CN102239410A - 具有合并的对照和校准区的测试元件 - Google Patents

Abstract

测试元件，特别是处于根据夹层原理操作的免疫学测试条形式的测试元件，其用于对样品中的一种或多种被分析物进行荧光检测，该测试元件包含：被分析物检测区和合并的对照和校准区，其中该合并的对照和校准区包含荧光团和结合配偶体，该结合配偶体用于与用荧光团标记的试剂的特异性结合。此外，本发明涉及用于校准被分析物特异性测量信号的方法，用于测量样品中被分析物浓度的方法，和该测试元件用于校准在测试元件的被分析物检测区所产生的信号的用途。

Description

具有合并的对照和校准区的测试元件

本发明涉及测试元件技术领域，该测试元件用于分析液体样品材料或者能够转化成为液体形式的样品材料。

本发明的主题是一种测试元件，特别是处于根据夹层原理(Sandwichprinzip)工作的免疫学测试条的形式，其用于样品中的一种或多种被分析物的荧光检测，该测试元件包含被分析物检测区(Kalibrationszone)和合并的对照和校准区，其中该合并的对照和校准区包含荧光团和用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体(Bindepartner)。

此外，本发明涉及一种用于校准被分析物特异性测量信号的方法，用于测量样品中被分析物浓度的方法，和该测试元件用于校准在测试元件的被分析物检测区所产生的信号的用途。

测试元件(其具有一个或多个含有固定的反应物的离散区)经常用来检测样品或者样品材料中的被分析物。这些区域在下面称作被分析物检测区、检测区或者检验区。该被分析物依靠与反应物的特异性相互作用而在被分析物检测区中在反应(测试)中从样品结合。该结合事件可以通过测量技术例如通过荧光信号的光学检测来进行检测。该测试元件可以制备成具有微阵列结构，并且是以用于结合反应的位置选择性检测的生物芯片的形式存在，如已公开的申请WO2007/042219和EP1412533中所述。该测试元件还可以是测试条，在其上例如排列着一个或者多个含有固定的反应物检测区，其处于垂直于样品流动方向的条形或者线条的形式。这样的测试条例如描述在WO2008/105814和US2004-0126767中。

标记的结合配偶体被用于检测在被分析物检测区中的反应物和被分析物之间的结合事件。它们是反应物，其包含标记试剂和其与被分析物进行特异性相互作用。荧光团(其在用某些波长的电磁辐射激发后发射出光信号)可以例如被用作标记试剂。这种光信号在被分析物检测区中的可测量性和它的强度表示了样品中被分析物的存在或者是它的浓度的量度。

在免疫学检测方法的情况中，在测试元件上的结合事件是基于特异抗原-抗体相互作用(免疫学测试(immunoassay))的。在根据夹层原理的免疫学检测方法中，典型地将待分析的样品与缀合物(其由标记试剂和被分析物特异性结合配偶体(例如抗体)组成)接触，来在被分析物(如果样品中存在的话)与标记的缀合物之间形成配合物。这些配合物在测试元件上与经固定的反应物(例如抗体)反应，以使得在被分析物检测区中存在着“夹层(Sandwich)”配合物，该配合物由被分析物-缀合物和经固定的反应物组成，其可以依靠标记来检测。这样的免疫学测试的例子描述在US专利US4168146(Grubb等人)和US4366241(Tom等人)中。备选的技术是竞争性测试。在竞争性测试中，标记试剂通常是用结合配偶体来缀合的，该结合配偶体等同于被分析物或者它是被分析物的类似物。以此方式，该标记的缀合物与实际的被分析物竞争对于测试元件上的被分析物检测区中的反应物的结合。如果仅仅单个特异性抗体可用于这种抗原或者如果该抗原不具有足够的结合位置来用于两种抗体的未受阻的结合，则通常使用竞争性测试来检测该抗原。因此，这种测试变体也适于检测半抗原。竞争性测试的例子描述在US专利US4235601(Deutsch等人)，US4442204(Liotta)和US5208535(Buechler等人)中。

免疫学测试条形式的测试元件是广泛使用的助剂，用于快速确定药物，孕激素，传染病或者所谓的“心脏标记物(Cardiac Markern)”例如肌钙蛋白T。就此而言，广泛使用定性测试(其仅仅是目视读出的，并且经常仅仅给出“是-否”回答)和定量测试(其是依靠读出装置来评价的)。

用于免疫学可检测物质的快速测试的许多不同的参数长期以来是已知的，例如从WO97/06439，EP0291194，US5591645，US4861711，US5141850，US6506612，US5458852，US5073484中是已知的。在这些情况中，该免疫学检测试剂(基本上标记的和未标记的抗体或者抗原)通常是以在载体上的干燥形式来提供的，该载体允许在该载体之上或者之内传输样品液体(特别是体液例如血液，血清，血浆，尿，唾液等)。为此目的，该载体优选是毛细管活性的，并且例如是具有毛细管通道的隔膜或者塑料载体(例如诸如US5458852中)。本领域技术人员经常谈到免疫学或者免疫色谱法测试条或者测试装置。这些术语以及表述“载体结合的免疫学测试”或者“载体结合的免疫学测试元件”经常是同义使用的，并且还应当在下面互换使用。

除了用于检测一种或多种被分析物的一个或多个被分析物检测区之外，该测试元件通常具有其中存在着反应物的另外的区域，该反应物与标记的结合配偶体特异性结合。这个区域称作对照区或者指示剂区，并且通过截获标记的结合配偶体，而不需要直接包括被分析物，来充当对于标记的结合配偶体的功能对照。被分析物检测区和对照区通常是窄的空间有限的，并且在测试元件上彼此明确隔开排列的。在测试条形式的测试元件中(在其中样品是以液体形式施加的，并且借助于毛细管力来达到不同的区域)，对照线条形式的对照区通常在被分析物检测区的下游，在流体能够穿过其中的材料之上或者之中。在这样的测试条上，对照区另外的充当了运行对照，来确保该标记的结合配偶体实际上也达到了单独的区域中。该对照区的功能(其作为用于标记的结合配偶体的功能性的对照和作为测试条的功能性的运行对照)也被本领域技术人员称作“对照功能”。

一种测试元件描述在US2007/0048807 A1中，其在多孔隔膜上除了检测区之外还具有指示剂区。材料(接受性材料)被固定在指示剂区中，其与缀合有标记试剂的结合配偶体特异性结合，其没有在被分析物检测区中与被分析物配合。

归因于被分析物检测区和对照区的空间分离，用于分析该被分析物检测区和对照区的空间分辨光学***例如照相机芯片或者二维或者三维光电二极管阵列经常存在于该测量装置中，用于评价该测试元件。该光学***的信号然后通过适当的评价软件转化成浓度值，并且显示。

如果该标记的结合配偶体的标记试剂是荧光团，则除了依靠对照区来对照该标记的结合配偶体的功能之外，还必需校准该被分析物-特异性测量信号。该被分析物-特异性测量信号是这样的信号，其可以在被分析物检测区中由于样品中的被分析物的存在而产生。这种信号的强度取决于该荧光团的激发光谱的入射能量，该荧光团在被分析物检测区中通过被分析物-特异性相互作用而定位的。经验表明通过辐射源所产生的能量进而发生波动，其一方面可以归因于相同类型的不同辐射源之间的与生产有关的变化，或者另一方面在辐射源的使用循环中产生。这样的波动必须进行校正，来用于被分析物的可再现的和可靠的定量测量。这通常是通过用信号(其已经通过荧光团的标准化量而产生)校准该被分析物-特异性测量信号来进行的。该荧光团的标准化量也被本领域技术人员称作荧光团标准或者校准标准。在用电磁辐射激发之后，荧光团标准所发射的辐射通常称作“校准信号”。

在现有技术中用于(半)定量测量被分析物的***中，被分析物-特异性测量信号可以通过在测试元件外面产生校准信号来校准(例如Triage^®，Biosite Inc.)。

另外，存在着这样的***，在其中被分析物-特异性测量信号的校准直接用测试元件来进行。除了被分析物检测区和任选的对照区之外，这样的测试元件还包含与其它区空间分开的另外的离散区域，在其中作为标记试剂的荧光团以规定的量直接布置在该测试元件上。这样的区域在下面称作校准区。测试元件上校准区的存在能够使用相同的测量装置或者分析仪器(其也检测被分析物检测区和/或对照区中的信号)来直接在该测试元件上检测校准信号。在测试条或者微阵列的情况中，该信号检测可以使用相同的空间分辨光学***，作为在被分析物检测区中的被分析物依赖性信号的功能对照和测量来进行。在免疫学测试条中，该校准区可以例如以另外的线条形式存在，该线条垂直于样品(例如CARDIAC读数器，Roche)的流动方向。

测试条上校准区的存在具有这样的优点，即，这个区域中荧光团所需的稳定性被降低到该测试元件寿命程度。相反，如果校准信号打算在测试元件外产生，则用户将不仅必须注意使得该测试条足够耐久，而且还要使分别使用的荧光团标准物耐久，由此在每种情况中必须避免另外的误差来源。在测试元件外产生和检测该校准信号通常需要另外的辐射源、滤光器等和分别的光学评价***，因此相应的分析仪器必须具有更复杂的结构，必须更大和通常还更昂贵。

术语“校准功能”通常还与措词“被分析物-特异性测量信号的校准”相关联来使用。和措词“被分析物-特异性测量信号的校准”一样，术语“校准功能”也是本领域技术人员已知的，并且涉及到这样的手段，即，用于在分析仪器之中例如在测试载体上，或者如上所述在测试载体之外产生校准信号。

借助测试元件还可以用于同时确定样品中的几种不同的被分析物。在这样的“组合测试”的情况中，在测试元件上存在着用于每种被分析物的离散的检测区，该检测区含有被分析物-特异性反应物。因为通常在实验室中或者通过执业医师使用分析仪器来评价不同的测试元件，以确定不同的医学参数，因此相应的测试元件必须具有一致的尺寸，该尺寸在所述仪器方面是标准化的。为此原因，随着测试元件上的被分析物检测区的数目的增加，对照和校准区能够利用的空间越来越小。此外，测试元件本身的尺寸受限于通过通常小的样品体积来充分的润湿测试面积的要求。因为另外校准和被分析物检测区之间必须空间隔开，因此测试元件上的被分析物检测区的数目是受限制的，并因此可以使用一个测试元件来检测的被分析物的数目也是受限制的。在组合测试意义上，为了借助于测试载体来检测尽可能多的被分析物，因此经常必需要进行校准测试元件外的被分析物-特异性测量信号所需的测量。但是，这需要对分析仪器或者测量仪器进行相应的复杂的适配和/或使用另外的测试元件，以及因为上述原因，还需要实验室人员花费更多的时间和努力。

本发明的目标是消除现有技术的缺点。具体地，本发明的一个目标是提供一种测试元件，在其中被分析物-特异性测量信号的校准可以直接用测试元件来进行，并且将对照和校准区在该测试元件上以这样的方式排列，即，它还可以借助于该测试元件来检测许多的被分析物。

这个目标是通过本发明的主题来实现的。

本发明的该主题是根据权利要求1的测试元件，根据权利要求7的用于校准被分析物-特异性测量信号的方法，根据权利要求8的用于测量样品中被分析物浓度的方法和根据权利要求12的用途。本发明优选的实施方案是从属权利要求的主题。

在测试元件中(在其中样品中的一种或多种被分析物的特异性检测是借助于荧光团来进行的)，本发明能够在一个离散的、空间分隔的区域中检测用于对照功能的信号和用于校准功能的信号。本发明提出了除了通常的被分析物检测区之外，将另外的区域排列在测试元件中。这个区域(其在下面称作合并的对照和校准区)是与被分析物检测区空间隔开的存在于该测试元件中的，并且它包含荧光团以及用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体。该合并的对照和校准区和被分析物检测区的空间隔开是以这样的方式进行的，即，该被分析物检测区和合并的对照和校准区每个是作为离散的、空间分隔的区域而存在的。

因此，本发明涉及一种测试元件，其用于对样品中的一种或多种被分析物进行荧光检测，该测试元件包含：

-被分析物检测区，和

-合并的对照和校准区，

特征在于该合并的对照和校准区包含

a)荧光团，和

b)结合配偶体，用于与用荧光团标记的试剂的特异性结合。

合适的荧光团是本领域技术人员已知的。在一种优选的实施方案中，合并的对照和校准区中的荧光团和/或用荧光团标记的试剂的荧光团是荧光染料或者荧光标记。术语荧光染料，荧光标记或者荧光标记物在下面同义使用的。适于本发明的典型的荧光标记可以例如是荧光蛋白质(例如 GFP和它的衍生物)，Cy3，Cy5，Texas Red，荧光素和Alexa染料(例如 Alexa 568)。另外的荧光标记可以例如获自Invitrogen公司。

用荧光团标记的试剂是结合配偶体，其是用荧光团标记的，以使得该结合配偶体能够依靠该标记进行检测。该用荧光团标记的试剂能够与被分析物特异性相互作用。这种相互作用可以是直接或者间接结合的形式。重要的是作为荧光团标记的试剂与被分析物的特异性相互作用的结果，该被分析物可以依靠所述标记来检测。

测试元件上的被分析物检测区的数目受限于该测试元件的面积和受限于必需将该校准区、对照区和被分析物检测区空间隔开，该面积受限于通过通常小的样品体积来充分地润湿测试面积的要求。本发明的该合并的对照和校准区允许在测试元件上具有至少一个另外的被分析物检测区，而用户不必使用另外的测试元件或者另选适宜的更复杂的分析***(其允许仅仅借助于测试元件之外的荧光团标准物来校准被分析物特异性测量信号)。

在本发明的一种实施方案中，该测试元件是生物芯片，在其中被分析物检测区和合并的对照和校准区是以微阵列形式排列的。这样的阵列(其包括“基因芯片”，“蛋白质芯片”，“抗体阵列”等等)是本领域技术人员已知的，并且通常是由聚阳离子，硝化纤维素或者生物素包覆的玻璃载体，覆盖玻璃制造的或者是由隔膜例如硝化纤维素或者尼龙隔膜制造的。

在一种优选的实施方案中，该测试元件是测试条，在其中被分析物检测区和合并的对照和校准区是这样排列的，即，液体可以在所述区域之间传输。为此目的，该测试条典型地通常包含可通流的材料(例如纸张，非织造物，隔膜，毛细通道)，其任选地固定到惰性载体上。

每个测试元件典型地具有一种或多种样品施用区，吸入区，色谱法区，检测区，反应区，对照区和/或校准区。对本发明来说唯一重要的是存在着至少一个(被分析物)检测区和至少一个合并的对照和校准区。

在本发明的一种实施方案中，该被分析物检测区和/或该合并的对照和校准区是以线条或者基本上圆形点的形式存在的。

全部的测试元件适于作为本发明的测试元件，其基于特异性结合反应，并且在其中该特异性结合反应是借助于荧光团所产生的信号来检测的。适当的特异性结合反应是本领域技术人员已知的。它们的例子是结合对：

抗体与半抗原，抗原或者其它抗体(例如物质-特异性(speziesspezifische)抗体-抗体相互作用)，这里在一些情况中，这些物质的各片段是足够的；

生物素与抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白链菌素；

激素与激素受体；

糖与外源凝集素；

核酸与互补核酸等等。

在一种特别优选的实施方案中，该测试元件是根据夹层原理工作的免疫学测试条形式的测试元件。

为了实现本发明的目标，合并的对照和校准区中的荧光团和用在不同的波长和/或在不同的光谱范围发射的荧光团标记的试剂的荧光团是不相关的。因此，在本发明上下文中，合并的对照和校准区中的荧光团与用荧光团标记的试剂的荧光团同样也不必需具有相同的结构。

在本发明的一种优选的实施方案中，合并的对照和校准区中的荧光团与用荧光团标记的试剂的荧光团具有相同的结构元素。这样的结构元素(其是荧光团的特征性)是本领域技术人员已知的。在另外一种优选的实施方案中，合并的对照和校准区中的荧光团与用荧光团标记的试剂的荧光团是相同的。

本发明的一种实施方案是特别优选的，在其中合并的对照和校准区中的荧光团与用荧光团标记的试剂的荧光团可以在基本相同波长激发，并且作为这种激发的结果，发射了波长基本相同的电磁辐射。这种实施方案的优点是在每种情况中，相同的部件(辐射源，波长滤光器等)可以用于激发和检测合并的对照和校准区中的荧光团与用荧光团标记的试剂的荧光团所发射的信号，并因此避免了通常小的和紧凑的实验室仪器的复杂的结构改造。

用荧光团标记的试剂的标记是通过本领域技术人员已知的方法来直接或者间接进行的。在直接标记的情况中，将荧光团直接(共价或者非共价)偶合到结合配偶体上。在间接标记的情况中，将带有标记(共价或者非共价)的第二结合配偶体例如结合到被分析物-特异性结合配偶体上。合适的第二或者第三结合配偶体可以是抗体，第二抗体或者已知的抗生物素蛋白链菌素/生物素***。

用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的该荧光团和该结合配偶体必须以这样的方式存在于该合并的对照和校准区中，即，满足下面的两个要求：

1.在不存在用荧光团标记的试剂时，可以通过特异性激发该合并的对照和校准区中的荧光团，来产生可检测的信号，和

2.在该合并的对照和校准区中存在着用荧光团标记的试剂允许可检测的信号，该信号是在所述区域中存在用荧光团标记的试剂的量度。

为了满足这些要求，用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的该荧光团和结合配偶体是以处于特定误差范围内的特定浓度和量用于该合并的对照和校准区中的。必须对该误差范围进行选择，以使得能够利用对照以及校准功能，并且该校准功能的信号(即，通过合并的对照和校准区中的荧光团所产生的信号)对于对照功能信号(即，用荧光团标记的试剂的信号)的强度没有影响。

在本发明测试元件的合并的对照和校准区中，荧光团的量优选是0.001 µg-5 µg，而用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体的量是1 ng-500 ng。在该合并的对照和校准区中，0.1 µg-1 µg的荧光团量是特别优选的，并且用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体的量特别优选是10 ng-50 ng。

本发明测试元件的一种优选的实施方案包含合并的对照和校准区(其通过该测试元件的浸渍而产生)，特征在于在浸渍(Imprägierung)中该溶液中荧光团的浓度是0.25nmol/ml-2.5nmol/ml，和溶液中用荧光团标记的试剂的浓度是0.01mg/ml-5mg/ml。在该测试元件的一种特别优选的实施方案中，该合并的对照和校准区是通过将该测试元件浸渍以浓度1nmol/ml-2nmol/ml的溶解的荧光团和浓度0.1mg/ml-1mg/ml的溶解的用荧光团标记的试剂来生产的。

浸渍是一种常规方法，用于将测试所需的成分施用到测试元件例如免疫学测试条上的线条形式的测试元件上。有待用于进行浸渍的所述成分在溶液中的量取决于各自测试元件的材料，并且是本领域技术人员已知的。

在一种优选的实施方案中，对合并的对照和校准区中的荧光团和结合配偶体(用于与用荧光团标记的试剂特异性结合)的量或浓度进行选择，以使得对照功能的信号强于校准功能的信号。这意味着对本发明测试元件的合并的对照和校准区中的荧光团和结合配偶体(用于与用荧光团标记的试剂特异性结合)的量或者浓度进行选择，以使得在结合到与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体后，荧光团的数目小于用荧光团标记的试剂的数目。

本领域技术人员能够确定用于各自的荧光团和用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体的这些值，并且能够确定相应的误差范围(其通常会在所用的测试载体和所用的荧光团方面具有某些变型方案)。

在本发明测试元件的一种优选的实施方案中，在合并的对照和校准区中，用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体和/或荧光团经固定。该固定化可以通过本领域技术人员已知的类型和方式进行。该固定化可以基于共价键或者基于非共价键相互作用例如这些相互作用，其例如特征在于抗生物素蛋白链菌素/生物素相互作用***。

在该合并的对照和校准区中，该荧光团和用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体可以直接固定到该测试元件上或者通过结合到测试元件中合适的载体分子或者结合结构上而间接固定。该载体分子可以是例如这样的特异性结合配偶体，其用于所述荧光团和/或用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体，以使得该固定化是作为与载体分子特异性相互作用的结构而非共价发生的。该载体分子本身可以依次依靠另外的结合配偶体/载体分子或者合适的结合结构，来直接或者间接固定到该测试元件上。

对于本发明来说，当该测试元件生产时，或者没有到测量信号校准前不久(例如在其中，荧光团和/或用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体是事先以在合适溶剂中溶解的形式与测试元件在能够固定到该合并的对照和校准区中的条件下进行了接触)，是否已经进行了荧光团和/或用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体在合并的对照和校准区中的定位不是重要的。

适于本发明的被分析物是这样的被分析物，其能够基于特异性结合对关系来检测。对于该测试元件的优选情况，即，处于根据夹层原理起作用的免疫学测试条形式的测试元件的情况来说，这些被分析物特别是抗体，抗原，半抗原(在每种情况中包括其片段)。下面的免疫学可检测的被分析物是特别优选的：hCG，BNP，(NT-)proBNP，肌钙蛋白I，肌钙蛋白T，肌球素，D-二聚体，CRP，HIV，HCV，CD40，CK-MB，TSH等等。

全部的液体样品材料或者能够转化成为液体形式的样品材料都适于本发明，作为被分析物能够从其中测量的样品的形式。特别地，体液例如血液和来自于其的部分(血清，血浆)，唾液，尿，脑脊髓液，***，间质液，汗水等是更合适的。同样合适的是这样的样品材料，其本身不是液体，但是可以通过在溶剂(特别是含水溶剂)中的溶液或者悬浮液，而转变成液体相。

包含在测试元件中的反应物或者打算加入到测试元件中或者加入到样品中的反应物(其也同义的称为“结合配偶体”或者“特异性结合配偶体”)经历了与被分析物的选择性(结合)反应，或者在用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体的情况中，经历了与用荧光团标记的试剂的选择性(结合)反应。它们能够直接或者间接地推出样品中存在的被分析物的量。

优选的结合配偶体是抗体(AK；英文antibodies或AB)，特别是多克隆抗体(PAK，英文polyclonal antibodies或PAB)或者单克隆抗体(MAK；英文monoclonal antibodies或MAB)以及抗原和半抗原及其片段，限定它们对于特异性被分析物检测来说是活性的。

一些反应物或者试剂优选是以这样的方式提供在测试元件上的，即，它们可以通过样品液体来从那里分离，例如通过浸渍合适的载体材料例如非织造物，隔膜等或者通过在适当的(毛细管)通道结构中施用和干燥它们，来从那里分离。

但是，也可以将至少一种反应物或者一种试剂以溶解的形式加入到该测试元件中，例如通过将该溶液加入到样品中或者独立于该样品，将所述溶液施用到测试元件上。根据本发明，虽然不太优选，但是也可以将全部的特异性反应物和/或试剂用于一种溶液中或者几种溶液中，来进行分析。因此在该测试元件上，在被分析物检测区中仅仅有一种另外的反应物，其作为结合配偶体，可以截获作为特异性结合配偶体而特异性结合到被分析物上的反应物，并且其不是用荧光团标记的试剂，因此在测试元件的被分析物检测区中产生了间接结合的被分析物。类似的，在对照区中存在着结合配偶体，其能够截获用荧光团标记的试剂，而不需要直接包括该被分析物。

结合配偶体(用于与用荧光团标记的试剂的特异性结合，其优选固定在合并的对照和校准区中)能够特异性结合该用荧光团标记的试剂。该结合配偶体可以例如是被分析物的类似物，或者在竞争性测试方法的情况中，是这样的抗体，其对着用荧光团标记的试剂(其不是被分析物特异性的)上的某些抗原决定部位。重要的是用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体能够在合并的对照和校准区中截获该用荧光团标记的试剂，而无需直接包括该被分析物。

本发明还涵盖一种使用根据本发明的测试元件和适于评价该本发明测试元件的分析仪器，来校准被分析物特异性测量信号的方法，其包含下面的步骤：

a)在该用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发该荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号，

b)在该合并的对照和校准区中测量步骤a)中所产生的信号，

c)将样品与测试元件和用荧光团标记的试剂接触，以使得可能存在于样品中的被分析物在被分析物检测区中产生可检测的信号；

d)通过激发用荧光团标记的试剂的荧光团，来在被分析物检测区中产生信号，该用荧光团标记的试剂是在被分析物存在下而存在于被分析物检测区中的，

e)在被分析物检测区中测量步骤d)中所产生的信号，

f)建立步骤b)和e)中所测量的信号的联系。

对于该本发明的方法来说，除了本发明的测试元件之外，还提供了一种合适的分析仪器来评价该测试元件。用于此的合适的装置和分析仪器是本领域技术人员已知的。它们例如包括成像/扫描检测***，其能够在一个仪器中测量或者评价来自被分析物检测区的被分析物特异信号和来自对照和校准区的信号。但是，根据本发明，重要的是通过该分析仪器来检测下面的信号：通过被分析物检测区中的荧光团所产生的信号以及通过合并的对照和校准区中的荧光团所产生的信号。作为典型的分析仪器或者测量装置，可以提到的是来自Biosite公司的Triage®分析仪器。

在本发明方法中所产生的信号是电磁辐射，其是在荧光团激发后发射的。该激发通常是如下来进行的：通过用对于所涉及的荧光团来说特征的(激发)波长的电磁辐射来有针对性地照射该荧光团。激发是否用对应于最大激发的波长的电磁辐射来进行或者是用另外一种波长的电磁辐射(限定这种辐射导致发出了可检测的信号，它的强度是激发的荧光团的量的量度)来进行是无关的。

将样品与测试元件和与试剂(其对于被分析物是特异性的)进行接触，和通过与该特异性试剂的相互作用而导致该被分析物(如果存在于样品中的话)在被分析物检测区中产生了可检测的信号，该信号归因于用荧光团标记的试剂。重要的是测量信号的强度取决于样品中被分析物的量。

为了校准该被分析物-特异性测量信号，在该合并的对照和校准区和被分析物检测区中所测量的信号(本发明方法的步骤b)和e))必须彼此相关联。就这点来说，在步骤b)的合并的对照和校准区中所测量的信号充当了用于实际的依赖于被分析物的信号(其是在被分析物检测区中产生的)的参比。在本发明方法一种优选的实施方案中，在合并的对照和校准区和被分析物检测区中所测量的信号是彼此补偿(verrechnen)的。在本发明方法一种特别优选的实施方案中，这两种信号是根据下式来补偿的：

信号(校准的)=信号(被分析物检测区)/信号(对照和校准区)。

在这种情况中，“信号(被分析物检测区)”对应于在本发明方法的步骤d)中所测量的信号，“信号(对照和校准区)”对应于在本发明方法的步骤b)中所测量的信号。

来自该被分析物检测区和合并的对照和校准区的本发明方法的步骤b)和e)所检测的信号的补偿可以例如分析仪器的中心计算器单元中进行。

来自该被分析物检测区和合并的对照和校准区的本发明方法的步骤b)和e)所检测的信号的补偿的结果可以例如与校准曲线进行比较，来确定被分析物浓度。因此，本发明还包含一种使用本发明的测试元件和适于评价本发明的测试元件的分析仪器，来测量样品中被分析物浓度的方法，其包含下面的步骤：

a)在该用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发该荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号，

b)在合并的对照和校准区中测量步骤a)中所产生的信号，

c)将样品与测试元件和用荧光团标记的试剂接触，以使得被分析物―如果存在于该样品中的话―在被分析物检测区中产生可检测的信号；

d)通过激发用荧光团标记的试剂的荧光团，来在被分析物检测区中产生信号，该用荧光团标记的试剂是在存在被分析物情况下而存在于被分析物检测区中的，

e)在被分析物检测区中测量步骤d)中所产生的信号，

f)建立步骤b)和e)中所测量的信号的联系，

g)将来自步骤f)的联系与校准曲线进行比较，

h)基于步骤g)中所进行的比较，来测量被分析物的浓度。

本发明方法所用的校准曲线是通过测量含有已知量的被分析物的标准溶液来获得的；优选在这种方法中，被分析物-特异性测量信号在每种情况中是根据本发明的用于校准被分析物-特异性测量信号的方法来校准的。

对本发明的方法来说，在样品与测试元件接触之前或者之后，是否通过在合并的对照和校准区中激发该荧光团而进行了合并的对照和校准区中信号的产生和测量(本发明方法的步骤a)和b))是不重要的。重要的是在不存在用荧光团标记的试剂(其可以通过固定在合并的对照和校准区中的结合配偶体而特异性结合)的情况下，通过激发固定在该合并的对照和校准区中的荧光团来产生信号。

本发明方法的一种实施方案特征在于在样品与测试元件和用荧光团标记的试剂接触(步骤c))之后，进行在该用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发该荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号(步骤a))和测量该荧光团所产生的信号(步骤b))。因此，例如在将测试载体置于该分析仪器中之前，可以将样品与测试载体和与用荧光团标记的试剂接触。然后在用荧光团标记的试剂例如借助于毛细管作用力达到该测试载体上的合并的对照和校准区之前，产生和测量该校准信号。样品也可以在校准信号产生和测量之前与测试载体接触，而该样品不必与用荧光团标记的试剂接触，例如因为测试载体上不存在用荧光团标记的试剂，和直到该校准信号检测之后才与该样品相接触。

还可以首先将样品与测试元件接触，并且在被分析物检测区中测量该信号(对应于本发明方法的步骤e))。如果该用荧光团标记的试剂然后例如借助于毛细管作用力来达到测试载体上的合并的对照和校准区中，则该用荧光团标记的试剂(其已经通过固定在合并的对照和校准区中的结合配偶体而特异性结合)必须例如通过一种或多种清洗步骤来从该测试载体上除去。然后仅仅应当另外的需要该校准信号，来用于校准在合并的对照和校准区中所产生和测量的被分析物-特异性测量信号(对应于本发明方法的步骤a)和b))。

在本发明方法的一种优选的实施方案中，在合并的对照和校准区中的信号是如下来产生的：在样品与测试元件和用荧光团标记的试剂接触(步骤c))之前，在该用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发该荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号(步骤a))和测量该荧光团所产生的信号(步骤b))。

本发明还涉及本发明的测试元件的用途，其用于校准在测试元件的被分析物检测区中所产生的信号。在本发明用途的一种实施方案中，被分析物-特异信号是借助于另外一种测试元件产生的。

图1表示了根据本发明的测试元件(1)的一种实施方案的顶视图的示意图，该测试元件具有被分析物检测区(14)和合并的对照和校准区(15)。

图2表示了根据本发明的测试元件(1)的一种实施方案的顶视图的示意图，该测试元件具有几个被分析物检测区(14a)，(14b)，(14c)(“组合测试”)和合并的对照和校准区(15)。

图3a表示了在多孔基体(13)上的合并的对照和校准区的一种实施方案的示意图，其含有作为荧光团的固定的g-球蛋白-JG9乳胶(22)和作为结合配偶体的固定的肌钙蛋白T聚半抗原(21)(用于用荧光团标记的试剂的特异性结合)，其中将组成为乳胶JG9荧光团和肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>Lx)的缀合物(23)作为用荧光团标记的试剂结合到固定的肌钙蛋白T聚半抗原(21)上。JG9是方酸衍生物。

图3b表示了被分析物检测区一种实施方案的示意图，在其中被分析物-特异性反应物直接固定到测试元件上。该被分析物检测区的组成为肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>)(24)，其是作为被分析物-特异性反应物直接固定到该测试元件的多孔基体(13)上的。作为被分析物的肌钙蛋白T(25)存在于与固定的MAB<TnT>(24)和与用荧光团标记的试剂(26)的夹层复合体中，其中作为荧光团的JG9-Lx(26b)经由另外的被分析物-特异 结合配偶体(27)而间接的标记了该被分析物。该被分析物-特异性结合配偶体(27)是一种含有洋地黄毒苷(27b)的缀合物，并且用荧光团标记的试剂的间接标记是通过抗-异羟洋地黄毒苷结合配偶体(26c)与被分析物-特异性结合配偶体(27)的洋地黄毒苷(27b)的特异性相互作用来调节的。

图3c表示了被分析物检测区一种实施方案的示意图，在其中被分析物-特异性反应物间接固定到测试元件上。该被分析物检测区的组成为抗生物素蛋白链菌素分子(28)，其直接固定到测试元件的多孔基体(13)上。将夹层复合体结合到该抗生物素蛋白链菌素分子(28)上，该夹层复合体的组成为生物素化的肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>-Bi)(29)，肌钙蛋白T(25)和缀合物，该缀合物的组成为乳胶JG9荧光团和肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB>TnT>-Lx)(30)。该生物素化的肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>-Bi)(29)是被分析物-特异性反应物，肌钙蛋白T(25)是被分析物，并且组成为乳胶-JG9荧光团(30b)和肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>-Lx)(30c)的缀合物(30)代表了用荧光团标记的试剂。

实施例1 制备用于检测肌钙蛋白T的测试元件

测试元件(1)包含衬底(2)，该衬底包含流体的和微流体的以及色谱法的结构。衬底(2)被相应的配合件(Gegenstück)(覆盖层)(图1中未示出)所覆盖，该配合件包含对应于衬底(2)的结构的样品施加孔和通风孔。该衬底是由聚碳酸酯(PC)(环烯烃共聚物(COC)，聚苯乙烯(PS)，ABS塑料或者聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)也可以作为可选的材料)通过注塑而制造的(尺寸大约60 x80mm²)。具有流体结构的衬底(2)的表面可以通过等离子体处理来净化和亲水化。该衬底表面还可以使用洗涤剂来进行化学亲水化。

覆盖层以及衬底(2)具有中心凹进处(3)，其与测量装置中相应的驱动单元相互作用，来使得该盘形测试元件(1)旋转。该测试元件包含样品施加孔(4)，依靠其将样品(特别是全血)加入到该测试元件中。该样品施加孔(4)是与主通道区段(5)流体连接的，该主通道区段(5)包含了被分析物-特异性反应物(6)和用荧光团标记的试剂(7)。被分析物-特异性反应物(6)在这种情况中是生物素化的肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>-Bi)；用荧光团标记的试剂(7)是乳胶JG9荧光团和肌钙蛋白T-特异性单克隆抗体(MAB<TnT>-Lx)的缀合物。JG9是方酸衍生物。

被分析物-特异性反应物(6)和用荧光团标记的试剂(7)是依靠压电计量作为溶液来作为点形试剂点交替引入主通道区段(5)中，并随后干燥，来使得几乎整个内表面被该试剂覆盖。

该试剂溶液具有下面的组成：

被分析物-特异性反应物：

MES： 50mM，pH5.6

BPLA新的： 1%

Synperonic P85： 0.2%

蔗糖： 4%

MAB33： 3mg/ml

MAB33 / Fab'1-poly： 2mg/ml

MAB<TnT>M11.7-F(ab')2-Bi： 100 µg/ml

用荧光团标记的试剂：

HEPES： 50mM pH7.4

PAB<->B-IgG 1%

Synperonic P85 0.15%

蔗糖： 4%

NaCl： 200mM

MAB33： 3mg/ml

MAB33/Fab'1-poly： 2mg/ml

MAB<TnT>M7-IgG-Lx(JG9)： 0.35%

主通道区段(5)是经由毛细管堵(9)来与次通道区域(8)流体连接的。该毛细管堵(9)可以构造成为几何阀或者疏水阻挡物，以使得流过该毛细管堵(9)的样品的量能够依靠测试元件(1)的旋转速度，通过离心力来控制。血浆收集区(10)和红血球收集区(11)(其处于腔室的形式中)邻接该次通道区域(8)。红血球或者其它细胞样品成分的分离是在次通道区域(8)中以合适的旋转速度来开始的。当样品液体进入次通道区域(8)时，包含在主通道区段(5)中的试剂已经溶解了。该样品-试剂混合物的成分截获在两个收集区(10)(11)中。血浆收集区(10)是与包含多孔基体(13)的测量室(12)流体连接的。

将多孔基体(13)(在塑料载体箔上的硝化纤维素隔膜；21 x5mm²；用100 µm PE箔增强的硝酸纤维素隔膜(类型CN140，来自德国Sartorius))引入到衬底相应的凹进处中，并且任选地依靠双面胶带来固定。被分析物检测区(14)和合并的对照和校准区(15)(其在引入多孔基体之前已经通过线浸渍而产生)存在于该多孔基体(13)上，每种处于线条的形式。就这点而言，通过线计量来施用抗生物素蛋白链菌素水溶液(4.75mg/ml)，将被分析物检测区(14)施用到前述的硝酸纤维素隔膜上。选择该计量以使得(计量的量0.12ml/min，带速度3m/min)形成大约0.4mm宽度的线条。该线条用于检测待测量的被分析物，并且包含大约0.95 µg 抗生物素蛋白链菌素/隔膜。该合并的对照和校准区(15)是在抗生物素蛋白链菌素线条下游大约4mm的距离上如下来产生的：将浓度0.1mg/ml的肌钙蛋白T聚半抗原溶液和浓度0.03%的g-球蛋白JG9乳胶的含水混合物在相同的计量条件下施用。该合并的对照和校准区(15)包含大约0.02 µg聚半抗原和0.06 µg g-球蛋白JG9乳胶/测试。

在将多孔基体(13)引入到衬底(2)之后，施用覆盖物(箔或者注塑零件，没有流体结构，其可以任选地亲水化)，并且任选地与衬底(2)永久连接，并且优选胶合，焊接或者修剪。

最后，将该衬底翻转，并且置于废非织造物(16)(非织造物尺寸13 x7 x1.5mm³)相应的凹进处中，该废非织造物的组成为100份玻璃纤维(直径0.49-0.58 µm，长度1000 µm)和5份聚乙烯醇纤维(Kuralon VPB105-2，来自Kuraray)，单位面积的重量是大约180g/m²)，其然后依靠胶带固定到衬底(2)中。因此，该废非织造物(16)存在于废物室(17)中，该废物室在流动方向上排列于测量室(12)后面。反应参与物，样品和/或试剂成分可以在它们流过该测量室(12)之后，在废物室(17)中进行处置。

此外，该测试元件可以包含清洗溶液(18)施加孔，其是与清洗溶液通道(19)流体连接的，该清洗溶液通道(19)进而经由清洗溶液供料通道(20)流体连接到测量室(12)中。借助于这些结构和合适的离心步骤，清洗溶液可以导入测量室(12)中，来清洗该多孔基体(13)。

实施例2：用于检测肌钙蛋白T的测试元件的评价

使用来自实施例1的测试元件来检测含有已知浓度的肌钙蛋白T的三种不同样品中的肌钙蛋白T。该样品中的两种包含在肝素全血中浓度为0.1 ng/ml和10 ng/ml的肌钙蛋白T。该样品是通过100 ng/ml的肌钙蛋白T储备溶液的常规稀释来制备的，所述的储备溶液事先通过将来自Roche公司的所需量的肌钙蛋白T冻干物溶解到人血清中来制备的。第三种样品仅仅包含肝素全血，并且充当了阴性对照物。将实施例1的不同的测试元件用于每种样品。

肌钙蛋白T检测在每种情况中是在两种不同的评价条件下进行的。两种条件的技术差异在于它们的辐射源以及用于产生激发波长的滤光器的性质和用于测量所用的荧光团(JG9乳胶)的发射波长的照相滤光器的性质。在一种情况中，它是带有100 W卤素灯的实验室组件；所述滤光器覆盖了宽的不在所述荧光团的最大值的范围，所谓的“Redbox”。在另外一种情况中，它是另外开发的具有100 W氙气灯的组件；所述滤光器覆盖了较窄的范围，该范围更接近于荧光团的各最大值，所谓的“Linosbox 1”。两种条件主要差异在于不同的评价装置之间的常规变型方案，其对于在被分析物检测区中所测量的各自的依赖于被分析物的信号的强度具有影响，因此需要校准该测量信号，来获得对于在不同的仪器上的被分析物测量来说堪相比较的结果，并因此应当说明该方法的效率。使用该“Linosbox”作为评价仪器本身。

在样品用于实际的肌钙蛋白T检测之前，测试元件上的合并的对照和校准区的信号在每种情况中，是在用633nm激发波长的辐射进行激发之后，在Redbox和Linosbox 1中确定的(“干测量”，参见表1)。虽然Redbox和Linosbox 1之间的绝对信号强度的差异仅在于它们的绝对值，但是可以预期作为平均值来说，在单个样品之间没有明显的变化(参见表1，“平均值”行)。

表1：

在将样品施用到测试元件之前，在被分析物检测区中的信号测量(“干测量”)

浓度TnT [ng/ml]：样品中肌钙蛋白T的浓度，其是在干测量之后，在相同的测试载体上分析的。

数目[n]：所进行的测量的数目。

VK：偏差系数；标准偏差/平均值，单位为百分比。

随后，在被分析物检测区中的信号是在每种情况中，在Redbox和Linosbox 1条件下用所述三种样品来测量的。为此目的，在每种情况中将40 µl移液到该测试元件的样品施加孔(4)中，并且通过毛细管作用力牵引到主通道区段(5)中。在该主通道区段(5)中存在的试剂(6)(7)培养后被该样品溶解之后，通过离心法将该溶液转移到含有多孔基体(13)的测量室(12)中，并且将固体血液成分在相邻的红血球收集区(11)中进行分离。将所形成的血浆/试剂混合物通过降低离心力，以毛细管方式沿着多孔基体(13)进行色谱分析，在这里然后将该被分析物固定到被分析物检测区(14)中。在测量之前，通过用清洗缓冲液清洗来以相同的方式从隔膜中除去多余的荧光团。

被分析物检测区中的信号是在用激发波长633nm的辐射进行激发之后，在Redbox和Linosbox 1中测量的(参见表2中的“平均值”)。如期望的那样，含有肌钙蛋白T的样品的信号强度明显高于阴性对照物的背景信号(浓度TnT 0 ng/ml)，这归因于该信号的被分析物依赖性。同样，样品的信号强度之间的联系对应于所用的肌钙蛋白T浓度，即，在100倍高的浓度时是大约100倍更强的信号。但是，比较Redbox和Linosbox1试验条件之间的绝对值表明：偏差因子大于20(比较表2中的Redbox“平均值” 行和Linosbox 1“平均值” 行)。校准的测量信号(其在两种试验条件之间仅仅具有轻微的差异(参见表2，“校正”行))仅仅是如下来获得的：将事先在合并的对照和校准区中所测量的信号与在根据本发明的被分析物检测区中所测量的信号之间进行关联。

表2

在将样品施用到测试元件之后，在被分析物检测区中的信号测量

浓度TnT [ng/ml]：样品中肌钙蛋白T的浓度。

数目[n]：所进行的测量的数目。

VK：偏差系数；标准偏差/平均值，单位为百分比。

Claims (12)

1.测试元件，特别是处于根据夹层原理工作的免疫学测试条形式的测试元件，其用于对样品中的一种或多种被分析物进行荧光检测，该测试元件包含：

-被分析物检测区，和

-合并的对照和校准区，

特征在于，该合并的对照和校准区包含

a)荧光团，和

b)结合配偶体，用于与用荧光团标记的试剂的特异性结合。

2.根据权利要求1的测试元件，特征在于该被分析物检测区和/或该合并的对照和校准区是以线条或者基本上圆形点的形式存在的。

3.根据权利要求1或者2之一的测试元件，特征在于将该荧光团和/或该用于与用荧光团标记的试剂特异性结合的结合配偶体固定在该合并的对照和校准区中。

4.根据权利要求1-3之一的测试元件，特征在于该合并的对照和校准区中的荧光团和该用荧光团标记的试剂的荧光团能够用相同的波长激发，并且作为这种激发的结果，发射相同波长的电磁辐射。

5.根据权利要求1-4之一的测试元件，特征在于该测试元件是免疫学测试元件，特别是处于免疫学色谱法测试条的形式。

6.根据权利要求1-4之一的测试元件，特征在于该测试元件是微阵列。

7.根据前述权利要求中任一项的测试元件，特征在于在该合并的对照和校准区中，荧光团的量是0.001 µg-5 µg，而用荧光团标记的试剂的量是1 ng-500 ng。

8.使用根据权利要求1-6之一的测试元件和适于评价该测试元件的分析仪器，来校准被分析物特异性测量信号的方法，其包含下面的步骤：

a)在该用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号，

b)测量步骤a)中所产生的所述信号，

c)将该样品与所述测试元件和用荧光团标记的所述试剂接触，以使得被分析物—如果存在于所述样品中的话—在被分析物检测区中产生可检测的信号；

d)通过激发用荧光团标记的所述试剂的荧光团，来在被分析物检测区中产生信号，该用荧光团标记的试剂是在存在被分析物情况下而存在于被分析物检测区中的，

e)测量步骤d)中所产生的信号，

f)建立步骤b)和e)中所测量的信号的联系。

9.使用本发明的测试元件和适于评价本发明的测试元件的分析仪器，来测量样品中被分析物浓度的方法，其包含下面的步骤：

a)在用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号，

b)测量步骤a)中所产生的所述信号，

c)将该样品与该测试元件和该用荧光团标记的试剂接触，以使得被分析物—如果存在于该样品中的话—在被分析物检测区中产生可检测的信号；

d)通过激发用荧光团标记的所述试剂的荧光团，来在被分析物检测区中产生信号，该用荧光团标记的试剂是在被分析物存在下而存在于被分析物检测区中的，

e)测量步骤d)中所产生的信号，

f)建立步骤b)和e)中所测量的信号的联系，

g)将步骤f)的所述联系与校准曲线进行比较，

h)基于步骤g)中所进行的比较，来确定被分析物的浓度。

10.根据权利要求8或者9的方法，特征在于将步骤b)和e)中所测量的信号相对于彼此进行补偿。

11.根据权利要求8-10之一的方法，特征在于在所述样品与所述测试元件和所述用荧光团标记的试剂接触(步骤c))之前，进行在该用荧光团标记的试剂不存在的情况下，通过在该合并的对照和校准区中激发荧光团，来在该合并的对照和校准区中产生信号(步骤a))，和测量通过该荧光团所产生的信号(步骤b))。

12.根据权利要求1-7之一的测试元件的用途，用于校准在测试元件的被分析物检测区中所产生的信号。

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