CN1869700A - ***不育六项指标集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及***不育六项指标集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒。所述的反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括3－384个样本孔，1－300个阴性对照孔，1－300个阳性质控孔，其中，每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着***抗原(Sperm antigen，SAg)，透明带抗原(Zona pellucida antigen，ZPAg)，子宫内膜抗原(Endometrium antigen，EMAg)，卵巢抗原(Ovary antigen，OAg)，滋养层细胞抗原(Trophoblast antigen，TAg)，人绒毛膜***抗原(Human Chorionic Gonadotropin antigen，HCGAg)六种或六种以上抗原的微点阵。本发明的反应板和试剂盒可简便、快速、准确地实现多个人份的***不育六项指标的同时检测。

Description

***不育六项指标集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒

技术领域

本发明属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种适于***不育六项指标：***抗体(ASAb)，抗透明带抗体(AZP)，抗子宫内膜抗体(EMAb)，抗卵巢抗体(AOA)，抗滋养层细胞抗体(ATAb)，抗人绒毛膜***抗体(HCGAb)集成检测的反应板和试剂盒。

背景技术

据世界卫生组织预测，在21世纪，***不育将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。权威的数据显示，在已婚夫妇中非意愿性***发生率为7％～46％。尽管不同地域存在差异，但一般被认为在8％～15％。

随着医学科学的发展和检测手段的不断提高，免疫性***越来越受到人们的重视，免疫性***亦即由于生殖***抗原的自身免疫或同种免疫所引起，如***、***、卵透明带及卵巢内产生甾体激素的细胞均为特异性抗原，引起免疫反应产生相应抗体，阻碍***与卵子结合及受精而致***。其中以***抗体引起的***最为常见。

***作为一种独特的抗原，与机体免疫***接触后可引起自身或同种免疫反应，产生抗***抗体(ASAb)，抗***抗体所致***占***患者的10％～30％。男女体内都可能存在抗***抗体。在男性抗***抗体存在于血清或***中，在女性则存在于血清或***中。AsAb与***蛋白结合，可干扰***穿过***期***；AsAb的调理作用可促进生殖道局部吞噬细胞对***的吞噬；抗***头部的抗体还能阻断精卵结合，引起补体介导的受精卵的融解，损害胚胎植入及前期胚胎发育导致早期流产。

透明带(zona pellucid，ZP)是一层包绕着***及着床前孕卵的非细胞性明胶样酸性糖蛋白膜，内含特异性***受体，在诱发***顶体反应、精卵识别、结合、穿透和阻止多***入卵的过程中起着重要作用。实验研究表明，透明带抗原可刺激同种或异种抗体产生免疫应答，透明带经抗血清处理后，失去了与同种***的结合能力；在体内，透明带抗体能干扰孕卵表面的透明带脱落而妨碍着床。目前认为，透明带抗体是女性不育的原因之一。

子宫内膜是胚胎着床和生长发育之地，但在病理状态下，如子***、子宫内膜异位症及子宫腺肌症等，可转化成抗原或半抗原，刺激机体自身产生相应的抗体。此外，人工流产***时，胚囊也可能作为抗原刺激机体产生抗体。一旦女性体内有抗子宫内膜抗体存在，便会导致***、停孕或发生流产。

由于卵巢损伤、感染、炎症等原因造成卵巢抗原的外溢，而导致抗卵巢抗体AoA产生，约42％-52％的***及流产患者中有抗卵巢抗体(AoA)的高表达。其AoA会进一步加重卵巢的损伤，并导致子宫、胎盘的功能不健全，引起***和流产。

人绒毛膜***(HCG)是维持早期妊娠的主要激素。但是有自然流产史、人工流产史及生化妊娠史的女性，在流产过程中，绒毛组织中的HCG可能作为抗原刺激母体产生抗体。曾接受过HCG注射，以促进***的女性，体内的抗HCG抗体也有可能为阳性。此类患者可能在临床上表现为***或习惯性流产。另外，在不明原因流产的妇女血清中，抗滋养层细胞抗体(ATAb)比正常孕妇明显增高，这种抗体的增高与流产之间有着密切联系。其机制可能与封闭抗体的减少有关。

目前，***不育的血清学检测是应用免疫酶标(ELISA)间接法，可以检测人体内与***不育有关的上述抗体，这些抗体存在于人体的血液内或人体生殖道局部，如***、***中，但ELISA试剂每次只能检测单个指标，在进行多指标检测上耗时、耗力、成本高，难以满足大样本的临床诊断市场。

最近几年出现的高科技技术-蛋白芯片技术集高效、准确、价廉、操作简便于一体，在多指标并行快速检测方面有着无可比拟的优势。本发明通过对六个指标的快速检测实现对***不育症的诊断，预测和预后判断，对***不育症的预防和治疗有着重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可同时检测血清或血浆中的***抗体(ASAb)，抗透明带抗体(AZP)，抗子宫内膜抗体(EMAb)，抗卵巢抗体(AOA)，抗滋养层细胞抗体(ATAb)，抗人绒毛膜***抗体(HCGAb)共六项指标，具有***不育症的筛查和检测双重功能的***不育诊断试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种***不育六项集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括3-384个样本孔，1-300个阴性对照孔，1-300个阳性质控孔。其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)总共六种或六种以上抗原组成的微点阵，每一反应孔内设有一个定位基准点。

在一优选例中，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

在另一优选例中，所述样本孔的数量为1-300个。

在另一优选例中，所述的***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)六种抗原在固相载体上各有2-8个点样点。

在另一优选例中，所述反应孔每孔设有一个定位基准点。

在本发明的第二方面，提供了一种***不育六项集成检测试剂盒，它包括本发明上述的***不育六项集成检测反应板。

在另一优选例中，还包括：酶标工作液、检测液、阴性对照、阳性对照品。

在另一优选例中，所述的酶标工作液由兔抗人酶标抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢两种试剂组成，使用前混合。

在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

附图说明

图1是本发明一种固相载体上***不育相关抗原的点样示意图

图2是本发明的反应孔中进行的各抗原——抗体反应的示意图

具体实施方式

***不育六项集成检测的关键和难点是，检测的灵敏度和特异性直接关系到结果的准确可靠，本发明经过深入而广泛的研究，对检测反应板作了改进，在本发明应用微点阵检测技术，结合酶免疫间接法和化学发光检测技术，大大提高了检测的灵敏度和特异性，从而解决了上述问题。

具体而言，为提高***不育六种及六种以上相关抗体：***抗体(ASAb)，抗透明带抗体(AZP)，抗子宫内膜抗体(EMAb)，抗卵巢抗体(AOA)，抗滋养层细胞抗体(ATAb)，抗人绒毛膜***抗体(HCGAb)，抗心磷脂抗体(ACA)，封闭抗体(BA)等的检测效率，本发明应用微点阵检测技术，结合酶免疫间接法和化学发光检测技术设计了一种***不育六项集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括3-384个样本孔，1-300个阴性对照孔，1-300个阳性质控孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部平面上有固相载体，且在固相载体上包被着***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)六种抗原的蛋白质微点阵。

各反应孔的数量没有特别限制，通常样本孔为3-384个，较佳地5-50个。阴性对照孔为1-300个，较佳地2-30个。阳性质控孔为为1-300个，较佳地2-30个。

在本发明中，反应孔的形状和大小没有特别限制，可以是圆形、方形、六角形、椭圆形、或其他形状。大小通常为直径0.1nm-8cm，深度为0.1nm-4cm。

在本发明中，反应板基板的材料可以选用本领域常用的各种材料，较佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。

在本发明中，包被六种抗原的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)：玻璃片、塑料、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，较佳的固相载体包括NC膜、PDVF膜。

在固相载体上，***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)六种抗原各有2-8个点样点，较佳地2-5个点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。各点样点之间的距离通常为0.1nm-20mm。

另一方面，本发明还提供了一种***不育六项集成检测蛋白芯片试剂盒，该试剂盒可实现多指标并行化、微型化、高通量检测。它包括本发明的反应孔板、洗涤液、酶标工作液、检测液(A、B)、阴性对照、阳性质控品等。其中，酶标工作液液由HRP标记的兔抗人抗体组成，检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，使用前混合。

在本发明中，各指标的检测采用酶免间接法，检测原理如图2所示。详细叙述如下：

1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。封闭，除去未结合的位点。

2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

3)加酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

4)加底物：固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度代表标本中受检抗体的量

本发明巧妙地综合利用了蛋白质微点阵检测技术，酶免疫间接法和化学发光检测技术，实现了***不育症六种或六种以上指标的同时检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

检测反应板的制备

取96孔板，设置42-84个样本孔，1-8个阴性对照孔，1-8个阳性质控孔。在每个反应孔的底部放置一固相载体(NC膜或PDVF膜)，且在固相载体上包被着***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)六种抗原的蛋白质微列阵(图1)。

实施例2

试剂盒制备

制备含一***不育六项指标集成检测的试剂盒，它含有实施例1的反应孔板一块(8-200人份)，洗涤浓缩液1瓶，酶标工作液1瓶，检测液A一瓶，检测液B一瓶，阳性对照一瓶，阴性对照一瓶。

洗涤浓缩液、酶标工作液、检测液A、检测液B

实施例3

***不育六项指标集成检测

按以下方法对各测试血请样品进行检测：

1.加经稀释的待检测血请或阴性对照、阳性对照品于相应反应孔内，60-200ul/孔。

2.30℃-42℃保温振荡反应30-60分钟。

3.用洗液洗涤4-30次，每次1-10分钟，振动。

4.每孔加酶标工作液50-100ul。

5.用洗液洗涤4-6次，每次1-10分钟，振动。

6.加检测液20-100ul/孔，使检测液均匀分布于孔的底部。

7、CCD检测，视发光信号强度曝光3-15秒。

结果判定：

依据不同指标的CutOff值，参考阴性对照和阳性质控空，判定样品血清的阴阳性。

与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种***不育六项集成检测反应板，其特征在于，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括3-384个样本孔，1-300个阴性对照孔，1-300个阳性质控孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)六种或六种以上抗原的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。

2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

3.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述样本孔的数量为1-300个。

4.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的***抗原(SAg)，透明带抗原(ZPAg)，子宫内膜抗原(EMAg)，卵巢抗原(OAg)，滋养层细胞抗原(TAg)，人绒毛膜***抗原(HCGAg)六种抗原在固相载体上各有2-8个点样点。

5.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，在每一反应孔内还设有一定位基准点。

6.一种***不育六项集成检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的***不育六项集成检测反应板。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括：酶标工作液和检测液、阴性对照、阳性对照品。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的兔抗人抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

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