稻植株对镉敏感。

附图说明

图1为7天龄水稻幼苗60uM Cd胁迫6h根的miRNA芯片图谱，(Cy3对照；Cy5处理样品)；

图2为7天龄水稻幼苗60uM Cd处理3，6，12，24h后，miR390及其靶基因RLK的表达分析；

图3为miR390过表达载体构建的过程凝胶图谱。a.miR390前体PCR扩增凝胶图谱；b.pMD19-T-miR390质粒酶切鉴定图；c.p1301-miR390重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；

图4为生长五周的miR390过表达水稻经200uM Cd处理30d的表型(WT对照；35S：MIR390转基因水稻)。

具体实施方式

实施例1  基因的获得

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，取60uM CdCl₂处理6h和对照组(未处理)的根0.1g，用液氮研磨并加入1ml Trizol(Invitrogen生产)继续研磨至匀浆，转入1.5ml离心管中，12000×g离心10min，收集上清至新离心管中。室温放置5min，加入0.2ml氯仿用力震荡15s，使溶液充分混匀。室温放置5min，12000×g离心15min，收集上清。加两倍上清体积的异丙醇，-20℃过夜沉淀。12000×g离心10min，去上清，加1mL预冷的75％乙醇(DEPC-H₂O配制)洗沉淀。12000×g离心10min，倒尽液体，室温干燥5min，沉淀重溶于50μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水。取2μg Total RNA进行电泳检测，并稀释样品测OD 260/280，OD 260/230及浓度。利用2-5μg总RNA样品，通过YM-100(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA 3′端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接，(ligation)用于后续的荧光标记。用两个不同的标记物Cy3和Cy5来标记处理组和对照组的两个RNA样品。

利用Version11.0microRNA数据库，(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)制作μParaflo^TM微流体芯片探针。杂交反应通过利用μParaflo^TM微流体芯片，检测在60uM CdCl₂胁迫下水稻根中miRNA的表达差异，如图1所示，结果发现miR390在Cd处理6h后表达量比对照(未处理)下降2倍以上。

根据Sanger microRNA数据库(miRBase)和TIGR数据库，发现水稻miR390位于3号染色体，来源于基因间区域。成熟序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列如SEQ ID NO.2所示。

根据miRU靶基因预测软件发现，miR390的靶基因是富含亮氨酸的类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase，RLK)。根据NCBI和TIGR数据库查询，RLK基因号为Os02g10100，基因序列长度为6694bp，CSD为4242bp，基因编码产物大小1413个氨基酸。

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，用60uM CdCl₂处理0，3，6，12，24h，用Trizol法分别提取RNA，并用DNase I消化以去除DNA污染。采用PrimeScriptTM RT reagent kit(Takara，Japan)合成cDNA。以该cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex TaqTM(Takara，Japan)，在LightCycler480(Roche，Shanghai，China)荧光定量PCR仪上扩增miR390和RLK基因，PCR反应条件为95℃1min，变性95℃10s，退火58℃15s，延伸72℃15s，45个循环。PCR引物如下：

miR390-F，5’-TTCTTCCCCTATCATCACC-3’

miR390-R，5’-CCTCAAAACATCTCTCCC T-3′

RLK-F，5’-CCTTCGCAAACTTCTCCG-3’

RLK-R，5’-ACTGCCTCCTTCTCAACA-3’

如图2所示，实时定量PCR实验结果验证了miR390对RLK的负调控。

实施例2  基因克隆与转化

以野生型水稻中花11七天苗龄幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到miR390前体基因的序列。具体操作如下：首先，提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA。取约0.2g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移粉末到加有500μl提取液(100mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；500mMNaCl)的离心管中，轻轻混匀。向管中加入100μl 10％SDS溶液，混匀，65℃保温20min。然后加氯仿/异戊醇/乙醇(20∶1∶4)混合液600μl，室温静止10min。4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中。加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，-20℃沉淀DNA20min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加70％乙醇500μl进行洗涤。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。轻微离心，用移液器将残留液体吸干。吹干DNA沉淀后，溶于100μl含RNase酶(10μg/ml)TE中，37℃水浴30min，-20℃保存。根据已知的miR390前体序列(http://www.mirbase.org/cgi-bin/get_seq.pl)，在database中查阅其所在基因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约20bp处设计引物，所设引物如下：

miR390-F，5’-CGGGGTACCGGAGAGATGTTTTGAGGAAGG-3’

miR390-R，5′-AACTGCAGCAGATTTAATTGGTCGTGTGG-3′

接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR390前体基因。PCR反应体系为20μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 2μl、10mMdNTPs 2μl、10μM正向引物(miR390-F)0.5μl、10μM反向引物(miR390-R)0.5μl、TaKaRa Taq(5U/μl)聚合酶0.2μl，最后加ddH₂O补至20μl。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。PCR产物凝胶图谱如图3.a所示。

扩增后将miR390前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量。加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min。将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。

将回收的miR390前体基因DNA与pMD19-T载体(TakaRa)进行连接反应，连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的miR390前体的DNA、5μl Solution I。16℃下连接6h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR390。利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：

取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1(含RNaseA)，彻底悬浮细菌沉淀。加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充***解。加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min。收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液。加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并漂洗两次。将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻底晾干。加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。

将提取的质粒pMD19-miR390和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切。酶切体系50μl，包括5μl 10×M buffer、30μl pMD19-miR390质粒(或pCAMBIA1301质粒)、1μl KpnI、1μl PstI和13μl ddH₂O，37℃水浴过夜。pMD19-miR390质粒酶切结果如图3.b所示。将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR390酶切后，割胶回收DNA片段。接着用T4连接酶连接，连接体系10μl，包括1μl pCAMBIA1301载体、7.5μl miR390DNA、1μl 10×T4连接酶buffer和0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定，结果如图3.c和图3.d所示。将正确的植物表达载体p1301-miR390导入农杆菌感受态细胞EHA105，操作如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入1μgp1301-miR390质粒，混匀，冰浴5min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1ml YM培养基28℃恢复培养4h。10000g离心30s，弃上清，吸200μl菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48h后长出农杆菌单菌落。摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定。

经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR390，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤。操作如下：首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养。收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM己酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基中。调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动。然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天。将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时。将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。待再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长。挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株，共14个株系。收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。

实施例3  miRNA镉敏感性功能鉴定

取T2代转基因株系种子和中花11野生型的种子，1％稀HNO₃破休眠处理16h。倒去稀HNO₃，10％NaClO(有效氯约1～1.2％)消毒20min后用蒸馏水冲洗。将种子浸泡在水中，37℃暗处催芽约两天，再在铺有湿润滤纸的培养皿中培养一天至露白。挑选生长一致的露白的转基因株系和野生型的种子播于网格上，放入盛有水稻营养液(按国际水稻所标准营养液配方进行配制)的桶中，置于水稻培养箱中(白天/黑夜：26℃/22℃，13h/11h；Rh 80％)培养，营养液每5天换一次。将转基因株系和野生型水稻在正常的营养液中培养五周后，挑选生长一致的水稻植株用200uMCdCl₂处理，观察转基因株系与野生型大苗在镉胁迫下的表型。如图4所示，结果发现在200uM CdCl₂处理40d后，miR390过表达的转基因幼苗相比野生型幼苗，生物量下降，苗枯黄萎蔫更为严重，说明miR390超量表达株系增加了对镉的敏感性。

Claims (4)

1.水稻miR390在增加植物镉胁迫敏感性中的应用，所述水稻miR390的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将包含所述水稻miR390的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选，培养，获得转基因株系。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

Images