JP2012505657A - 遺伝子発現の阻害のためのショートヘアピンrna - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国国立衛生研究所(the National Institutes of Health)からのNIH補助金R44AI056611(BHJ)によって援助された作業の間に部分的になされた。政府は本発明において特定の権利を有し得る。
本発明は、ウイルス遺伝子発現、例えば、ショートヘアピンRNA(shRNA)を用いる、C型肝炎IRES媒介性遺伝子発現の阻害に関する。
RNA干渉(RNAi)は、分解および翻訳減衰のために、二本鎖RNA(dsRNA)を使用してメッセンジャーRNA(mRNA)を標的とする細胞プロセスである。このプロセスは遺伝子特異的であり、標的配列の小さな変化に不応性であり、そして多重遺伝子標的化が受け入れ可能である。この現象は1990年に植物において最初に報告された(Napoli,C.,et al.,Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co−suppression of homologous genes in trans.Plant Cell,1990,2(4):279−289)。これは後に、真菌および蠕虫を含む他の生物において観察された(Romano,N.,et al.,Quelling:transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.Mol.Microbiol.,1992,6(22):3343−53)。機構的には、長いdsRNAは、III型RNaseであるDicerによって短い干渉RNA(siRNA)二重鎖に切断できる。続いて、これらの小さな二重鎖が、ヘリカーゼ活性と相同転写物の分解を媒介するエンドヌクレアーゼ活性の両方を含むマルチサブユニット複合体であるRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)と相互作用する。約19〜29bpの合成siRNAが哺乳動物細胞および動物において遺伝子発現を効果的に阻害できるというこの発見が、治療剤としてこれらの阻害剤を開発するための相次ぐ活動をもたらした(Elbashir,S.M.,et al.,Duplexes of 21−nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature,2001,411(6836):494−8)。アルゴリズムに基づく合理的設計選択を含む、高度なsiRNA選択法の最近の進歩は、鍵となる配列および標的配列非依存的である熱力学的パラメーターによって潜在的なsiRNA二重鎖を研究者が選択することを可能にする(Khvorova,A.,et al.,Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias.Cell,2003,115(1):209−216)。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な方法および材料は本発明の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料は以下に説明される。GenBankデータベース配列を含む、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示のみであって、限定することを意図しない。
標的ノックダウンにおける効力が増加したshRNA構造を同定するために、5’−パッセンジャー鎖(右側のループ)を有する3セットのshRNA(shRNA68、shRNA 72、shRNA 74)および5’−ガイド鎖(左側のループ)を有する3つが、IDT(Coralvilled,IA)によって化学合成され、RNaseおよびパイロジェンを含まない緩衝液(Dharmacon)に再懸濁され、そして評価された。具体的には以下の通りであった:
構造5’−パッセンジャー鎖−5ntループ−ガイド鎖−3’(SG68、SG72、およびSG74)を有するshRNA
sh19−3のループ構造は(本明細書に具体的に参照により組み込まれるWO2007/032794において記載されるように)以前に研究された。sh19−3と同じIRES領域を標的とするSG68対SG68Lの効力の増強を考慮して、ループ構造が再試験された。293FT細胞におけるHCV IRES媒介性レポーター発現を阻害する能力に対する種々のループ構造の効果は実施例1に記載された。結果は図4に示される。SEAPレベルはすべてのサンプルにおいて均一であり、0.003nM〜0.3nMのshRNA濃度において、効率的なトランスフェクションおよび非特異的阻害または毒性効果の非存在を示す。
Vlassov et al.は、3’−UU突出の存在が19−bp shRNAの効力を増加することを見い出した(Vlassov、et al.2007)。この以前の研究において使用されたshRNAは右側ループを有した(5’−パッセンジャー鎖−ループ−ガイド鎖−3’)。従って、ガイド鎖の3’末端におけるUU突出は、ガイド鎖の3’−UU突出へのAgo PAZドメインの結合を容易にする可能性がある。左側ループを有するshRNA(5’−ガイド鎖−ループ−パッセンジャー鎖−3’)は、より良好な標的遺伝子抑制を示したので、shRNA効力に対する、パッセンジャー鎖の3’末端におけるUU突出の効果が試験された。図5Aに示されるように、3’−UU配列を欠くshRNA(SG105)および突出としてデオキシリボヌクレオチド3’−TTを有するshRNA(SG111)は、3’−UU突出を有する対応するshRNAに非常に類似した効力を有した。
siRNAのガイド鎖とパッセンジャー鎖の両方がRISC複合体に取り込み可能であることが示されてきた。このことは、shRNAのガイド鎖およびパッセンジャー鎖に適用可能であるかもしれない。パッセンジャー鎖(特にシード領域)がメッセンジャーRNAのコード領域または3’−UTRに対して相補的である場合、Agoによるパッセンジャー鎖の選択が望ましくない効果を誘導可能であったので、、単一の変異が、パッセンジャー鎖の5’末端から4位〜7位で作製された。
IDTによって合成され、HPLC精製されたshRNAは、ネイティブポリアクリルアミドゲル中で3つの主要な種:モノマー、ダイマー、およびトリマーを含むことが見い出された。対照的に、変性条件下(8M 尿素および20% ホルムアミドを含む12% ポリアクリルアミドゲル)では、この混合物は単一の主要バンドのみを示した。shRNAが95℃まで4分間加熱され、アイスバス中で迅速に冷却されたときに、モノマー、ダイマー、およびトリマーのこの混合物は、大部分がモノマーに転換でき(図9Bおよび図10B)、モノマーshRNAは、293FT細胞の中で、その混合物よりもわずかに弱いとしても、IRES依存性ルシフェラーゼ発現の強力な阻害剤のままであった(図9A)。shRNAが16ヌクレオチドまで短縮され(SG119)、この分子のダイマーが、バルジまたはミスマッチなしで完全な二重鎖を形成したときに、モノマーは、モノマー−ダイマー混合物よりも良好な効力を有した(図10A)。これは、おそらく、ダイマーがDicerによる非効率的な切断または種々の切断生成物を有したという事実に起因した。しかし、shRNAが極度に短い場合(ループとしての残りのガイド鎖を伴う11塩基対)、ヘアピンは混合物中でより活性であり、おそらく、モノマーのみの型よりもダイマー型であった(図10A)。しかし、純粋なモノマー型においてさえ、SG120は高い効率で標的遺伝子発現を減少させ、98.6pMのIC50であった。
遺伝子ノックダウンの増強を有する最適なshRNA構成を同定するために、IRESの同じ領域を標的とする3つのshRNAが合成され、評価された。
a.SG68L:5’ガイド鎖−CAAUA(ループ)−パッセンジャー鎖−3’
b.SG146:2つのRNA分子からのアニール生成物。SG146−1、5’−ガイド鎖−CAAUA(ループ)−部分パッセンジャー鎖−3’;SG146−2、ガイド鎖に相補的である5’−部分パッセンジャー鎖
c.SG142:5’−ガイド鎖−UU(ループ)−パッセンジャー鎖−3’
細胞系統が肝細胞癌細胞系統Huh7に変更されたこと以外は、これらの実験は実施例1において記載されたものと同様に実施された(図12)。SG68、SG68L、および陰性対照SG101(配列:5’−CGU GCU UAG GAU UUG GAG UCA AUA ACU CCA AAU CCU AAG CAC GUU−3’)を含む、種々の濃度を有する3つのshRNAが比較された。ホタルルシフェラーゼの減少は、SG101でトランスフェクトされた細胞において見い出されなかった。293FT細胞における結果と一致して、SG68Lは、肝細胞癌細胞における標的遺伝子発現のサイレンシングにおいてSG68よりもはるかに強力である。
いくつかのsiRNAまたはshRNAは、IFN応答および/または標的を外れた効果を誘導する。上記に試験されたshRNAがこれらの望ましくない特徴を有したか否かを調べるために、IFN応答性遺伝子OAS1がshRNAトランスフェクションの後で測定された。具体的には、ヒトPBMCが、密度勾配遠心分離によってバフィーコートから調製され、洗浄され、次いで、10%熱不活化ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640に再懸濁された。これらの細胞は、24ウェルプレートのウェルあたり5×105細胞で培養され、次いで、shRNA(20nM、約170〜180ng)//DOTAP(1.5μl、Roche)複合体で24時間トランスフェクトされた。次いで、これらの細胞は、Trizol(Invitrogen)中で溶解し、総RNAは製造業者の指示書に従って抽出された。qRT−PCRは、製造業者の指示書に従って、High−Capacity cDNA Reverse Transcription Kits、TaqMan Universal PCR Master Mix、OAS1 (Hs00242943_m1)およびGAPDH(Hs99999905_m1)Taqmanプローブ、ならびにFast 7500リアルタイムPCR機器(Applied Biosystem)を使用して行った。
19塩基対以下の二重鎖長さを有するshRNAがDicerによって切断できるか否かを調べるために、いくつかのshRNAがインビトロDicer切断分析のために選択された。25塩基対(5’−GGGAGCACGAAUCCUAAACCUCAAAGACUUCCUGUCAUCUUUGAGGUUUAGGAUUCGUGCUCUU−3’)(配列番号40)の二重鎖長さを有するshRNA(sh1)が陽性対照として使用された。具体的には、すべての合成shRNAは、20mM KCl、6mM HEPES−KOH(pH 7.5)、0.2mM MgCl2を含む緩衝液中で5μM最終濃度に溶解した。すべての分子がヘアピンモノマーを形成したことを保証するために、shRNAは95℃で4分間加熱し、次いで、直ちに氷冷バスに移動させ、さらなる使用の前に10〜20分間冷却させた。各shRNAの8pmolが、1Uの組換えdicer酵素(Stratagene、カタログ番号240100)および150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH 8)、および2.5mM MgCl2を含む1×緩衝液の存在下で、10μL反応において、37℃で18時間インキュベートされた。各shRNAを含むがdicer酵素を欠いている対照反応が並行してインキュベートされた。
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は、例示することが意図され、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することは意図されないことが理解される。他の態様、利点、および改変は添付の特許請求の範囲の中にある。
Claims (33)
- RNA分子であって:
15ヌクレオチド〜30ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第1のRNA配列;
前記第1の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、前記第1の配列の長さよりも10ヌクレオチドから1ヌクレオチドの間の少ない長さを有する第2のRNA配列;
任意に、前記第1の配列と前記第2の配列の間に配置され、1〜100ヌクレオチドからなるループ配列;および
任意に、1〜2ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出
を含む、RNA分子。 - RNA分子であって:
16ヌクレオチド〜30ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第1のRNA配列;
前記第1の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、前記第1の配列よりも少なくとも1ヌクレオチド多くを有し、100ヌクレオチドを超えない第2のRNA配列;
任意に、前記第1の配列と前記第2の配列の間に配置され、1〜100ヌクレオチドからなるループ配列;および
任意に、1〜2ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出
を含む、RNA分子。 - RNA分子であって:
16ヌクレオチド〜18ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第1のRNA配列;
前記第1の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、前記第1の配列と同じ数のヌクレオチドを有する第2のRNA配列;
任意に、前記第1の配列と前記第2の配列の間に配置され、1〜2ヌクレオチドからなるループ配列;および
任意に、1〜2ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出
を含む、RNA分子。 - RNA分子であって:
19ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第1のRNA配列;
前記第1の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、17ヌクレオチドまたは18ヌクレオチドからなる、第2のRNA配列;
任意に、前記第1の配列と前記第2の配列の間に配置され、1〜100ヌクレオチドからなるループ配列;および
任意に、1〜2ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出
を含む、RNA分子。 - RNA分子であって:
15〜30ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第1のRNA配列;
前記第1の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、前記第1の配列と同じかまたはそれより少ない数のヌクレオチドを有する、第2のRNA配列;
任意に、前記第1の配列と前記第2の配列の間に配置され、1ヌクレオチドからなるループ配列;および
任意に、1〜2ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出
を含む、RNA分子。 - 第2の配列が、第1の配列の少なくとも一部に少なくとも85%相補的である配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 第2の配列が、第1の配列の5’末端における部分に少なくとも85%相補的である配列を含む、請求項6に記載のRNA分子。
- 第2の配列の3’末端の配列が、第1の配列の5’末端における部分に少なくとも85%相補的である、請求項6に記載のRNA分子。
- RNA分子が少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のRNA分子。
- ループが少なくとも1つの非ヌクレオチド分子を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のRNA分子。
- RNA分子の3’末端が突出を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のRNA分子。
- RNA分子が第1の配列と第2の配列の間の1個または2個のミスマッチを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 第1の配列が第2の配列に対して3’である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 第1の配列が第2の配列に対して5’である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のRNA分子。
- RNA分子が標的ヌクレオチド配列の発現を阻害することが可能である、請求項1に記載のRNA分子。
- 標的ヌクレオチド配列がウイルス配列である、請求項1に記載のRNA分子。
- ウイルス配列がC型肝炎ウイルス配列である、請求項16に記載のRNA分子。
- 標的ヌクレオチド配列が、C型肝炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位(IRES)配列の中の配列である、請求項1に記載のRNA分子。
- RNA分子であって:
約5ヌクレオチド〜約15ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第1のRNA配列;
前記第1の配列とヘアピン構造を形成することが可能であり、前記ヘアピン構造は約23ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドを含む第2のRNA配列であって、
前記第1の配列と少なくとも80%相補的であり、前記第1の配列と、19塩基対よりも少ない第1の二重鎖領域を形成することが可能である第1の領域;
前記第1の領域に結合する第2の領域;
前記第2の領域に結合する第3の領域;および
前記第3の領域に結合し、前記第2の領域と少なくとも80%相補的であり、前記第2の領域と第2の二重鎖領域を形成することが可能であり、その結果、前記第3の領域が前記第2の二重鎖領域に隣接するループを形成し、前記第1の二重鎖領域および前記第2の二重鎖領域の長さの合計が23塩基対未満である、第4の領域
を含む、第2のRNA配列;ならびに
任意に、約6ヌクレオチドより少ないRNA分子の5’または3’末端における突出
を含む、RNA分子。 - T字型RNA分子であって、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的な第1のRNA配列、第2のRNA配列、および第3のRNA配列を含み、ここで、
前記第1の配列は、前記第2の配列の第1の領域に少なくとも80%相補的な約18ヌクレオチド〜約29ヌクレオチドを有する第1の領域を含み;
前記第1の配列は、前記第3の配列の第1の領域に少なくとも約90%相補的な約4ヌクレオチド〜約10ヌクレオチドを有する第2の領域をさらに含み;
前記第2の配列は、前記第1の配列の第1の領域に少なくとも約80%相補的である約18ヌクレオチド〜約29ヌクレオチドを有する第1の領域を含み;
前記第2の配列は、前記第3の配列の第2の領域に少なくとも約90%相補的である約4ヌクレオチド〜約10ヌクレオチドを有する第2の領域をさらに含み、前記第3の配列の第2の領域は前記第3の配列の第1の領域に対して3’で隣接し;および
任意に、約6ヌクレオチドより少ないRNA分子の5’または3’末端における突出
を含む、T字型RNA分子。 - 配列番号1〜39のいずれか1つのRNA配列を含むRNA分子。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載のRNAをコードする配列を含むDNA配列。
- 請求項22に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- 請求項22に記載のDNA配列を含むレトロウイルスベクター。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載のRNA分子および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載のRNA分子をコードする配列を含むベクターを含む組成物。
- 遺伝子の発現または活性を阻害する方法であって、前記方法は、請求項1〜21のいずれか1項に記載のRNA分子と、遺伝子を発現する細胞を接触させることを包含し、ここで、第1のRNA配列は、前記遺伝子の少なくとも一部によってコードされる標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、方法。
- C型肝炎ウイルスの発現または活性を阻害する方法であって、前記方法は、請求項1〜20のいずれか1項に記載のRNA分子と、C型肝炎ウイルスを発現する細胞を接触させることを包含し、ここで、第1のRNA配列は、C型肝炎ウイルス配列と少なくとも部分的に相補的である、方法。
- C型肝炎ウイルスの発現または活性を阻害する方法であって、前記方法は、請求項21に記載のRNA分子と、C型肝炎ウイルスを発現する細胞を接触させることを包含する、方法。
- 前記細胞が哺乳動物である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物が非ヒト霊長類である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNA分子がIFN応答を誘導しない、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
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