CN110804614B - 甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法 - Google Patents

甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法。本发明通过构建BnaTZF1A基因的过表达载体并转化甘蓝型油菜XY15，使该基因在甘蓝型油菜中过表达，能够增强甘蓝型油菜对干旱胁迫的耐受性，在干旱胁迫条件下，过表达材料中的细胞活性明显高于XY15材料。能够提高ABA相关合成酶基因的表达水平，大量与ABA抗旱途径相关的基因与XY15野生型油菜相比都有上调的趋势，说明BnaTZF1A基因可能与ABA调控的抗旱途径相关，因此能够增强甘蓝型油菜对干旱胁迫的耐受性，最终达到抗旱的效果，本发明在作物的抗旱性育种方面具有广泛的应用前景。

Description

甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提 高抗旱性的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法。
背景技术
甘蓝型油菜是三大油菜类型(白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜)之一，是白菜型油菜和甘蓝通过自然种间杂交后形成的异源四倍体植株。甘蓝型油菜株体较大，主要分布于长江流域，是我国唯一的冬季油料作物。由于自然环境条件的不稳定，植物在生长过程中会受到外界多种不利因素的影响，包括生物胁迫和非生物胁迫，其中生物胁迫因素主要包括病原菌感染和食草动物的取食等，非生物胁迫因素主要包括高盐、干旱、高温、冷冻、营养失衡和重金属污染等。而高盐、干旱和极端温度胁迫是影响植物生长发育的主要环境因素。土壤盐渍化和由于水资源短缺造成的干旱胁迫成为限制全球经济作物质量和产量的重要因素，有报道指出全球大约45％的土地会连续或间断性的受到干旱条件的影响。且随着全球经济的发展、城市面积的日益扩大和人口的不断增长，可用的耕地面积逐年减少。此外，由于温室效应引起的全球气候变暖可进一步加剧全球的干旱胁迫，这将对世界农业的生产发展造成毁灭性的后果，将严重威胁人类的粮食安全。因此，利用现代分子生物学、基因组学和基因工程技术，筛选在干旱迫条件下对植物的耐受性起关键调控作用的基因，培育耐旱的作物新品种，并进一步研究植物耐旱的分子机制成为当今科学研究的一大方向。
串联CCCH锌指蛋白(TZF)作为一种转录因子，在转录后水平调节基因的表达。RR-TZF是植物特有的一类TZF蛋白，主要特征是在TZF结构域上游富含精氨酸(R)且具有C-X5-H-X4-C-X3-H保守结构的一段50多个氨基酸的区域(RR结构)。RR-TZF蛋白通过结合DNA、RNA和蛋白质在植物的生长发育以及各种生物和非生物胁迫中发挥着重要的作用，TZF蛋白家族在进化上非常保守，研究发现TZF蛋白家族涉及ABA、赤霉素、蔗糖转导等重要功能。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先克隆了甘蓝型油菜中的BnaTZF1A基因，然后构建BnaTZF1A基因的过表达载体CaMV35S::BnaTZF1A并转化甘蓝型油菜XY15(湘油15)，在甘蓝型油菜中过表达BnaTZF1A基因，导致甘蓝型油菜抗旱性增强。
本发明获得的抗旱基因BnaTZF1A来源于甘蓝型油菜，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示。
其中克隆权利要求1所述基因的特异引物1、特异引物2，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
其次，本发明提供一种利用BnaTZF1A基因提高甘蓝型油菜抗旱性的方法，该方法包括以下步骤：
(1)设计上述特异引物1、特异引物2，从甘蓝型油菜基因组中克隆抗旱基因BnaTZF1A；
(2)构建BnaTZF1A基因过表达载体，并将该载体转化到农杆菌中；
(3)在农杆菌介导下转化甘蓝型油菜，筛选得到BnaTZF1A基因过表达转化植株；
(4)采用分子检测方法对步骤(3)的过表达转化植株进行抗旱性鉴定；
(5)进一步进行BnaTZF1A转基因甘蓝型油菜的转录组测序。
最后，本发明提供一种BnaTZF1A基因在提高甘蓝型油菜抗旱性中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现了一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A，通过构建该基因的过表达载体并转化甘蓝型油菜XY15，使该基因在甘蓝型油菜中过表达，能提高非生物胁迫下的细胞活性，提高ABA相关合成酶基因的表达水平，大量与ABA抗旱途径相关的基因与XY15野生型油菜相比都有上调的趋势，因此能增强甘蓝型油菜对干旱胁迫的耐受性，最终达到抗旱的效果，本发明在作物的抗旱性育种方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为CaMV35S::BnaTZF1A载体构建图谱。
图2为BnaTZF1A-RNAi干扰载体构建图谱。
图3为甘蓝型油菜XY15组培及筛选过程。
图4为转基因甘蓝型油菜的表型。
图5为CaMV35S::BnaTZF1A转基因油菜检测。
图6为BnaTZF1A-RNAi转基因油菜检测。
图7为转基因油菜植株RT-PCR检测。
图8为转基因油菜植株RT-qPCR检测。
图9为不同转基因材料萌发时间的比较。
图10为不同非生物胁迫条件下台盼蓝染色结果。
图11为转录组测序建库流程。
图12为差异表达基因统计柱形图。
图13为不同比较组间的共有及特有的差异表达基因。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的甘蓝型油菜品种为XY15(湘油15)，其他物质均可自常规方式购买得到。
实施例1构建BnaTZF1A表达载体和干扰载体
本方面所用的载体为含有CaMV35S启动子的pFGC5941载体，在原核生物中的抗性为卡那霉素(Kanamycin)，在真核生物中的抗性为草铵膦(Basta；PPT)。
在http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/网站下载BnaTZF1A的序列，设计特异引物1和特异引物2，克隆BnaTZF1A片段基因，片段大小为1074bp，连接pFGC5941植物双元表达载体，构建BnaTZF1A基因的过表达载体CaMV35S::BnaTZF1A，载体构建图谱如图1所示，用CaMV35S::BnaTZF1A转化甘蓝型油菜XY15。
在靠近BnaTZF1A基因的5’端和3’端分别截取一段长118bp和141bp的片段作为干扰片段，构建BnaTZF1A基因的两个干扰载体BnaTZF1A-RNAi-1和BnaTZF1A-RNAi-2，载体构建图谱如图2所示，转化甘蓝型油菜XY15。
两个干扰载体BnaTZF1A-RNAi-1和BnaTZF1A-RNAi-2的引物序列如下：
118bp-F：5’-TCTAGACCATGGATGGCCACTTAACGACGATC-3’
118bp-R：5’-GGATCCGGCGCGCCATCCGGCTCGTTCGACGGAAG-3’
141bp-F：5’-TCTAGACCATGGGTAACTGTCGCCGTCGTGTTTG-3’
141bp-R：5’-GGATCCGGCGCGCCTCGGAGAAATCGAAAACTGAAAC-3’
实施例2油菜遗传转化
农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化
在超净工作台中将经升汞灭菌处理后的XY15种子播种在1/2MS培养基上，置于24℃培养箱中暗培养6天；同时将重组质粒导入农杆菌GV3101，PCR鉴定阳性单菌落。在转化前的第二天晚上挑取阳性单克隆于2mL YEB液体培养基中震荡培养，转化前的第一天晚上以1：300扩大培养过夜，使农杆菌的OD600在0.3-0.5之间，收集菌体并用DM培养基重悬，加入DM培养基，控制OD600在0.3-0.4之间，将重悬后的菌再放入28℃摇床培养30min-1h。
在重悬菌继续培养的时候开始切取下胚轴，将暗培养6d的幼苗取出放入灭好菌的大平皿中，倒入5mL DM培养基保湿，用无菌镊子和解剖刀切取下胚轴，长度为0.8-1.0cm，将切好的下胚轴转入三角瓶内侵染；将准备好的菌液倒入装有外植体的三角瓶，侵染30min，侵染的过程中，隔5min左右摇晃一次，避免菌液与外植体接触不充分。侵染完毕后，将外植体转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，铺开，让多余的菌液吸干，同时在超净台中吹5-10min左右，将处理后的外植体转到M1培养基中使外植体与农杆菌共培养，保证外植体与培养基充分接触，放入24℃培养室，暗培养40-48h；将在M1上共培两天后的外植体转入M2培养基中，并在24℃16/8h光照条件下培养三周；三周后再转入M3中，每2周继代一次，直至出现绿芽，通常在M3-1～M3-2会产生愈伤组织，M3-3～M3-4会在愈伤组织上产生分化芽；切取长出两片叶的芽点，放入M4培养基中，培养一个月，待长出4至5片叶子，且长出根后，移入小花砵中生长。
甘蓝型油菜组织培养各阶段培养基配方如下表所示。
表1甘蓝型油菜组织培养各阶段培养基配方
Figure GDA0002897713640000041
Figure GDA0002897713640000051
实施例3转基因甘蓝型油菜材料的筛选鉴定
(1)甘蓝型油菜在组培的过程当中就已经逐步筛选得到了抗性植株，提取组培获得的抗性植株的DNA，用相应的载体上下游引物对其DNA进行PCR扩增，能扩增出目的片段大小条带的植株为转基因植株；
(2)提取转基因植株的RNA，以甘蓝型油菜内参基因BnaActin为对照，分别检测转基因植株在RNA水平上是否成功过表达或降低表达。
将植物表达载体CaMV35S::BnaTZF1A和干扰载体分别转化甘蓝型油菜XY15，转化及筛选过程如图3，转基因油菜的表型如图4所示；提取图3中获取的抗性植株的DNA，用载体多克隆位点上下游引物进行检测，转基因植株能被扩增出相应大小的条带，如图5和图6，提取转基因材料的RNA，进行RT-PCR和qPCR检测，结果显示BnaTZF1A在野生型油菜中成功被干扰和过表达，如图7和图8。
实施例4不同转基因材料萌发时间的测定
在正常生长条件下，对XY15、BnaTZF1A过表达和RNA干扰的转基因油菜植株进行萌发时间进行测定。
将消毒后的转基因油菜种子播种于营养土上，覆膜，隔夜统计萌发情况。
对XY15、BnaTZF1A RNAi(RNA干扰)和OE(BnaTZF1A过表达)材料的萌发进行统计观察，结果如图9所示，在播种后第三天XY15与RNAi材料基本萌发完全，尤其是XY15材料，在播种后第三天株高已有2cm左右；而OE材料在第三天才刚刚开始萌发，有的种子才开始露白，这表明BnaTZF1A过表达材料的萌发时间比XY15材料要晚三天左右。这一结果与拟南芥AtTZF1过表达材料相似。
实施例5不同非生物胁迫条件下的细胞活性分析
分别取长势一致的三种油菜材料的幼嫩叶片3-5片，在1/2MS、150mM NaCl和200mM甘露醇溶液中处理2h，用吸水纸吸干叶片表面的液体；之后分别置于50mL Falcon管底部，加入6-8mL台盼蓝染液，拧紧Falcon管盖，放在37℃培养箱中染色过夜；第二天倒出台盼蓝染液，用75％酒精进行脱色，脱色完毕后进行观察拍照。
结果如图10所示，在1/2MS对照处理条件下，三种材料叶片的细胞活性无明显差异；在甘露醇诱导条件下，OE材料的细胞活性明显大于XY15和RNAi材料，在盐处理条件下，OE材料的死细胞也少于XY15和RNAi材料。这一结果表明了BnaTZF1A能相应干旱胁迫的诱导，并且其过表达材料对干旱胁迫具有较强的耐受性，同时，BnaTZFA1过表达材料对盐等高浓度的离子胁迫具有较强的耐受性。
实施例6 BnaTZF1A转基因材料的转录组测序
(1)材料处理
参考Chen等人(2015)的处理方法，选择长势一致的XY15和BnaTZF1A基因过表达油菜材料各两株，挑选大小一致的油菜嫩叶片，用打孔器在叶片两边对称打孔，分别分装在培养皿中；以1/2MS溶液为对照，配制1/2MS+200mM甘露醇溶液模拟干旱处理离体的油菜叶片，加入溶液，使用真空泵抽真空使溶液渗入叶片当中；将离体材料放置生长室培养3h后取出，吸干多余的水分，用液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。
(2)测序及建库
取保存在-80℃的油菜叶片交由上海欧易生物公司完成转录组测序，建库测序流程如图11所示。
(3)差异表达基因的筛选与分析
利用DESeq(Anders S.,2012)软件对各个样本基因的counts数目进行标准化处理(采用base mean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用N B(负二项分布检验的方式)对reads数进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果来筛选差异蛋白编码基因。在1/2MS对照和甘露醇模拟干旱处理条件下，分别鉴定BnaTZF1A过表达与XY15材料的差异基因。
在200mM甘露醇处理条件下，筛选得到了XY15野生型与BnaTZF1A过表达材料在处理前后的差异表达基因，如图12所示，BnaTZF1A基因过表达材料经甘露醇诱导后，共有1225个基因发生了显著的变化，其中有683个基因上调，542个基因下调；而XY15野生型材料被诱导后，只有103个基因差异表达的基因，其中有61个基因上调，42个基因下调。
同时利用BnaTZF1A过表达和XY15野生型材料在处理后与处理前的差异基因绘制差异表达基因韦恩图，分析其共有及特有的差异基因。如图13所示，XY15材料在处理后有88个特有的差异表达基因，BnaTZF1A过表达材料有1210个；而XY15与BnaTZF1A过表达材料在甘露醇处理后共有的差异基因只有15个。
表2 BnaTZF1A过表达与XY15在甘露醇处理条件下的差异表达基因
Figure GDA0002897713640000071
Figure GDA0002897713640000081
另外，在BnaTZF1A过表达与XY15在甘露醇处理下进一步筛选了差异倍数在20倍以上的17个差异基因，结果发现差异倍数较大的大部分都是与非生物胁迫相关的基因，并且大多与ABA调控的抗旱途径相关，比如上调的PIP2、PP2C、Dehydrin Rab18以及RCI2A等(如表2)。
综上所述，本发明通过构建BnaTZF1A基因的过表达载体并转化甘蓝型油菜XY15，使该基因在甘蓝型油菜中过表达，能够增强甘蓝型油菜对干旱胁迫的耐受性，在干旱胁迫条件下，过表达材料中的细胞活性明显高于XY15材料。能够提高ABA相关合成酶基因的表达水平，大量与ABA抗旱途径相关的基因与XY15野生型油菜相比都有上调的趋势，说明BnaTZF1A基因可能与ABA调控的抗旱途径相关，因此能够增强甘蓝型油菜对干旱胁迫的耐受性，最终达到抗旱的效果，本发明在作物的抗旱性育种方面具有广泛的应用前景。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1074
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 1
atgatgattg gagaaactca tcgtgcctat ccaacggttc agattcctcc atggccactt 60
aacgacgatc taacggcggt tgatatatac gggagtcctg acggcggaaa tagcatgctc 120
gaggctttgg ctgcgttaca gcgttatctt ccgtcgaacg agccggatcc ggattctgac 180
ccggaactgt cgggtccaga ttcggcaatc gatacttact catgcgatca tttccggatg 240
tacgaattta aagtgaggcg atgcactcgt ggccggagcc acgactggac ggagtgccct 300
tacgctcatc ccggagagaa agctcgccgt cgtgatccga ggaagtatca ttactccggt 360
acggcgtgcc ctgagtttcg caaaggcggt tgcaaaaaag gcgacgcgtg tgagttctct 420
cacggcgttt tcgagtgttg gcttcatccg gcgcgttatc ggactcagcc gtgtaaagac 480
ggcggtaact gtcgccgtcg tgtatgtttc ttcgctcatt cgccggatca gatcagggtt 540
ttgccgaacc aaagccccga tcgagttgat tctttcgacg gtgtgtctcc gattcgtagg 600
gcgtttcagt tttcgatttc tccgacgtcc ggttcgccgc cggtgagtcc acgagacgac 660
tcggagtctt gttctttatt tagtcgttct ctcgggtcgg gttcggtaaa cgacgtcgtc 720
gcgtgtatga ggcatttgca gcttaataaa gtgaagtctc ttccttcctc ttacaacaat 780
caagtcggat gctacggatc cgggttcgga tcgtcacgtg gatcactctt gggtcccggg 840
tttcggagcc taccaaatac cccgttccga ccggagatcg ggtatatgga catttgggat 900
aatggtttgg aggaagaacc ggcgatggag cgggtcgagt cgggtcgtga actgcgagcg 960
aagatgttcg agaagctcag caaggaaaac tgcatggatc gggttgaccc ggatccgtat 1020
cagggttcag gtgaagctcc tgatgtcggg tgggtctctg aactggtgat gtga 1074
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcgcgccat gatgattgga gaaactcatc g 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctagatcac atcaccagtt cagagaccca c 31

Claims (2)

1.一种利用甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A提高甘蓝型油菜抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从甘蓝型油菜基因组中克隆抗旱基因BnaTZF1A，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示，设计所述抗旱基因BnaTZF1A的特异引物1和特异引物2，所述特异引物1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述特异引物2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
(2)构建BnaTZF1A基因过表达载体，并将该载体转化到农杆菌中；
(3)在农杆菌介导下转化甘蓝型油菜，筛选得到BnaTZF1A基因过表达转化植株；
(4)采用分子检测方法对步骤(3)的过表达转化植株进行抗旱性鉴定；
(5)进一步进行BnaTZF1A转基因甘蓝型油菜的转录组测序。
2.甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A在提高甘蓝型油菜抗旱性中的应用，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
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CN103160516A (zh) * 2013-03-08 2013-06-19 中国农业科学院油料作物研究所 一种油菜抗逆基因及其应用
CN104845979A (zh) * 2015-06-11 2015-08-19 西南大学 甘蓝型油菜skip基因家族及其重组载体和应用
CN104988158A (zh) * 2015-07-15 2015-10-21 南京农业大学 甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA12及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

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Title
Predicted:Brassica napus zinc finger CCCH domain-containing protein 20-like (LOC106381735),mRNA;Eukaryota等;《Genbank登录号：XM_013821673.2》;20171004;参见全文 *

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