CN102245772A

CN102245772A - 抑制基因表达的短发卡rna

Info

Publication number: CN102245772A
Application number: CN2009801491898A
Authority: CN
Inventors: 葛青; B·H·约翰斯顿; S·A·卡扎科夫; H·伊尔韦斯; A·达拉斯
Original assignee: Somagenics Inc
Current assignee: Somagenics Inc
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2009-10-14
Publication date: 2011-11-16
Also published as: US20120329857A1; EP2352744A2; EP2352744A4; WO2010045384A2; WO2010045384A3; JP2015211680A; JP2012505657A; EP2352744B1; US20100112686A1; US8283460B2; US8779115B2

Abstract

描述了包含用于抑制基因表达(例如病毒介导的基因表达)的短发卡RNA(shRNA)的方法、组合物和试剂盒。

Description

抑制基因表达的短发卡RNA

关于联邦赞助的发展研究的声明

本发明在工作过程中部分得到来自国立卫生研究院的NIH资助R44AI056611(BHJ)的支持而完成。政府可享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及利用短发卡RNA(shRNA)抑制病毒基因表达，例如丙肝病毒IRES介导的基因表达。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是利用双链RNA(dsRNA)靶向信使RNA(mRNA)使其降解和减少翻译的细胞过程。该过程是基因特异性的，允许靶序列的微小变化，并且可以进行多基因靶向。该现象于1990年在植物中首次报道(Napoli，C.等，Introduction of a chimeric chalcone synthase gene intopetunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.PlantCell，1990，2(4)：279-289)。随后在其他生物体中也观察到该现象，包括真菌和蠕虫(Romano，N.等，Quelling：transient inactivation of gene expression inNeurospora crassa by transformation with homologous sequences.Mol.Microbiol.，1992，6(22)：3343-53)。长的dsRNA可以机械地被Dicer(一种III型RNase)切割成为短干扰RNA(siRNA)，随后，这些小的双链结构与RNA诱导的沉默复合体(RISC)相互作用，所述RISC是含有解旋酶和核酸内切酶活性的多亚基复合体，介导同源转录子的降解。～19-29bp的合成siRNA可以有效地抑制哺乳动物细胞和哺乳动物中的基因表达，这一发现引起开发这些抑制物用作治疗的一阵研究(Elbashir，S.M.等，Duplexesof 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature，2001，411(6836)：494-8)。最近先进的siRNA选择方法的开发(包括基于运算的合理设计选择)使得研究人员能够利用关键序列和热动力学参数选择有效的靶序列非依赖性siRNA双链(Khvorova，A.等，FunctionalsiRNAs and miRNAs exhibit strand bias.Cell，2003，115(1)：209-216)。

化学合成或者由细菌噬菌体(例如T7、T3或者SP6)或哺乳动物启动子(pol III例如U6或者H1或者pol II)表达的19-29bp小发卡RNA(shRNA)也显示出对哺乳动物细胞中靶基因的强烈抑制作用。此外，具有单分子结构的合成shRNA比包含两条链的siRNA在效力和简单性方面具有优势，所述siRNA需要精确化学量之两条分离链的仔细退火，其可能产生不同的纯度谱和脱靶效应(Siolas，D.等，Synthetic shRNAs as potentRNAi triggers.Nature Biotechnology，2005，23(2)：227-231；Vlassov，A.V.等，shRNAs targeting hepatitis C：effects of sequence and structural features，andcomparison with siRNA.Oligonucleotides，2007，17：223-236)。

但是，在shRNA的设计和开发过程中出现了一些挑战。首先，研究人员注意到不同shRNA诱导的沉默水平存在广泛的可变性。第二，茎长度、环长度和环位置不同的shRNA具有不同的抑制能力(McManus，M.T.等，Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.RNA，2002，8：842-850；Harborth，J.等，Sequence，chemical，and structural variatioin of smallinterfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian genesilencing.Antisense And nucleic Acid Drug Development.2003，13：83-105；Li，L.等，Defining the optimal parameters for hairpin-based knockdown constructs.RNA，2007，13：1765-1774；Vlassov，A.V.等，shRNAs targeting hepatitis C：effects of sequence and structural features，and comparison with siRNA.Oligonucleotides，2007，17：223-236)。已经发现发卡5’端具有19个核苷酸之引导链(左手环)的某些shRNA比发卡3’端具有引导链(右手环)的shRNA更有效(Scaringe，S.US 2004/0058886 A1)，而有报道称具有右手环结构的其他shRNA更有效(Vermeulen等，US 2006/0223777 A1)。发现发卡3’端具有19-mer之引导链的shRNA(右手环)比25或者29-mer的shRNA(右手环)更有效。以前可获得的有限数据表明，具有19bp茎和右手环之shRNA的最佳环大小是大于4个核苷酸，优选9或者10个核苷酸。第三个挑战是合成shRNA(特别是19-mer发卡结构)在胞质中的加工机制是未知的。与长dsRNAs和29-mer shRNAs不同，19-mer shRNA不能被Dicer切割(Siolas，D.等，Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers.Nature Biotechnology，2005，23(2)：227-231)。因此，为了提供高功能性抑制物，对高效shRNA进行可靠设计以及更好地理解结构-活性关系和RNA加工过程是有利的。

发明概述

本发明涉及与shRNA、断裂shRNA和T形RNA用于基因沉默有关的方法和组合物。因此，本发明提供了增加RNA干扰有效性的组合物、方法和试剂盒。

在一个方面中，本发明描述了一种多聚核苷酸(例如一种DNA或者RNA分子)，其包含由15个核苷酸至30个核苷酸组成的第一序列(例如第一RNA序列)，例如引导链，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；第二序列(例如第二RNA序列)，例如过客链，其包含与第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列的长度在10个核苷酸之间，并且比第一序列的长度少1个核苷酸；可选地位于第一序列和第二序列之间的环序列，所述环由1至100个核苷酸组成；和可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

在另一个方面中，本发明描述了一种多聚核苷酸(例如一种DNA或者RNA分子)，其包含由16个核苷酸至30个核苷酸组成的第一序列(例如第一RNA序列)，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；第二序列(例如第二RNA序列)，例如过客链，其包含与第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列比第一序列多至少一个核苷酸，并且所述第二序列不多于100个核苷酸；可选地位于第一序列和第二序列之间的环序列，所述环由1至100个核苷酸组成；和可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

在另一个方面中，本发明描述了一种多聚核苷酸(例如一种DNA或者RNA分子)，其包含由16个核苷酸至18个核苷酸组成的第一序列(例如第一RNA序列)，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；第二序列(例如第二RNA序列)，例如过客链，其包含与第一序列至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列具有与第一序列相同的核苷酸数量；可选地位于第一序列和第二序列之间的环序列，所述环由1至100个核苷酸组成；和可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

在另一个方面中，本发明描述了一种多聚核苷酸(例如一种DNA或者RNA分子)，其包含由19个核苷酸组成的第一序列(例如第一RNA序列)，例如引导链，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；第二序列(例如第二RNA序列)，例如过客链，其包含与第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列由17个核苷酸或者18个核苷酸组成；可选地位于第一序列和第二序列之间的环序列，所述环由1至100个核苷酸组成；和可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

在另一个方面中，本发明描述了一种多聚核苷酸(例如一种DNA或者RNA分子)，其包含由15个核苷酸至30个核苷酸组成的第一序列(例如第一RNA序列)，例如引导链，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；第二序列(例如第二RNA序列)，例如过客链，其包含与第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列具有与第一序列相同或者较少的核苷酸数量；可选地位于第一序列和第二序列之间的环序列，所述环由1个核苷酸组成；和可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

在另一个方面中，本发明描述了一种RNA分子，其包含由大约5个核苷酸至大约15个核苷酸组成的第一序列，例如引导链，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；第二RNA序列，例如过客链，其能够与第一序列形成包含大约23个核苷酸至大约100个核苷酸的发卡结构，所述第二序列包含：第一区域，其与第一序列具有至少80％的互补性并且能够与第一序列形成少于19个碱基对的第一双链区域；与第一区域相连的第二区域；与第二区域相连的第三区域；与第三区域相连并具与第二区域具有至少80％互补性的第四区域，所述第四区域能够与第二区域形成第二双链区域，以使第三区域在与第二双链区域相邻处形成环并且第一双链区域和第二双链区域的长度总和少于23个碱基对；和可选地位于RNA分子5’或者3’端少于大约6个核苷酸的悬端。

在另一个方面中，本发明描述了一种RNA分子，其包含SEQ ID Nos：1-39的任意一种RNA序列。

在一些实施方案中，第三区域形成环，所述环包含具有5’-UU-3’序列的核苷酸。此外，第二链可以包含过客链的一部分，其具有5’磷酸酯基团。在一个实施方案中，第二链的5’磷酸酯基团与第二链的第四区域相邻。在另一个实施方案中，第二链的5’磷酸酯基团与第二链的第四区域不相邻。

在另一个方面中，本发明描述了一种T形RNA分子，其包含第一RNA序列，例如引导链，其与靶核苷酸序列至少部分地互补，第二RNA序列，例如过客链，和第三RNA序列，其中所述第一序列包含具有大约18个核苷酸至大约29个核苷酸并且与第二序列的第一区域具有至少80％互补性的第一区域；第一序列进一步包含具有大约4个核苷酸至大约10个核苷酸并且与第三序列的第一区域具有至少大约90％互补性的第二区域；第二序列包含具有大约18个核苷酸至大约29个核苷酸并且与第一序列的第一区域具有至少大约80％互补性的第一区域；第二序列进一步包含具有大约4个核苷酸至大约10个核苷酸并且与第三序列的第二区域具有至少大约90％互补性的第二区域，其中所述第三序列的第二区域与第三序列的第一区域是3’相邻的；和可选地位于RNA分子5’或者3’端少于大约6个核苷酸的悬端。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，多聚核苷酸(例如本文中描述的DNA或者RNA分子)可以包含大约30个核苷酸至大约84个核苷酸。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，多聚核苷酸(例如本文中所描述的DNA或者RNA分子)包含第二序列，所述第二序列包含与第一序列的至少一部分具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％或者至少大约100％互补性的序列。在特定的实施方案中，第二序列(例如第二序列的3’端)包含与第一序列的5’端部分具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％或者至少大约100％互补性的序列。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，多聚核苷酸(例如本文中描述的DNA或者RNA分子)包含至少一种修饰，例如本文中描述的化学修饰。在一些实施方案中，本文中描述的RNA分子中大约20％至大约100％(例如大约40％至大约90％)的核苷酸被化学修饰。在一个实施方案中，本文中描述的RNA分子中大约20％至大约100％的Us和Cs被2’O-甲基修饰或者2’F修饰。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，多聚核苷酸(例如本文中所描述的DNA或者RNA分子)包含环，所述环包含至少一个非核苷酸分子。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，多聚核苷酸(例如本文中所描述的DNA或者RNA分子)分子的3’端或者5’端包含悬端。例如，所述悬端是1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个核苷酸。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，多聚核苷酸(例如本文中所描述的DNA或者RNA分子)在第一序列和第二序列之间包含1或2个错配。在一个实施方案中，错配存在于引导链从5’端数第11、12、13、14、15、16或者17位和过客链的反义寡核苷酸处，优选引导链从5’端数第14位和过客链的反义寡核苷酸处。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，第一序列在第二序列的3’方向。在其他实施方案中，第一序列在第二序列的5’方向。

在本文中描述之任意方面的一些实施方案中，本文中描述的RNA分子进一步包含至少一个偶联基团，其通过连接子连接至RNA分子的环区域或者3’末端。偶联基团可以是类固醇分子、维他命、肽、半乳糖和其衍生物、或者蛋白。在一些实施方案中，偶联基团是类固醇分子，其选自由胆固醇、胆甾烷醇、豆甾醇、胆烷酸和麦角甾醇组成的组。在其他实施方案中，偶联基团是胆固醇，连接子是C5连接分子。而在其他实施方案中，偶联基团是维他命E。

在其他实施方案中，本文中描述的RNA分子进一步包含至少一种可检出的标记，其连接至RNA分子的环区域或者3’末端。在一些实施方案中，可检出的标记是染料分子。在一些实施方案中，RNA分子可以同时包含偶联基团和可检出的标记。

在一些实施方案中，本文中描述的RNA分子能够抑制靶核苷酸序列 (例如病毒序列)的表达。在一些实施方案中，病毒序列是丙肝病毒序列。在特定的实施方案中，靶核苷酸序列是丙肝病毒内部核糖体进入位点(IRES)序列中的序列。

在另一个方面中，本发明描述了一种DNA序列，其包含编码本文中描述之RNA分子的序列，或者描述了一种包含DNA序列的表达载体，所述DNA序列包含编码本文中描述之RNA分子的序列。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体。

在另一个方面中，本发明描述了一种组合物，其包含本文中描述的RNA分子和药学上可接受的赋形剂。在另一个方面中，本发明描述了一种组合物，其包含一种载体，所述载体包含编码本文中描述之RNA分子的序列。

在另一个方面中，本发明描述了一种抑制基因表达或者基因活性的方法，所述方法包括使表达该基因的细胞与本文中描述的RNA分子相接触，其中第一RNA序列与由基因的至少一部分编码的靶核苷酸序列至少部分地互补。

在另一个方面中，本发明描述了一种抑制丙肝病毒表达或者活性的方法，所述方法包括使表达丙肝病毒的细胞与本文中描述的RNA分子相接触，其中第一RNA序列与丙肝病毒序列至少部分地互补。

在任意一个方面中，细胞可以是哺乳动物例如人或者非人灵长类动物中的细胞。

在特定的实施方案中，本文中描述的RNA分子不能诱导IFN应答。

在另一个方面中，本发明描述了一种试剂盒，其包含容器，所述容器包含本文中描述的RNA分子；和可选地减少血清的组织培养基。

下列附图仅以说明性目的显示，而非限定性的。

附图简述

图1A-1D描述了实施例中含有多种构型的发卡结构。

图2描述了T形RNA分子的结构和通过第三长链对T形RNA分子的多元化，所述第三长链具有与第一和第二链的第二区域互补的重复序列。

图3A-3C比较了具有5’-过客链之shRNA和具有5’-引导链之shRNA的剂量反应。shRNA由IDT合成，并用siRNA缓冲液(Dharmacon，含有20mM KCl、6mM HEPES-KOH pH 7.5、0.2mM MgCl₂)复原。用shRNA和靶DNA质粒共转染293FT细胞(96孔板中，每孔23,000个细胞)，所述质粒中萤火虫荧光素酶的表达依赖于HCV-IRES(IRES-fLuc)。用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)作为转染试剂。48小时后，使细胞裂解，并通过光度计测定萤火虫荧光素酶活性。所有数据均是单个结果，进行3次独立实验。图3D-3F比较了由Oligo 4.0计算出的相同组shRNA的内部稳定性。结果表明与具有5’-过客链的shRNA相比，具有5’-引导链的shRNA的功能性增强。增强程度是序列依赖性的，并且5’端内部稳定性的不同发挥重要作用。

图4描述了具有多种环长度、序列和封闭碱基对之shRNA的剂量反应。如图3所描述进行该实验。图4A比较了具有10-、5-、2-和1-核苷酸(nt)环之shRNA的效力。这些shRNA和siRNA 19-3中双链区域的序列是相同的。结果表明，具有5’-引导链的shRNA当环大小非常小时(1-或者2-nt)比较大时(5-或者10-nt)具有较高效力。由于使用了3种不同的环序列，因此环序列可能不影响shRNA的活性。图4B比较了环前面紧接着具有U:A和C:G之shRNA的活性。环序列(下划线)和相邻碱基对显示于圆括号中。这些shRNA中双链区域的序列是相同的。比较显示，当环长度是2-nt时，环相邻碱基对为C:G的shRNA比环相邻碱基对为U:A的shRNA显示出较高效力。图4C显示shRNA环中的UU-核糖核苷酸序列可以被TT-脱氧核糖核苷酸序列取代，而不影响shRNA的效力。对于shRNA和siRNA 19-3，双链序列是相同的。

图5描述了具有多种双链长度和3’悬端之shRNA的剂量反应。如图3所描述进行该实验。图5A比较了具有和没有悬端之shRNA的活性。结果表明，具有平末端或者具有3’-TT悬端的shRNA与具有3’-UU悬端的shRNA具有非常相似的效力。图5B比较了具有多种双链长度或者过客链长度之shRNA的效力。g/p值代表引导链长度/过客链长度。比较显示，使过客链缩短至17-或者16-nt同时使引导链长度保持在19-nt使得基因沉默活性显著降低(SG115和SG116)。但是，使过客链和引导链的长度同时缩短至18-nt对效力没有显著影响(SG117)。图5C描述了具有甚至更短双链长度之shRNA的活性。双链为17或者16个碱基对的shRNA(SG117和SG119)具有非常相似的效力。尽管双链为11个碱基对的shRNA(SG120)显示其沉默活性显著降低，但是该分子的IC₅₀仍然在亚纳米级摩尔范围内。

图6描述了具有多种短茎长度之shRNA的剂量反应。如图3所描述进行该实验。图6A比较了引导链和过客链长度均不同之shRNA的活性。结果显示，当使用双链长度为14个或者更少碱基对的shRNA(SG132和SG120)时，shRNA的效力显著降低。图6B示出具有10-至13-nt过客链同时使引导链长度保持在19-nt之shRNA的活性。结果显示shRNA的活性需要包含过客链最小长度为11-nt的发卡结构。

图7描述了多种结构之shRNA对不同靶的效力。如图3所描述进行该实验。图7A和7B分别显示shRNA对相同靶si72和si74(但是结构不同)的活性。结果显示，3’-UU悬端对于shRNA活性不是重要的。使双链区域缩短可以部分地降低靶基因敲低(knockdown)的活性。

图8描述了在双链区域不同位点具有单个错配之shRNA的剂量反应。图8A显示在过客链5’端第6位(引导链5’端第14反义位)具有(SG110)和没有(SG142)单个错配的shRNA之间具有相似活性。图8B显示没有(SG142)和分别在过客链5’端第6(SG126)、7(SG127)、5(SG128)、4(SG129)位(引导链5’端第14、13、15和16反义位)具有单个错配的shRNA之间具有相似活性。单个错配时没有发生活性丢失似乎与错配类型(例如，U-U(SG110)＝U-C(SG126))无关，表明该特性是序列非依赖性的。所有这些shRNA均具有5’-UU-3’环和3’-UU悬端。

图9描述了shRNA的靶抑制不是由于形成二聚体或者寡聚体。图9A比较了经过和未经加热并快速冷却之shRNA的靶抑制。尽管比具有多种类型的shRNA稍低，通过加热和快速冷却获得的shRNA单体单一类型显示出在靶基因沉默中的高活性，无论所测试的序列或者长度如何。

图10描述了在单体和混合类型中shRNA的不同表现。图10A显示SG119在大部分是单体时具有较高的沉默活性，而SG120在大部分是二聚体时具有较高的沉默活性。图10B显示shRNA经过和未经加热并在冰水浴中快速冷却后，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶中shRNA的单体、二聚体和寡聚体。

图11描述了具有和没有缺口之shRNA以及T形RNA的效力。如图3所描述进行该实验。这些实验中使用的shRNA浓度包括0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM和0.003nM。对于SG102仅测试了2种浓度(0.3nM和0.03nM)。SG68L、SG146和SG142具有带有3’-UU悬端的相同的双链序列。SG68L和SG146具有5’-CAAUA-3’环，而SG142具有5’-UU-3’环。SG146由两个RNA分子组成，其可以根据Dharmacon’s siRNA退火说明退火结合。第一分子含有引导链、环和4-核苷酸过客链；第二分子含有15-核苷酸过客链的3’端和3’悬端。SG102由3个RNA分子组成(图2A)，其在第一链和第二链的第一区域中具有引导链和过客链。

图12描述了shRNA在肝癌细胞株Huh7中的效力。与在293FT细胞中的结果一致，SG68L比SG68更有效。任意特定浓度的阴性对照SG101不能使萤火虫荧光素酶基因的表达减少。

图13显示几种高效性shRNA的抑制活性不是由于IFN应答或者细胞毒性。图13A描述了shRNA转染人外周血单核细胞(PBMC)后IFN响应基因OAS1的表达。图13B描述了shRNA转染人肝癌细胞株(Huh7)后进入细胞的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴。总之，图13A和13B的这些图表明这些shRNA没有诱导IFN应答或者细胞毒性。

图14显示具有19个或者更少碱基对的shRNA是重组Dicer的底物。通过非变性(图14A)和变性(图14B)PAGE分析经Dicer处理后的产物。

发明详述

除非另有解释，本文中使用的所有技术性和学术性术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然与本文中描述相似或者等价的方法和材料可以用于本发明的操作和测试中，下面描述了合适的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和本文中涉及的其他参考文献(包括GenBank数据库序列)均作为整体通过引用并入本文。如有冲突，以本发明(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例是说明性而非限定性的。

本文公开的实施方式涉及进行shRNA诱导之基因沉默的组合物和方法。通过使用shRNA、经修饰的shRNA、断裂shRNA、经修饰的断裂shRNA、T形RNA和其衍生物，可以提高RNA干扰的效力。因此，本文公开的内容提供了增强shRNA功能性的组合物、方法和试剂盒。优选本文公开的内容提供了增强shRNA功能性的组合物和方法，所述shRNA用于抑制哺乳动物(例如人类)中的病毒基因表达和/或治疗病毒感染。在一些实施方案中，本文中描述的shRNA质粒能够通过诱导切割shRNA引导链序列识别之靶序列内部或者附近的病毒多聚核苷酸序列抑制病毒基因表达。

本文中使用的词组“短发卡RNA”和术语“shRNA”指能够进行RNAi并且具有过客链、环和引导链的单分子RNA。优选所述过客链和引导链基本相互互补。引导链的长度可以是大约16至大约29个核苷酸，更优选长度是大约18至19个核苷酸。过客链的长度可以是大约11至大约29个核苷酸，更选优长度是17至19个核苷酸。引导链可以包含与靶mRNA互补的至少17个碱基。在一些实施方案中，与靶序列互补的引导链可以包含错配。可以通过改变靶向序列以使其与基因变体或者表型互补，使序列发生变化，以靶向一个或者多个基因变体或者靶(例如病毒靶)表型。在一些实施方案中，序列可以靶向多个病毒株，例如HCV，虽然靶向序列的至少一个核苷酸(例如1个、2个或者3个核苷酸)与病毒株的靶位不同。shRNA可以具有例如长度是0至大约24个核苷酸的环，优选长度是0至大约10个核苷酸，更优选长度是2个核苷酸。环序列可以包含与靶位点无关的核苷酸残基。在一个特别优选的实施方案中，环是5’-UU-3’。在一些实施方案中，其可以包含非核苷酸基团。而在其他实施方案中，环不包含任何非核苷酸基团。可选地，shRNA在其分子的3’端可以具有2个碱基的悬端区域。shRNA还可以包括具有包含错配和/或凸起之茎环结构的RNA。通过大约1至大约5个核苷酸的错配、***或者缺失，与靶同源的过客链可以在大约0至大约5个位点不同，通常例如天然产生的微小RNA。包含上面任意一种结构的RNA可以包含环，所述环包含核苷酸、非核苷酸或者核苷酸和非核苷酸的组合。在任意一种shRNA中，优选多个和更优选所有核苷酸均是核糖核苷酸。

在一些实施方案中，本文中描述的shRNA可选地包含至少一个偶联基团。

本文中使用的词组“断裂shRNA”是指包含两个或者更多不同链的短发卡RNA。可以以多种方式(例如5’-过客链-断裂-过客链-环-引导链，5’-引导链-环-过客链-断裂-过客链)组建这样的分子，并且该分子中的断裂可以包含缺口、由一个或者多个非配对核苷酸环绕成的缺口或者空位。

本文中使用的词组“T形RNA”是指包含至少三条分离链(第一链、第二链和第三链)的T形RNA。第一和第二链均包含下列两个区域(I和II)：第一链的第一区域能够与第二链的第一区域退火或者杂交；一条链的第一区域可以包含与靶mRNA互补的至少17个碱基；两条链的第一区域长度均可以是大约17至29个核苷酸，优选长度是22个核苷酸；第一链的第二区域可以与第三链的一部分退火或者杂交；第二链的第二区域可以与第三链的一部分(与与第一链的第二区域杂交的那部分相邻并且在其3’方向)退火或者杂交；第一链和第二链的第二区域不能相互互补，其长度可以是大约4至大约10个核苷酸，优选长度是8个核苷酸；第三链的长度可以是至少大约8个核苷酸；第三链可以具有与第一链和第二链her对(her pairs)的第二区域互补的多个序列，以使第一链和第二链包含的多个双链结构可以与第三链退火；可选地，第二链3’端具有2个碱基的悬端区域。

本文中描述的shRNA、断裂shRNA和T形RNA可以用于实施基因沉默。在某些情况下，由于事实上本文中描述的shRNA对RNA干扰更有效并且较不可能诱导细胞应激反应和/或细胞毒性，还优选其双链长度与发卡结构的环长度相似或者等长。

此外，词组“短发卡RNA”和术语“shRNA”包括除核糖核苷酸基团外还包含其他基团的核酸，所述其他基团包括但不限于经修饰的核苷酸、经修饰的核苷酸内部连接、非核苷酸、脱氧核糖核苷酸和其所涉及之核苷酸的类似物。

本文中使用的术语“siRNA”是指包含双链区域和每端具有非同源性残基3’悬端的RNA分子。所述双链区域的长度通常是大约18至大约30个核苷酸，所述悬端可以是任意长度的非同源性残基，但是优选2个核苷酸的悬端。

本文中使用的词组“引导链”是指与目标靶核酸基本互补(例如80％或者更多)或者100％互补的多聚核苷酸或者多聚核苷酸区域。shRNA的引导链还与其过客链至少基本互补。引导链可以包含RNA、DNA或者嵌合型RNA/DNA多聚核苷酸区域。可以通过将取代基连接其中，对引导链中的任何核苷酸进行修饰，例如进行2’修饰。还可以对引导链进行多个小分子和/或偶联物的修饰。例如，引导链可以与信使RNA分子、非mRNA的RNA序列(例如tRNA、rRNA、hnRNA、负链和正链病毒RNA和其互补RNA)或者编码或非编码DNA序列完全或者部分地互补。

引导链可以是除引导链外还包含其他核苷酸之较大链的一部分。例如对于T形RNA，第一链或者第二链可以包含引导链和与第三链互补但不与靶互补的额外核苷酸。对于断裂发卡结构，引导链可以是还含有环区域和与引导链一部分互补之第三区域的链的一部分。

本文中使用的词组“过客链”是指具有与靶核酸(便如信使RNA或者DNA序列)完全或者部分相同之核苷酸序列的多聚核苷酸或者区域。除非另有说明，通常提及的序列是过客链(或者区域)，并且隐含互补引导链(或者区域)的存在。

本文中使用的术语“互补”是指多聚核苷酸能够互相形成碱基对的能力。通常由反向平行多聚核苷酸链或者区域中核苷酸单位之间的氢键形成碱基对。互补多聚核苷酸链或者区域可以以Watson-Crick方式(例如A和T，A和U，C和G)或者以能够形成稳定双链的任何其他方式形成碱基对。

本文中使用的“完全互补”或者“100％互补”是指一条多聚核苷酸链或者区域的每个核苷酸单位可以与第二条多聚核苷酸链或者区域的每个核苷酸单位形成氢键的情况。少于完全互补是指两条链或者两个区域的一些而非所有核苷酸单位可以相互形成氢链的情况。例如，对于两条19-mer的链，如果每条链或者每个区域的17个碱基对可以相互形成氢键，则多聚核苷酸链显示89.5％的互补性。基本互补是指多聚核苷酸链或者区域显示80％或者更高的互补性。

本文中使用的术语“脱氧核苷酸”是指糖基2’或者3’位缺少OH基团的核苷酸或者多聚核苷酸，其具有合适的连接物和/或2’，3’末端双脱氧，而不是2’和/或3’碳位连接氢原子。

本文中使用的术语“脱氧核糖核苷酸”和“DNA”是指包含至少一个核糖基团(核糖基团的2’位具有一个H而不是OH)的核苷酸或者多聚核苷酸。

本文中使用的术语“错配”包括引导链核苷酸和过客链核苷酸之间不发生Watson-Crick碱基配对的情况，其中核苷酸侧面具有双链结构，所述双链结构包含直接从错配位点后(5’方向)开始的错配5’方向的碱基对和直接从错配位点后(3’方向)开始的错配3’方向的碱基对。错配的示例包括但不限于A与G相对、C与A相对、U与C相对、A与A相对、G与G相对、C与G相对等。错配还可以包括脱碱基残基与核苷酸或者经修饰的核苷酸相对、无环残基与核苷酸或者经修饰的核苷酸相对、空位或者非配对环。其最广义的理解是错配包括特定位点处的任何改变，其使得发生变化之位点或者位点附近的热动力学稳定性降低，以致特定位点处双链的热动力学稳定性低于该位点Watson-Crick碱基对的热动力学稳定性。优选的错配包括G与A相对、A与C相对。特别优选的错配包括A与A相对、G与G相对、C与C相对和U与U相对。

本文中交叉使用词组“RISC”和“RNA诱导的沉默复合体”，其代表介导RNAi的蛋白复合体(参见例如Hutvagner，G.FEBS Letters，2005579(26)：5850-7)。

本文中交叉使用词组“RNA干扰”和术语“RNAi”，其是指单个、两个或者T形分子(例如siRNA、shRNA、miRNA、piRNA)通过与RNAi途径的一个或者多个成员相互作用在生物学过程中发挥作用，所述成员包括但不限于Drosha、DISC、Dicer等。所述过程包括但不限于通过降解mRNA使基因沉默，减少翻译，与tRNA、rRNA、hnRNA、cDNA和基因组DNA相互作用和利用辅助蛋白抑制DNA并且使其甲基化。此外，调节RNAi的分子(例如siRNA、piRNA或者miRNA抑制物)也包含在增强RNAi途径的分子列表中(参见例如Tomari，Y.等，Genes Dev.2005，19(5)：517-29)。

本文中使用的词组“沉默”是指RNAi介导的基因表达减少，其可通过任意种方法测定，包括报告基因方法(例如荧光素酶报告基因测试)、基于PCR的方法、Northern印迹分析、分支DNA、western印迹分析和其他本领域认可的技术。

本文中使用的术语“烷基”是指可以是饱合或者未饱合、经取代或者未取代的烃基基团。其可以包括线性、分支、环状和/或杂环基团，并且可以包含功能性基团，例如醚、酮、醛、羧酸酯等。除非另有说明，烷基基团不是环状、杂环或者不包含功能性基团。

示例性烷基基团包括但不限于经取代或者未取代的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基和更高碳原子数的烷基基团，以及2-甲基丙烷、2-甲基-4-乙基丁烷、2，4-二乙基丙烷、3-丙基丁烷、2，8-二丁基癸烷、6，6-二甲基辛烷、6-丙基-6-丁基辛烷、2-甲基丁烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷和2-乙基己烷。术语烷基还包括烯基基团，例如乙烯基、丙烯基、芳烷基和炔基基团。除非另有说明，烷基基团是未取代的。

本文中描述的烷基基团的取代可以包括烷基基团是可以容许的任何原子或者基团，其包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯胺、仲胺或者叔胺)、酰胺、醚、酯、醇和氧。示例性烷基基团还可以包括例如含氮基团、酮基、醛基、羧基、硝基、亚硝基或者腈基、杂环类(例如咪唑)、肼或者羟氨基、异氰基或者氰基和含硫基团(例如亚砜、砜、硫醚和二硫醚)的修饰。除非另有说明，烷基基团不包括卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺、酰胺、醚、酯、醇、氧或者上面列出的修饰。

此外，烷基基团还可以包含杂取代，即碳原子被例如氮、氧或者硫取代。杂环取代是指具有一个或者多个杂原子的烷基环。杂环基团的示例包括但不限于吗啉代、咪唑和吡咯烷。除非另有说明，烷基基团不包含杂取代或者具有一个或者多个杂原子的烷基环(即杂环取代)。

优选用于2’修饰的烷基基团是甲基，其以O-连接到核糖基的2’碳上，即包含2’-O-甲基基团的2’O-烷基。

本文中使用的术语“2’-O-烷基修饰的核苷酸”是指具有2’位置被修饰之糖基(例如脱氧核糖基)的核苷酸单位，所述修饰使得氧原子同时与糖基2’位置的碳原子和烷基基团连接。在多个实施方案中，烷基基团基本由碳和氢组成。在一个特别优选的实施方案中，烷基基团是甲基。

本文中使用的术语“2’碳修饰”是指具有糖亚基2’位置被修饰之糖基(例如基团)的核苷酸单位。“2’-O-烷基修饰的核苷酸”在该位点被修饰，使得氧原子同时与糖基2’位置的碳原子和烷基基团连接，例如2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-异丙基、2’-O-丁基、2’-O-异丁基、2’-O-乙基-O-甲基(-OCH₂CH₂OCH₃)和2’-O-甲基-OH(-OCH₂CH₂OH)。本文中使用的“过客链2’碳修饰”是指过客链上1个核苷酸2’碳位的修饰。本文中使用的“引导链2’碳修饰”是指引导链上1个核苷酸2’碳位的修饰。

本文中使用的术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或者其经修饰形式以及其类似物。核苷酸包括包含嘌呤和嘧啶的类型，所述嘌呤例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤以及其衍生物和类似物，所述嘧啶例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及其衍生物和类似物。优选“核苷酸”包括胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或者鸟嘌呤基团。

核苷酸类似物包括碱基、糖基和/或磷酸酯基团的化学结构被修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于嘧啶第5位修饰、嘌呤第8位修饰、胞嘧啶环外氨基的修饰和5-溴-尿嘧啶取代；和糖基第2位修饰，其包括但不限于糖基经修饰的核糖核苷酸，其中2’-OH被例如H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或者CN所取代，所述R是本文中定义的烷基基团。核苷酸类似物还包括具有碱基(例如次黄嘌呤核苷、Q核苷、黄嘌呤)、糖基(例如2’-甲基核糖)、非天然的磷酸二酯连接(例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯)的核苷酸和肽。

经修饰的碱基是指通过置换或者加入一个或多个原子或基团被修饰的核苷酸碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和Q核苷)。修饰类型的示例包括碱基基团被修饰的核苷酸，其包括但不限于多种组合的经烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或者乙酰化的碱基。更具体的经修饰碱基包括例如5-丙炔基尿嘧啶核苷、5-丙炔基胞嘧啶核苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2’-氨基腺嘌呤、1-甲基次黄嘌呤核苷、3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷和其他具有5’位修饰的核苷酸、5-(2-氨基)-丙基尿嘧啶核苷、5-卤代胞嘧啶核苷、5-卤代尿嘧啶核苷、4-乙酰胞嘧啶核苷、1-甲基腺嘌呤核苷、3-甲基腺嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷、6-甲基尿嘧啶核苷、2-甲基鸟嘌呤核苷、7-甲基鸟嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟嘌呤核苷、5-甲胺乙基尿嘧啶核苷、5-羟甲基尿嘧啶核苷、脱氮核苷酸(例如7-脱氮-腺嘌呤核苷)、6-偶氮尿嘧啶核苷、6-偶氮胞嘧啶核苷、6-偶氮胸腺嘧啶核苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶核苷、其他硫基(例如2-硫尿嘧啶核苷和4-硫尿嘧啶核苷和2-硫胞嘧啶核苷)、二氢尿嘧啶核苷、假尿嘧啶核苷、Q核苷、古嘌苷、萘基和经取代的萘基基团、任何O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶(例如N6-甲基腺嘌呤核苷)、5-甲基羰基甲基尿嘧啶核苷、尿嘧啶5-羟乙酸、嘧啶-4-酮、嘧啶-2-酮、苯基和经修饰的苯基基团(例如氨基苯酚或者2，4，6-三甲氧基苯)、作为G-封条(G-clamp)核苷酸的经修饰的胞嘧啶、8-经取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、8-经取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。经修饰的核苷酸还包括糖基基团被修饰的核苷酸，以及具有糖基或者其类似物(非核糖基)的核苷酸。例如，糖基基团可以是或者是基于甘露糖、***糖、吡喃型葡萄糖、吡喃型半乳糖、4-硫代核糖和其他糖(杂环或者碳环的)。术语核苷酸类似物还包括本领域已知的普通碱基。示例性普通碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或者水粉蕈素。

此外，术语核苷酸类似物还包括具有可检出之标记物的类型，所述标记物例如放射性或者荧光基团，或者连接到核苷酸的质量标记物。

本文中使用的术语“悬端”是指末端非碱基配对的核苷酸，其源于一条链或者区域延伸超出与第一链或者区域形成双链之互补链的末端。能够通过氢键形成双链的一个或者多个多聚核苷酸可以具有悬端。延伸超出双链3’端的单链区域被称为悬端。

本文中使用的术语“核糖核苷酸”和词组“核糖核酸”(RNA)是指包含至少一个核糖核苷酸单元的经修饰或者未经修饰的核苷酸或者多聚核苷酸。核糖核苷酸单元包含连接到核糖基团2’位的氧和使得与另一个核苷酸连接或者阻止连接的基团，所述核糖基团具有以N-糖苷连接连接到核糖基团1’位的含氮碱基。

本文中使用的词组“药学上可接受的载体”是指用于将本文公开的组合物递送至动物体或者人体的药学上可接受的盐、溶剂、悬浮试剂或者介质。所述载体可以是液体、半固体或者固体，通常与稀释液、赋形剂或者盐同义。词组“药学上可接受的”是指本文公开的成分、赋形剂、载体、稀释液或者组分适合用于人体和/或动物体，没有过度有害的副作用(例如毒性、疼痛和过敏反应)，具有合理的益处/风险比率。参见Remington’sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed(1980)。

本文中使用的术语“大约”是指特定数值±20％的数值。因此，“大约60％”是指60±(60的20％)之间的数值(即48和70之间)。

本文中使用的“包含”与“包括”、“含有”或者“特征是”同义，是包括性或者开放式的，并且不排除额外的、未引用的要素或者方法步骤。本文中使用的“由...组成”排除权利要求要素中未说明的任何要素、步骤、成分。本文中使用的“基本由...组成”不排除对所宣称之基本和新型特性影响不大的材料或者步骤。在本文任何情况下，术语“包含”、“基本由...组成”和“由...组成”中的任何一个均可以被其他两个术语之一替换。本文中说明性描述的公开内容可以适于在本文中没有具体公开之任何要素、限制不存在的情况下进行操作。

在一些实施方案中，测试shRNA靶向HCV IRES序列的方法包含在对具有足够活性(例如序列选择组之间的最高活性)以候选用于治疗的序列进行鉴定的方法中。测试还可以包括筛选具有不期望有的脱靶效应、IFN诱导或者普遍毒性效应的shRNA。脱靶效应包括但不限于非靶基因敲低、非靶基因表达抑制和与天然微小RNA途径竞争。鉴定毒性效应的方法是本领域已知的。

在一个实施方案中，本文中描述的shRNA包含与丙肝病毒(HCV)内部核糖体进入位点(IRES)元件序列互补的序列。

使用双报告基因荧光素酶质粒，其中萤火虫荧光素酶(fLuc)的表达依赖于HCV IRES。海肾荧光素酶的表达不是HCV IRES依赖性的，其在Cap依赖性过程中翻译。在293FT和Huh7细胞中直接转染HCV IRESshRNA有效地阻断HDV IRES介导的fluc表达。包含双突变的对照shRNA对fLuc表达几乎没有或者没有作用，并且仅包含单个突变的shRNA显示部分抑制。还在小鼠模型中对这些shRNA进行评估，其中通过尾静脉水动力学转染将DNA质粒递送至肝脏细胞中。使用双荧光素酶表达质粒、shRNA和分泌型碱性磷酸酯酶质粒将细胞转染到肝脏细胞中；并且在12至96小时期间的时间点对动物体进行成像。体内成像显示由直接的或者可选地从polIII-质粒载体中表达的HCV IRES shRNA抑制HCV IRES依赖性报告基因的表达；突变或者无关的shRNA几乎没有或者没有作用。这些结果表明以RNA递送的或者从病毒或非病毒载体中表达的shRNA可以用作控制HCV和相关病毒的有效抗病毒物质。

为了进一步研究RNAi活性和合成shRNA结构之间的关系，对多种shRNA，断裂shRNA和具有与HCV IRES序列互补之引导链序列的T形RNA以及包含相同序列的相应合成siRNA进行抑制活性、IFN和细胞毒性的测试。大部分受试质粒显示高水平的RNAi活性。总的来讲，引导链位于发卡5’端的shRNA比相同shRNA位于3’端的shRNA更有效。接着对具有5’引导链的shRNA的结构变体进行进一步研究。

还对shRNA环区域的大小和序列进行研究。环可以小至1个核苷酸，对shRNA活性影响不大，并且对环大小没有明确上限；一般环在2至10个核苷酸之间，并且一般其序列不会造成意外影响，例如与非靶基因互补。但是，引导链位于发卡5’端的shRNA优选短环。具体地，在具有10-、5-或者1-核苷酸环的shRNA之间，2-核苷酸环(5’-UU-3’)为shRNA提供最高效力。环前面紧接的封闭碱基对对于短环保持shRNA高功能性(例如2-核苷酸环)十分重要，但是对于长环(5-核苷酸环)不是十分重要。因此，UU环前面紧接着具有“CG封条”(可以增强双链形成)之shRNA比具有AU碱基对之shRNA的IC₅₀值低4.6倍(图5B)。在另一个方面中，环可以包含引导链的3’部分，其与过客链的5’端直接相连，不影响shRNA的基因敲低活性。在这种情况下，环长度是2至8个核苷酸之间。

环结构还可以包含脱氧核糖核苷酸、非核苷酸单体和可逆连接，所述可逆连接例如通过引入核苷酸残基之SH基团氧化形成的S-S键，例如(Earnshwaw等，J.Mol.Biol.，1997，274：197-212；Sigurdsson等，Thiol-containing RNA for the study of Structure and Function of ribozymes.Methods：A Companion to Methods in Enzymology，1999，18：71-77)中所描述。

ShRNA中的双链长度也影响对靶基因的抑制。具有从3’端缩短之过客链(长度缩短至17或者16个核苷酸)而引导链保持为19个核苷酸的shRNA沉默效率显著减少。从5’端缩短过客链而使引导链保持为19个核苷酸不会影响shRNA的活性。有趣的是，如果引导链长度保持为19核苷酸，过客链长度短至11个核苷酸(从5’端缩短)的shRNA保留一些活性。与具有19个碱基对双链的shRNA相比，过客链和引导链均缩短(每个长度为18个核苷酸，形成18个碱基对的双链)的shRNA显示出非常相似的效力。可以将某些位点的单个错配引入shRNA的双链区域而不影响其效力。

还对断裂shRNA和T形RNA进行测试，如实施例6中所显示，观察到了高水平的RNAi活性。

当本发明中提供范围(例如温度范围、时间范围、序列一致性百分数、序列互补性范围、长度范围、或者组合物或浓度范围)时，所有中间范围和亚范围以及包含在特定范围中的所有单个数值均包含在本文公开的内容内。

通过下列实施例对本发明进行进一步阐述。仅以说明性目的提供这些实施例。其不能以任何方式构成对本发明范围或者内容的限制。

实施例

实施例1：为了提高靶敲低效力对shRNA结构进行优化

为了鉴定具有增强之靶敲低效力的shRNA结构，由IDT(Coralvilled，IA)化学合成3组(shRNA68、shRNA72、shRNA74)具有5’-过客链(右手环)的shRNA和3组具有5’-引导链(左手环)的shRNA，重悬于Rnase-和无热原缓冲液中(Dharmacon)并且对其进行评估；具体地，其是：

具有5’-过客链-5-nt环-引导链-3’结构的shRNA(SG68、SG72和SG74)

具有5’-引导链-5-nt环-过客链-3’结构的shRNA(SG68L、SG72L和SG74L)

这些shRNA的序列显示于表1中。shRNA环以下划线示出。形成3’悬端的核苷酸以小写字母表示。

表1：靶向HCV IRES的shRNA序列列表

人293FT(Invitrogen)细胞培养于含有10％热灭活胎牛血清(Hyclone)并且添加了2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的DMEM中。转染前一天，将细胞接种于96孔板，每孔23,000个细胞，使得转染时的融合度大约为80％。利用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据厂商说明转染细胞。具体地，将指定浓度的合成shRNA样品(例如10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003nM)、13ng DNA质粒pSG154m(包含HCV IRES靶序列和萤火虫荧光素酶报告基因序列)、20ng pSEAP2-对照质粒(BDBiosciences Clontech，作为转染对照)与0.25μl Lipofectamine 2000在OptiMem(Invitrogen)中混合，并且一式三份引入293FT细胞。48小时后，移去上清液，于65□加热5-30分钟，并且将5-10μl上清液加入150μl p-硝基苯基磷酸盐液体底物***(pNPP，Sigma)。于室温孵育30-60分钟后，在Molecular Devices Thermomax微量滴定板读取仪上读取样品并利用SOFTmax软件(Molecular Devices)进行定量。将剩余细胞裂解，并利用MicroLumat LB 96P光度计(Berthold)测定荧光素酶活性。

这些实验的结果显示于图3A-3C中。3个shRNA之一，sh68，显示使用左手环(而不是右手环)时的效力高接近30倍。其他2个shRNA，特别是sh72，没有显示具有右手环和左手环的shRNA之间效力显著不同。

为了鉴定与具有5’-引导链的shRNA效力增强相关的关键性质，利用Oligo 4.0程序对具有5’-过客链之shRNA和具有5’-引导链之shRNA的内部稳定性进行计算。仅计算了5’链的19个碱基。

计算结果显示于图3D-3F中，结果显示具有左手环的sh72中活性没有增加可能是序列特异性的，并且至少部分地由于5’末端内部稳定性的不同。具有右手环和左手环之shRNA 5’端的内部稳定性在sh68中互相非常接近，而在sh72中则不是。可能具有左手环的shRNA使引导链容易进入并且能够促进优先使用引导链，因为引导链位于5’端并且具有5’磷酸酯基团，所述5’磷酸酯基团是与RISC中的Dicer和Ago2结合的先决条件。当具有右手环和左手环的shRNA之间5’端的内部稳定性显著不同时，该优势消失。

实施例2：鉴定最佳环结构和shRNA的封闭碱基对

以前对Sh19-3的环结构进行了研究(如WO2007/032784中所描述，具体通过引用列入本文)。为了比较与sh19-3靶向相同IRES区域之SG68L和SG68的效力增强，对环结构进行重新检测。多种环结构对293FT细胞中HCV IRES介导之报告基因表达的抑制作用描述于实施例1中。结果显示于图4中。所有样品中的SEAP水平是一致的，表明当shRNA浓度是0.003nM至0.3nm时，可以进行有效转染并且不存在非特异性抑制作用或者毒性效应。

利用与siRNA 19-3(si19-3)靶向相同IRES区域的shRNA首先对环长度进行研究。ShRNA的结构是5’-引导链-环-过客链-3’(左手环)。双链长度是19个碱基对，过客链3’末端具有UU悬端。具有多种环长度的ShRNA序列列于表2中。ShRNA环以下划线示出。3’悬端核苷酸以小写字母表出。

对具有10-核苷酸环(SG113，5’-CUUCCUGUCA-3’)、5-核苷酸环(SG68L，5’-CAAUA-3’)、2-核苷酸环(SG142，5’-UU--3’)和1-核苷酸环(SG114，5’-U-3’)之shRNA的剂量反应进行检测，结果显示于图4A中。与具有5’-过客链(右手环)的shRNA(Vlassov等，Oligonucleotides17：223-236，2007)结果不同，具有5’-引导链(左手环)的shRNA当环大小非常小时(1-或者2nt)比较大时(5或者10nt)具有较高效力(图4A)。由于使用了3种不同的环序列(包括一种来源于miR-23微小RNA结构的序列)，因此环序列可能不影响shRNA的活性。SG142(左手5’-UU--3’环)的IC₅₀低至4.6pM，比靶向相同区域的siRNA19-3更有效力。具有右手环的shRNA在环紧接邻近处具有A:U碱基对，而具有左手环的shRNA在相同位置具有C:G碱基对。事实上，这些碱基对可能不是从2-nt环释放潜在张力的碱基配对。如果是这样，SG118的C:G碱基对可能参与四环结构(CUUG)，该结构比SG103的4-nt环AUUU更加稳定。有趣的是，形成四环的SG118具有最低的IC₅₀(图4B，SG118)。这些shRNA之间双链区域的序列是相同的并列于表2中。

为了使环能够抵抗核糖核酸内切酶的切割，对以2’-二核苷酸TT作为环进行测试。用TT(SG112)代替环序列UU(SG142)时，检测出活性没有显著减少(图4C)，表明可以对环应用脱氧置换，以使其抵抗核糖核酸酶，并且不会损失功能活性。这还表明Dicer或者任何其他核糖核酸内切酶均不参与19-bp shRNA的加工过程，因为脱氧核糖核苷酸不能被RNase切割，除了可能切割二核苷酸的5’端。

这些shRNA的序列显示于表2中。sh环以下划线示出。3’悬端核苷酸以小写字母表示。

表2：具有多种环结构和封闭碱基对的sh序列列表

实施例3：研究效力与shRNA悬端和双链长度之间的关系

Vlassov等发现3’-UU悬端的存在能够增加19-bp shRNA的效力(Vlassov等，2007)。以前研究中使用的shRNA具有右手环(5’-过客链-环-引导链-3’)。因此，位于引导链3’端的UU悬端可能有助于Ago PAZ结构域与引导链3’-UU悬端结合。由于具有左手环(5’-引导链-环-过客链-3’)的shRNA显示能够较好地抑制靶基因，因此对位于过客链3’端的UU悬端对shRNA效力的影响进行检测。如图5A中所显示，缺少3’-UU序列(SG105)的shRNA和具有脱氧核糖核苷酸3’-TT悬端的shRNA与具有3’-UU悬端的相应shRNA具有非常相似的效力。

还研究了茎长度对shRNA的影响。如图5B中所显示，使过客链缩短至17-或者16-nt同时使引导链长度保持在19-nt使基因沉默活性显著降低(SG115和SG116)。但是使两条链的长度同时缩短至18-nt对效力没有显著影响(SG117)。令人惊奇的是，茎短至16-bp的shRNA(SG119，具有19-nt引导链和17-nt过客链)显示与具有17-bp茎的shRNA(SG117)相似的抑制能力(图5C)。但是具有15-bp茎的shRNA(SG131)开始显示出抑制活性降低(图6A)。这表明高水平的沉默活性需要双链长度为16-bp或者更高。

为了测试极端情况，对具有11-bp双链和8-nt环的shRNA(SG120，19-nt引导链与11-nt过客链直接连接)进行测定(图5C)。尽管与其他相比效力较低，短RNA发卡仍然具有少于200pm的IC₅₀。类似地，具有13-bp 双链和6-nt环的shRNA(SG134，19-nt引导链与13-nt过客链直接连接)显示出相同水平的靶敲低作用(图6B)。使过客链进一步缩短至10-nt使沉默作用显著降低。使过客链从发卡的3’端改变至5’端(SG135)使沉默作用消失(图6B)。

为了检测悬端和茎长度的影响是否是序列特异性的，对2种靶序列(不是图5和6中使用的序列)进行测试(图7A和7B)。去除3’-UU悬端不能使发卡的靶沉默作用显著降低。茎缩短至18-bp(SG139)或者16-bp(SG136)使发卡的靶敲低能力降低，表明这种茎缩短方法具有某些程度的序列依赖性。

这些shRNA的序列显示于表3中。shRNA环以下划线示出。3’悬端的核苷酸以小写字母显示。

表3：具有多种双链结构的sh列表

实施例4：研究19-bp shRNA中单个错配之位置和类型的影响

已经表明siRNA的引导链和过客链均可以结合至RISC复合体中。这对shRNA的引导链和过客链也是适用的。由于如果过客链(特别是种子区域)与编码区域或者信使RNA的3’-UTR互补，通过Ago选择过客链会诱导不期望有的作用，因此从过客链5’端第4位至第7位进行单个突变。

如图8A和8B中所显示，这些突变不能显著影响具有长度均为19-核苷酸的两条链、3’UU悬端和UU环之shRNA的效力，此外，这种具有单个错配时活性的保持似乎与错配类型无关(例如U-U(SG110)＝U-C(SG126))，表明这种特性是序列非依赖性的。

这些shRNA的序列显示于表4中。shRNA环以下划线示出。3’悬端的核苷酸以小写字母显示。错配核苷酸以斜体显示。

表4：过客链具有单个错配的shRNA序列列表

实施例5：研究单体和二聚体对shRNA效力的影响

在非变性聚丙烯酰胺凝胶中发现由IDT合成并经HPLC纯化的shRNA包含3种主要类型：单体、二聚体和三聚体。相反，在变性条件下(含有8M尿素和20％甲酰胺的12％聚丙烯酰胺凝胶)，混合物仅显示单一的主要条带。当将shRNA于95□加热4分钟并在冰浴中快速冷却时，单体、二聚体和三聚体的混合物能够大部分转化成为单体(图9B和图10B)，并且在293FT细胞中单体shRNA仍然是IRES依赖性荧光素酶表达的强烈抑制物，虽然比混合物稍弱(图9A)。当使shRNA缩短至16-核苷酸(SG119)并且该分子的二聚体形成理想的双链结构(无凸起或者错配)时，单体比单体-二聚体混合物具有较好效力(图10A)。这可能是由于事实上Dicer不能对二聚体进行有效切割或者会形成多种切割产物。但是，当shRNA非常短(11个碱基对，引导链剩余部分形成环(SG120))时，可能以二聚体形式的混合物比仅以单体形式的发卡结构更具活性(图10A)。但是甚至以纯单体形式，SG120高效地使靶基因表达减少，其IC₅₀为98.6pM。

实施例6：鉴定能够增强功能性的shRNA最佳构型

为了鉴定能够增强基因敲低作用的最佳shRNA构型，合成靶向IRES相同区域的3种shRNA并对其进行评估。

a.SG68L：5’-引导链-CAAUA(环)-过客链-3’

b.SG146：两个RNA分子的退火产物。SG146-1，5’-引导链-CAAUA(环)-部分过客链-3’；SG146-2，5’-与引导链互补的部分过客链

c.SG142：5’-引导链-UU(环)-过客链-3’

将不同浓度(0.3、0.1、0.03、0.01和0.003nM)的shRNA样品、13μgDNA质粒pSG154m(含有靶序列HCV IRES和报告基因序列萤火虫荧光素酶)和pUC19(补至相同量的核酸)与0.25μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)在OptiMem(Invitrogen)中混合，并引入293FT细胞中(96孔板中每孔23,000个细胞)。48小时后利用光度计测定萤火虫荧光素酶基因表达的敲低作用。

这些实验的结果显示于图11中，其表明：1)具有2-核苷酸环的shRNA(SG142)比具有5-核苷酸环的shRNA(SG68L)效力稍高；和2)由两种分子退火形成的shRNA(SG146)具有强敲低功能性。

这些shRNA的序列显示于表5中。sh环以下划线示出。3’悬端的核苷酸以小写字母显示。

表5：具有多种环结构和封闭碱基对的shRNA序列列表

实施例7：研究肝细胞瘤细胞株中shRNA的沉默作用

用实施例1中描述的类似方法进行这些实验，除了将细胞株变成肝癌细胞株Huh7(图12)。将多种浓度的3种shRNA进行比较，包括SG68、SG68L和阴性对照SG101(序列：5’-CGU GCU UAG GAU UUG GAG UCAAUA ACU CCA AAU CCU AAG CAC GUU-3’)。在用SG101转染的细胞中发现萤火虫荧光素酶没有减少。与293FT细胞中的结果一致，肝癌细胞中SG68L比SG68更有效地使靶基因表达沉默。

实施例8：shRNA的高效力不是由于IFN应答或者细胞毒性

一些siRNA或者shRNA能够诱导IFN应答和/或脱靶效应。为了研究上面测试的shRNA是否具有这些不期望有的特点，shRNA转染后对IFN响应基因OAS1进行测定。具体地，通过密度梯度离心从血块黄层中制备PBMCs，清洗，并随后重悬于含有10％热灭活胎牛血清的RPMI 1640中。在24孔板中以每孔5×10⁵个细胞培养细胞，接着用shRNA(20nM，大约170至180ng)/DOTAP(1.5μl，Roche)混合物转染24小时。随后在Trizol(Invitrogen)中裂解细胞，并根据厂商说明提取总RNA。利用High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kits、TaqMan Universal PCR Master Mix、OAS1(Hs00242943_m1)和GAPDH(Hs99999905_m1)Taqman探针以及Fast7500实时PCR仪(Applied Biosystem)根据厂商说明进行qRT-PCR。

如图13A中所显示，与未经处理的阴性对照相比，转染了DOTAP的每孔中加入18ng(与每孔的sh量相等)阳性对照多聚核苷酸(I:C)使得OAS1表达增加了10.6倍。但是，没有shRNA使OAS1增加，表明人PBMC中没有诱导IFN。

还通过测定shRNA转染后进入人肝癌细胞株(Huh7)中的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴(MTT)对细胞毒性进行测定。利用Lipofectamine 2000(LF2K，Invitrogen)将10nm shRNA和靶DNA一起转染前一天接种于96孔板(13,000细胞/孔)的Huh7细胞。多聚核苷酸(I:C)(33ng)用作阳性对照。48小时后，将16μl/孔的MTT(Hepes缓冲盐溶液中，5mg/ml)加入到培养基中。细胞进一步孵育3小时，接着用酸性异丙醇(0.04N HC1)裂解。利用Molecular Devices Thermomax微量滴定板读取仪于570nm测试波长和650nm参照波长下测定溶解的甲瓒水平，并利用SOFTmax软件(Molecular Devices)进行定量。

如图13B中所显示，相对于阴性对照lipofectamine中的质粒DNA，没有发现明显的细胞死亡。阳性对照lipofectamine中的poly(I:C)诱导大于50％的细胞死亡。总之，上面测试的shRNA显示在人PBMC和肝癌细胞中无IFN和无明显的细胞毒性。

实施例9：双链长度为19个或者更少碱基对的shRNA不是Dicer的底物

为了研究双链长度为19个或者更少碱基对的shRNA是否能够被Dicer切割，选择几种shRNA进行体外Dicer切割分析。用双链长度为25个碱基对的shRNA(sh1，5’-GGGAGCACGAAUCCUAAACCUCAAAGACUUCCUGUCAUCUUUGAGGUUUAGGAUUCGUGCUCUU-3’)作为阳性对照。具体地，将所有的合成shRNA溶解于含有20mM KCl、6mMHEPES-KOH(pH 7.5)、0.2mM MgCl₂的缓冲液中至终浓度为5μM。为了确定所有分子均形成发卡单体，将shRNA加热至95□4min，接着立即转移至冰水浴中冷却～10-20min，以便进一步使用。8pmol每种shRNA在存在1U重组Dicer酶(Stratagene，产品号#240100)和1×缓冲液(含有150mMNaCl、20mM Tris-HCl(pH 8)和2.5mM MgCl₂)的10μl反应体系中于37□孵育18小时。含有每种shRNA但是缺少dicer酶的对照反应平行地进行孵育。

通过10％非变性PAGE(图14A)和12％变性PAGE(8M尿素/20％甲酰胺)(图14B)对样品进行分析，并用SYBR Gold(Invitrogen)进行染色。如图14中所显示，含有长度为25个碱基对的双链、10-核苷酸环以及5’-和3’-悬端的sh1 RNA被Dicer切割，产生大小为20至25个碱基对的产物。所有其他被测shRNA，包括茎为19个碱基对并且发卡长度为2或5个核苷酸的3种shRNA以及茎为18个碱基对并且发卡为2个核苷酸的1种shRNA，在非变性和变性PAGE中均未显示任何切割产物。这些结果表明，双链长度为19个碱基对或者更少的短发卡结构不是Dicer的底物。

其他实施方案

应当理解，本发明与其详述一起描述，上述描述是说明性的，不能作为对本发明范围(即所附权利要求限定的范围)的限制。其他方面、优点和修饰在下列权利要求的范围内。

Claims

1.一种RNA分子，其包含：

由15个核苷酸至30个核苷酸组成的第一RNA序列，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；

第二RNA序列，其包含与所述第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列的长度在10个核苷酸之间，并且比所述第一序列的长度少1个核苷酸；

可选地位于所述第一序列和所述第二序列之间的环序列，所述环由1至100个核苷酸组成；以及

可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

2.一种RNA分子，其包含：

由16个核苷酸至30个核苷酸组成的第一RNA序列，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；

第二RNA序列，其包含与所述第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列比所述第一序列多至少一个核苷酸，并且所述第二序列不多于100个核苷酸；

可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

3.一种RNA分子，其包含：

由16个核苷酸至18个核苷酸组成的第一RNA序列，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；

第二RNA序列，其包含与所述第一序列至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列具有与所述第一序列相同的核苷酸数量；

可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

4.一种RNA分子，其包含：

由19个核苷酸组成的第一RNA序列，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；

第二RNA序列，其包含与所述第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列由17个核苷酸或者18个核苷酸组成；

可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

5.一种RNA分子，其包含：

第二RNA序列，其包含与所述第一序列的至少一部分至少部分地互补的序列，所述第二序列具有与所述第一序列相同或者更少的核苷酸数量；

可选地位于所述第一序列和所述第二序列之间的环序列，所述环由1个核苷酸组成；以及

可选地由1至2个核苷酸组成的核苷酸悬端。

6.如权利要求1-5任一项所述的RNA分子，其中所述第二序列包含与所述第一序列的至少一部分具有至少85％互补性的序列。

7.如权利要求6所述的RNA分子，其中所述第二序列包含与所述第一序列5’端部分具有至少85％互补性的序列。

8.如权利要求6所述的RNA分子，其中所述第二序列3’端的序列与所述第一序列5’端部分具有至少85％的互补性。

9.如权利要求1-8任一项所述的RNA分子，其中所述RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸。

10.如权利要求1-8任一项所述的RNA分子，其中所述环包含至少一个非核苷酸分子。

11.如权利要求1-8任一项所述的RNA分子，其中所述RNA分子的3’端包含悬端。

12.如权利要求1-8任一项所述的RNA分子，其中所述RNA分子在所述第一序列和所述第二序列之间包含1个或者2个错配。

13.如权利要求1-8任一项所述的RNA分子，其中所述第一序列在所述第二序列的3’方向。

14.如权利要求1-8任一项所述的RNA分子，其中所述第一序列在所述第二序列的5’方向。

15.如权利要求1所述的RNA分子，其中所述分子能够抑制所述靶核苷酸序列的表达。

16.如权利要求1所述的RNA分子，其中所述靶核苷酸序列是病毒序列。

17.如权利要求16所述的RNA分子，其中所述病毒序列是丙肝病毒序列。

18.如权利要求1所述的RNA分子，其中所述靶核苷酸序列是丙肝病毒内部核糖体进入位点(IRES)序列中的序列。

19.一种RNA分子，其包含：

由大约5个核苷酸至大约15个核苷酸组成的第一RNA序列，其中所述第一序列与靶核苷酸序列至少部分地互补；

第二RNA序列，其能够与所述第一序列形成发卡结构，所述发卡结构包含大约23个核苷酸至大约100个核苷酸，并且所述第二序列包含：

第一区域，其与所述第一序列具有至少80％的互补性并且能够与所述第一序列形成少于19个碱基对的第一双链区域；

与所述第一区域相连的第二区域；

与所述第二区域相连的第三区域；和

与所述第三区域相连并具与所述第二区域具有至少80％互补性的第四区域，所述第四区域能够与所述第二区域形成第二双链区域，以使所述第三区域在与所述第二双链区域相邻处形成环并且所述第一双链区域和所述第二双链区域的长度总和少于23个碱基对；以及

可选地位于所述RNA分子5’或者3’端少于大约6个核苷酸的悬端。

20.一种T形RNA分子，其包含与靶核苷酸序列至少部分地互补的第一RNA序列、第二RNA序列和第三RNA序列，其中

所述第一序列包含具有大约18个核苷酸至大约29个核苷酸并且与所述第二序列的第一区域具有至少80％互补性的第一区域；

第一序列进一步包含具有大约4个核苷酸至大约10个核苷酸并且与所述第三序列的第一区域具有至少大约90％互补性的第二区域；

第二序列包含具有大约18个核苷酸至大约29个核苷酸并且与所述第一序列的第一区域具有至少大约80％互补性的第一区域；

第二序列进一步包含具有大约4个核苷酸至大约10个核苷酸并且与所述第三序列的第二区域具有至少大约90％互补性的第二区域，其中所述第三序列的第二区域与所述第三序列的第一区域是3’相邻的；和

21.一种RNA分子，其包含SEQ ID NO：1-39的任意一种RNA序列。

22.一种DNA序列，其包含编码权利要求1至21任一项所述的RNA的序列。

23.一种表达载体，其包含权利要求22所述的DNA序列。

24.一种逆转录病毒载体，其包含权利要求22所述的DNA序列。

25.一种组合物，其包含权利要求1至21任一项所述的RNA分子和药学上可接受的赋形剂。

26.一种组合物，其包含一种载体，所述载体包含编码权利要求1至21任一项所述的RNA的序列。

27.一种抑制基因表达或者基因活性的方法，所述方法包括使表达该基因的细胞与权利要求1-21任一项所述的RNA分子相接触，其中第一RNA序列与由所述基因的至少一部分编码的靶核苷酸序列至少部分地互补。

28.一种抑制丙肝病毒表达或者活性的方法，所述方法包括使表达丙肝病毒的细胞与权利要求1-20任一项所述的RNA分子相接触，其中第一RNA序列与丙肝病毒序列至少部分地互补。

29.一种抑制丙肝病毒表达或者活性的方法，所述方法包括使表达丙肝病毒的细胞与权利要求21所述的RNA分子相接触。

30.如权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述细胞在哺乳动物中。

31.如权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

32.如权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是非人灵长类动物。

33.如权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述RNA分子不诱导IFN应答。