发明内容
本发明的第一目的在于提供一种中药组合物。
本发明的第二目的在于提供上述中药组合物的制备方法,该处方和制备工艺可行,适合于大规模生产。
为实现本发明的第一目的,本发明采用如下技术方案:
一种中药组合物,所述组合物按重量份计,具有如下配比:
熟地黄330-390、知母85-145、党参185-245、地骨皮85-145、当归185-245、
淫羊藿85-145、黄芪115-175、肉苁蓉185-245、酸枣仁185-245;
优选:
熟地黄345-375、知母100-130、党参200-230、地骨皮100-130、当归200-230、淫羊藿100-130、黄芪130-160、肉苁蓉200-230、酸枣仁200-230;
更优选:
熟地黄357、知母114、党参214、地骨皮114、当归214、
淫羊藿114、黄芪143、肉苁蓉214、酸枣仁214。
所述的中药组合物是上述原料的提取物,与药学上可接受的辅料制成的口服制剂。
所述的口服制剂为颗粒剂,所述的辅料为糊精。
为实现本发明的第二目的,本发明采用如下技术方案:
一种如上所述中药组合物的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
1)将所述的9种原料预处理后备用;
2)淫羊藿用乙醇提取,提取液滤过后,滤液减压浓缩至稠膏;
3)熟地黄、知母、党参等八味药加水煎煮,煎煮液滤过,滤液浓缩至稠膏;
4)将步骤3所得稠膏与淫羊藿乙醇提取稠膏混合成提取物浸膏,该提取物浸膏与药学上可接受的常规辅料结合进一步制成口服制剂。
步骤2为:淫羊藿加12-18倍量60-80%乙醇回流提取1-3次,每次1-3小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.28~1.36(80℃)稠膏;优选:淫羊藿加15倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
所述的步骤3为:熟地黄、知母、党参等八味药加8-12药材量水煎煮2-5次,每次0.5-2小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.28~1.36(80℃)稠膏,优选;熟地黄、知母、党参等八味药加10倍药材量水煎煮3次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
所述的口服制剂为片剂、颗粒剂和胶囊剂。
所述的颗粒剂的制备方法为:
向提取物浸膏中加入适量药学上可接受的辅料,混匀,减压干燥(60-80℃),粉碎成细粉,制粒,包装而成。
所述的片剂的制备方法为:
向提取物浸膏中中加入适量药学上可接受的辅料,充分混匀,置55-65℃干燥粉碎;混匀,制粒、干燥,压片,即得。
所述的胶囊剂的制备方法为:
向提取物浸膏中加入适量药学上可接受的辅料,搅拌均匀,真空干燥后粉碎,过筛,制粒,干燥,灌装即得。
所述的药学上可接受的辅料为淀粉、糊精、乳糖、羟甲基纤维素钠、微粉硅胶、硬 脂酸盐、或滑石粉。
1、工艺路线设计
(1)方中各药味的理化性质
(1)熟地黄:本品为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜块茎炮制加工品。
炮制方法:取净生地黄,照蒸法(中国药典2000年版一部II D)蒸至黑润,取出,晾晒至外皮粘液稍干时,切厚片或块,干燥,即得。
(2)知母:本品为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。
(3)党参:本品为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的干燥根。
(4)地骨皮:本品为茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥根皮。
(5)当归:本品为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。
(6)淫羊藿:本品为小檗科植物朝鲜淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying的干燥地上部分。
(7)黄芪:本品为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)的干燥根。
(8)肉苁蓉:本品为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥带磷叶的肉质茎。
(9)酸枣仁:本品为鼠李科植物酸枣仁Ziziphhus jujubaMill.Var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种子。
方中以熟地黄为君,养血滋阴,补精益髓,补其不足以治本。《本草正》:“阴虚而神散者,非熟地之守,不足以聚之;阴虚而火升者,非熟地之重,补足以降之;阴虚躁动,非熟地之静,不足以镇之;阴虚而刚急者,非熟地之甘,不足以缓之”。臣药选用知母,清热泻火,滋阴润燥。地骨皮凉血退蒸,善清虚热。此二味臣药,清热养阴,平其偏胜以治标。佐药选用当归补血养肝而调冲任。党参、黄芪即补中又固表,补气升津行水,补任天以养先天。肉苁蓉补肾助阳,补而不燥。《本草汇言》:“养命门,滋肾气,补精血之药也。”淫羊藿补肾壮阳,与肉苁蓉合用,是在补阴之中配以补阳,取“阳中求阴之意”。酸枣仁安神益智,养血益肝,敛汗。六味佐药同用,心、肝、脾、肾同补,气、血、阴、阳兼顾,使君臣补阴清热不致过于苦寒。全方用药,以补肾阴为主,共奏滋阴而清热之功。
本方切合中医病因病机理论和方剂学理论,选药精良,组方巧妙,医理精深,堪称治疗更年期综合征的有效良方。
以上九味中药均应符合中国药典2000年版一部各药材项下有关规定。
以上九味中药,药材经净制,以饮片投料即可。
熟地黄含梓醇、地黄素、桃叶珊瑚甙、地黄甙和多糖等成分;知母含皂苷类成分;党参含皂苷、糖类微量生物碱及三萜类化合物;地骨皮含甜菜碱、皂苷等;当归含挥发油、阿魏酸、多糖等;淫羊藿含黄酮类成分;黄芪含皂苷、多糖等;肉苁蓉生物碱,肉苁蓉苷等;酸枣仁含黄酮类和三萜类成分。
(2)拟采取的提取方法
从上述各味药的理化性质可以看出,大多数药味成分均可溶于水中,因此,本工艺采用水煎煮提取工艺。在预试验过程中,发明人注意到采用水煎煮方法提取,对淫羊藿药材中的有效成分淫羊藿总黄酮提取率影响很大,因此,对淫羊藿药材的提取采用适宜浓度乙醇提取。
2、提取工艺技术条件的研究
2.1淫羊藿乙醇提取条件的选择
本发明确定影响淫羊藿乙醇提取效果的四个因素,即A:提取时间;B:提取次数;C:加醇量;D:乙醇浓度。并结合实际情况为每个因素确定了三个水平,见表1。
表1、淫羊藿乙醇提取条件考察因素水平表
在正交试验的考察指标确定上,测定淫羊藿总黄酮提取量为考察指标,按L9(34)正交表进行试验,以考察以上四个因素三水平变化对试验结果的影响。
(1)样品液的制备
精密称取淫羊藿10g,按表1条件分别回流提取,滤过,滤液挥去乙醇,加醋酸乙酯提取4次,每次50ml,无水硫酸钠脱水后蒸干,残渣加甲醇溶解,并定容至25ml容量瓶中。
(2)考察指标的测定
标准曲线的制备精密称取淫羊藿苷4mg,置25ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度。分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml淫羊藿苷对照品溶液,置25ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度。于267nm处测定其吸收度,计算回归方程为Y=3.5010C-0.0087(r=0.9987)
样品测定精密吸取样品液1ml,置25ml容量瓶中,甲醇稀释并定容至刻度。吸取该溶液1ml,置25ml容量瓶中,甲醇稀释并定容至刻度。按标准曲线项下测定其吸收度,并计算含量。
(3)试验结果:正交试验结果见表2,结果方差分析见表3。
表2、正交试验结果
表3、方差分析
F0.10(2,2)=9.0;F0.05(2,2)=19.0;F0.01(2,2)=99.0
由表2看出,各因素对试验结果的重要性为:D>C>A>B。表3方差分析表明,乙醇浓度、乙醇用量和提取时间对淫羊藿总黄酮的得量有显著影响。根据直观分析结果,最佳水提取工艺应为A3B2C3D2,即淫羊藿用70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时,加醇量为15倍。在此基础上,发明人对提取条件进行了适量范围的扩充,在大量的实验基础上认为淫羊藿加12-18倍量60-80%乙醇回流提取1-3次,每次1-3小时,合并提取液,滤过,滤液回收 乙醇并减压浓缩至相对密度1.28~1.36(80℃)稠膏仍可获得理想的提取效果,其中优选:淫羊藿加15倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时,合并煎液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
(4)最佳工艺验证试验
为了进一步考察上述的优选工艺,本发明采用上述工艺,制备三份样品液,对样品液和淫羊藿药材分别测定含量,计算出淫羊藿苷的转移率。
样品液的制备:取淫羊藿药材50g,用70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时,加醇量为15倍。合并提取液,回收乙醇,残渣加水定容至100ml。本试验重复三次。
样品液中淫羊藿苷含量测定:精密吸取各样品液2ml,上已处理好的D101大孔树脂(1.5cm×10cm),用水200ml洗脱,弃去水液,再用70%乙醇200ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇适量使溶解,定量转移至50ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液(每1ml中含淫羊藿苷0.11mg)与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,以外标法计算,即得。
淫羊藿药材中淫羊藿苷含量测定:取淫羊藿药材粉末(过40目筛)约1g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇50ml,密塞,称定重量,超声处理1小时,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液(每1ml中含淫羊藿苷0.11mg)与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,以外标法计算,即得。
三批样品淫羊藿苷转移率测定结果:经计算,三批样品淫羊藿苷的转移率测定结果见表4。
表4、三批样品淫羊藿苷的转移率测定结果
结果淫羊藿甙转移率为84.4%,说明优选出的提取方法提取比较完全,提取工艺可行。4.2.3.2熟地黄、知母、党参、地骨皮、当归、黄芪等八味药材煎煮条件的选择
本发明确定影响提取效果的三个因素,即A:煎煮时每次加水量;B:煎煮次数;C:每次煎煮时间,并结合实际情况为每个因素确定了三个水平,见表5。
在正交试验的考察指标确定上,水煎液中黄芪甲苷提取量和出膏率为考察指标,按L9(34)正交表进行试验,以考察以上三个因素水平变化对试验结果的影响。
(1)样品液的制备
按处方1/10比例,准确称取八味药材(熟地黄35.7g、知母11.4g、党参21.4g、地骨皮11.4g、当归21.4g、黄芪14.3g、肉苁蓉21.4g、酸枣仁21.4g)共9份,按表4所列条 件进行提取操作,水煎煮,滤过,合并滤液,浓缩至100ml(1.584g生药/ml)为样品液,制得9份样品液。
(2)考察指标的测定
出膏率的测定:精密吸取各样品液20ml,至已称重的蒸发皿中,水浴蒸干,照干燥失重法(中国药典2000年版一部附录)测定重量,计算出膏率。
黄芪甲苷含量测定:分别精密吸取20ml的提取液,用水饱和正丁醇振摇提取3次(30、30、30ml),合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次(30、30ml),弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5ml使溶解,放冷,通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5cm,长12cm),以水100ml洗脱,弃去水液。再用40%乙醇80ml洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇100ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至2ml量瓶内,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成1ml含0.76mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验,吸取供试品溶液5μl,对照品溶液2μl、5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)(10℃以下放置过夜)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃烘约5~7分钟,至斑点清晰,取出,在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板,周围用胶布固定,照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)进行扫描,波长λS=500nm、λR=700nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值,计算含量。
(3)试验结果:正交试验结果见表6、8,结果方差分析见表7、9。
表5、煎煮法提取药材考察因素水平表
表6、正交试验结果(以黄芪甲苷提取量为考察指标)
表7、方差分析(以黄芪甲苷提取量为考察指标)
F0.10(2,2)=9.0;F0.05(2,2)=19.0;F0.01(2,2)=99.0
表8、正交试验结果(以出膏率为考察指标)
F0.10(2,2)=9.0;F0.05(2,2)=19.0;F0.01(2,2)=99.0
(4)小结
上述方差分析结果表明:以黄芪甲苷提取量为考察指标,因素A(加水量)有显著性差异(P<0.05),因素B(提取时间)无显著性差异(P>0.05),因素C(提取次数)有显著性差异(P<0.01),根据直观分析结果,最佳水提取工艺应为A3B3C3。
以出膏率为考察指标,因素A(加水量)无显著性差异(P>0.05),因素B(提取时间)无显著性差异(P>0.05),因素C(提取次数)有显著性差异(P>0.05),根据直观分析结果,最佳水提取工艺应为A3B3C3。
综合上述两方面结果,最佳水提取工艺应为A3B3C3,考虑到因素B(提取时间)无显著性差异,为节约能源,提取时间B3调整为B1,即为A3B1C3。也就是水煎煮三次,每次加水量为10倍,每次煎煮时间为1小时。在此最佳工艺的基础上,发明人对提取条件进行了适量范围的扩充,在进行了充分的实验验证后,认为熟地黄、知母、党参等八味药加8-12药材量水煎煮2-5次,每次0.5-2小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.28~1.36(80℃)稠膏均可达到最佳提取效果。特别优选;熟地黄、知母、党参等八味药加10倍药材量水煎煮3次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
(5)药材水煎出膏率的考察
为了了解熟地黄、知母、党参等八味药材按本制备工艺提取后的出膏率,本发明取除淫羊藿外处方量2倍的药材,按所确定的提取条件进行煎煮提取、滤过、减压干燥、称重,考查水煎部分药材的出膏率,结果见表10。
表10、地黄、知母、党参等八味药材水煎煮出膏率考查结果
5分离、浓缩与干燥工艺研究
①滤过方法:减压(或加压)滤过,药渣与提取液的滤过本发明选用200目尼龙筛网为滤材。
②浓缩方法:本发明均采用温度低、速度快的减压浓缩方法。
浓缩程度:对于干燥前的浓缩程度,本发明把握的原则是将浓缩液能从浓缩罐中顺利放出时的最大相对密度,经测定为1.28-1.36,优选1.30~1.35(80℃)。
③干燥方法的选择:
药液浓缩至相对密度为1.28-1.36,优选1.30~1.35(80℃)的稠膏,减压干燥法(60~70℃)制备干膏粉。本发明选用目前大多数生产企业都有条件进行的减压干燥,并控制温度不超过70℃,低于药材提取过程中温度,故可以使被干燥物在此过程中成分不会因干燥而被破坏。
6制剂成型性研究
6.1辅料选择及加入量的考察
将药材水煎煮提取,浓缩得清膏后,加入适量辅料,减压干燥。所述的辅料可以为淀粉、糊精、乳糖、羟甲基纤维素钠、微粉硅胶、硬脂酸盐、或滑石粉。因本处方中药物(没有太苦的药味)以及均为成人服用的特点,不必加矫味剂。在保证每日服用生药量不减少的同时,为了使服用剂量尽可能少,以制颗粒难易程度、制成的颗粒性状、溶化性和稳定性(塑料袋包装,在室温条件下放置一个月吸潮情况)为指标,考察清膏加辅料量的问题。分别取3份5倍处方量药材,按上述确定的提取工艺制备三份清膏(相对密度为1.30~1.35,80℃测),以糊精为例,加入不同比例的糊精,减压干燥,粉碎成细粉,湿法制粒,考察情况如下。
表11、辅料糊精加入量的考察结果
*室温条件:温度20~25℃,相对湿度60~70%
考察结果表明,(2)、(3)条件均可以制成合格的无糖型颗粒,即每一个处方量加入320~360g糊精即可,因此本发明考虑到制剂规格的因素,将每一个处方量加入辅料糊精的数量确定为340g。其他辅料的加入量也可参照糊精。
6.2制粒方法的选择
中药颗粒剂的制备一股是将药材提取后浓缩至一定密度的清膏,加入辅料(如糊精、淀粉等),拌匀,湿法或干法制粒。由于清膏的密度很难控制一致,影响辅料用量及制粒方法,也使成品中每克颗粒含生药量差异较大。因此,本发明将提取液浓缩后,加入适量辅料并减压干燥成干膏,粉碎成细粉,制成颗粒。
试验中分别采用85%乙醇、95%乙醇和无水乙醇作润湿剂进行湿法制颗粒。从制粒难易程度、溶化度、粒度、颗粒颜色几方面考察了上述方法的制得的颗粒情况,结果见表12。
表12、制粒工艺比较试验结果
试验结果表明,95%乙醇制颗粒效果较好,因此本发明采用95%乙醇制颗粒。
采用上述技术方案,本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:
(1)本发明所提供的中药组合物处方科学合理,处方中的9味原料药不仅仅是简单的叠加,各位药材药效相辅相成,大大增强其疗效,安全无毒副作用;
(2)本发明所提供的中药组合物的制备方法简单易行,有效成分含量高,适合大规模生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步详细的说明。但实施例仅仅是对本发明的优选实施例进行描述,并非对本发明的构思和范围进行限定,在不脱离本发明设计思想的前提下,本领域中专业技术人员对本发明的技术方案作出的各种变化和改进,均属于本发明的保护范围。
实施例1颗粒剂
将熟地黄357g、知母114g、党参214g、地骨皮114g、当归214g、淫羊藿114g、黄芪143g、肉苁蓉214g、酸枣仁214g洗净备用。
淫羊藿加15倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时。合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏;
熟地黄、知母、党参等八味药加10倍药材量水煎煮3次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
将淫羊藿乙醇提取稠膏与熟地黄等药水煎煮稠膏混合得提取物浸膏。
向提取物浸膏中加入适量的微粉硅胶,混匀,减压干燥(60-80℃),粉碎成细粉,制成颗粒1000g,包装成100袋,每袋10g。
实施例2颗粒剂
将熟地黄330g、知母85g、党参185g、地骨皮85g、当归185g、淫羊藿85g、黄芪115g、肉苁蓉185g、酸枣仁185g洗净备用。
淫羊藿加12-18倍量60%乙醇回流提取3次,每次3小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.28~1.33(80℃)稠膏。
熟地黄、知母、党参等八味药加8药材量水煎煮2次,每次2小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.28~1.33(80℃)稠膏。
将淫羊藿乙醇提取稠膏与熟地黄等药水煎煮稠膏混合得提取物浸膏。
向提取物浸膏中加入适量的糊精,混匀,减压干燥(60-80℃),粉碎成细粉,制成颗粒1000g,包装成100袋,每袋10g。
实施例3片剂
将熟地黄390g、知母145g、党参245g、地骨皮145g、当归245g、淫羊藿145g、黄芪175g、肉苁蓉245g、酸枣仁245g洗净备用。
淫羊藿加18倍量80%乙醇回流提取3次,每次3小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
熟地黄、知母、党参等八味药加12药材量水煎煮5次,每次2小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
将淫羊藿乙醇提取稠膏与熟地黄等药水煎煮稠膏混合得提取物浸膏。
向提取物浸膏中中加入适量淀粉,充分混匀,置55-65℃干燥粉碎;加适量淀粉和崩解剂羧甲基淀粉钠,混匀,制粒、干燥,再加入适量润滑剂硬脂酸镁,混匀,压成片剂1000片,包装即得。
实施例4胶囊剂
将熟地黄345g、知母100g、党参200g、地骨皮100g、当归200g、淫羊藿100g、黄芪130g、肉苁蓉200g、酸枣仁200g洗净备用。
淫羊藿加12-18倍量70%乙醇回流提取2次,每次2.5小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.33~1.36(80℃)稠膏。
熟地黄、知母、党参等八味药加10药材量水煎煮4次,每次1.5小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.33~1.36(80℃)稠膏。
将淫羊藿乙醇提取稠膏与熟地黄等药水煎煮稠膏混合得提取物浸膏。
向提取物浸膏中加入适量淀粉,搅拌均匀,真空干燥后粉碎,过筛,制粒,干燥,灌装成胶囊1000粒,包装即得。
实施例5胶囊剂
将熟地黄375g、知母130g、党参230g、地骨皮130g、当归230g、淫羊藿130g、黄芪160g、肉苁蓉230g、酸枣仁230g洗净备用。
淫羊藿加12倍量80%乙醇回流提取1次,每次3小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
熟地黄、知母、党参等八味药加12药材量水煎煮3次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.30~1.35(80℃)稠膏。
将淫羊藿乙醇提取稠膏与熟地黄等药水煎煮稠膏混合得提取物浸膏。向提取物浸膏中加入适量糊精,搅拌均匀,真空干燥后粉碎,过筛,制粒,干燥,灌装成胶囊1000粒,包装即得。
为了验证本发明中药组合物对治疗更年期综合症上的应用,发明人以本发明实施例1所述的颗粒剂,进一步做了大量的毒性和药效学试验,结果见试验例1-3。
试验例1本发明实施例1的急性毒性试验研究:
一、实验目的:
本试验观察小鼠一日内多次灌胃给予本发明实施例1后所产生的急性毒性反应及死亡情况,为主要药效学研究及长期毒性试验提供科学可靠的剂量依据。
二、实验材料:
药物:本发明实施例1,为深棕色粉末,每克含生药2.57克。用时以蒸馏水配成所需浓度的混悬液。
动物:昆明种小鼠,20~22g,雌性,购自长春高新医学实验动物研究中心。合格证号:SCXK-(吉)2003-0004。
三、实验方法与结果
1.小鼠一次最大给药量测定
取雌性小鼠10只,饥饿16小时,40ml/kg灌胃给予60%的实施例1混悬液,观察给药后小鼠状态,一周内死亡率。结果发现小鼠给药后活动减少,呼吸加快,匍匐不动,粪便颜色加深,稍稀,尾静脉血管颜色正常,眼、鼻未见分泌物,给药后第二天恢复正常,进食正常。一周内无死亡。
2.小鼠一日内最大耐受量测定
由于小鼠一日内最大浓度(60%),最大体积(40%)一次灌胃给予实施例1,一周内无死亡,无法测出半数致死量,因此测小鼠一日内灌胃给药最大耐受量。
取雌性小鼠30只,饥饿16小时,按40ml/kg灌胃给予60%实施例1,一日内给药二次,间隔6小时,观察给药后小鼠状态,一周内死亡率。结果发现小鼠给药后活动减少,呼吸加快,匍匐不动,粪便颜色加深、稍稀,尾静脉血管颜色正常,眼、鼻未见分泌物,给药后第二天恢复正常,进食正常。一周内无死亡。一日内给药总体积为80ml/kg,给药总量为48g/kg(123.5g生药/kg)。
四、结论
小鼠按40ml/kg一次灌胃给予实施例124g/kg(61.7g生药/kg),一周内无死亡。
小鼠一日内最大体积(40ml/kg),最大浓度(60%),二次灌胃给药,小鼠未见明显毒性反应,一周内无死亡,一日内给药总体积为80ml/kg,给药总量为48g/kg(123.5g生药/kg),为临床一日用量的255倍(人按70kg计算)。表明实施例1毒性很低。
试验例2本发明实施例1的大鼠长期毒性实验
实验材料
动物品系:Wistar大鼠,80~100g,雌性。长春市高新医学动物实验研究中心提供,动物合格证号为:吉动实字:SCXK-(吉)2003-0004。
动物管理条件:(1)饲料:试验动物全价颗粒饲料,长春市高新医学动物实验研究中心提供。(2)管理:动物购进后于吉林省中医中药研究院试验动物观察室适应一周后开始实验。条件为:通风,温度20~23℃,湿度40~45%,笼具每周消毒一次,定时给食给水。
受试药物:实施例1为深棕色粉末,每克含生药2.57克,为制粒前不含赋形剂干粉,临用时以蒸馏水配成所需浓度之混悬液,灌胃给药,对照组给予同体积蒸馏水(30ml/kg)。
测定试剂:所有血清生化学测定均用试剂盒,北京中生生物工程高技术公司产品。
仪器:全自动生化分析仪,奥林巴斯2700型;血球计数仪,美国库尔特公司产品;泰诺德BV-100型血液流变仪,北京泰诺德新技术研究所;电子天平,北京赛多利斯天平有限公司。
试验方法
实施例1的剂量:本品小鼠灌胃给药未测出半数致死量,最大耐受量为48g/kg(123.5g生药/kg),药效学有效剂量范围为5g/kg~1.25g/kg,拟定临床应用每1疗程为1个月,按病情轻重服用1~3个疗程,根据上述条件及药物浓度限制确定大鼠长期毒性试验周期为26周,剂量为16g/kg、8g/kg、4g/kg(41.2g生药/kg、20.6g生药/kg、10.3g生药/kg)三个剂量组。
动物分组:取大雌性鼠160只,随机分成四组,每组40只,分别为对照组(30ml/kg蒸馏水),高剂量组(16g/kg),中剂量组(8g/kg),低剂量组(4g/kg)。
给药方法:灌胃给药。2003年6月~2004年1月,按上述剂量每天灌胃一次,每周给药6天,连续26周,对照组给予同体积蒸馏水(30ml/kg)。
取样时间:于给药13周时,各组处死10只动物,取样作各项指标测定,其余动物继续给药。于给药26周时各组处死20只动物,取样作各项指标测定。其余动物停止给药,在同等条件下继续饲养2周后各组处死10只动物,观察各项指标的恢复情况。
检查项目:(1)一股观察:在整个试验期间,随时观察和记录动物的行为、外观活动和大小便的变化;记录进食量、饮水量。(2)体重:每周称体重一次,并根据体重调整给药量。(3)血常规检查:包括红细胞(RBC),白细胞(WBC),血红蛋白(Hb),血小板(PLT)和凝血时间。另取血涂片,固定,染色,在光学显微镜下计白血球分类。(4)血液生化学检查:包括天门冬氨酸氨基转换酶(AST),丙氨酸氨基转换酶(ALT),碱性磷酸酶(ALP),总蛋白(TP),白蛋白(ALB),尿素氮(BUN),总胆固醇(T·CHO),血糖(GLU),肌酐(Crea),总胆红素(T·BIL)。(5)对主要器官重量的检查:大鼠连续给药后不同时间,摘取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、子宫+卵巢等主要脏器称重,观察其重量变化情况。(6)***尸检和组织病理学检查:***尸检:给药结束后24小时,放血处死动物,立即进行尸检,肉眼观察其变化情况。镜检:尸检后,取相关组织器官放入予先准备好的鲍氏液内,经过包埋,切片,固定和染色。在显微镜下观察病理改变,待检组织器官包括:脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、结肠、回肠、直肠、胰腺、肾上腺、甲状腺、胸腺、垂体、视神经、延髓、胸骨、膀胱、***、卵巢、子宫。
实验结果
1.一股情况:大鼠灌胃给予实施例126周,大剂量组(16g/kg)大鼠,毛色光泽较差,粪便颜色较深,其余未见明显改变。其它剂量组未见外观、行为活动等异常变化。
2.对生长、摄食及饮水量的影响:连续灌胃给予实施例1后,大剂量组大鼠体重增长明显减慢,同对照组相比较在给药后第5~8周、19~20周有明显差异。中、低剂量组同对照组基本相似。各组进食量接近。高剂量组水量较多。停药2周高剂量组体重增长明显加快。
3.对血常规的影响:大鼠连续26周灌胃给予实施例1,RBC、Hb、WBC、PLT在给药的各个时期均在正常范围内,白细胞分类及凝血时间均无明显变化,停药2周后也无明显变化,表明长期灌胃给予实施例1对大鼠的外周血象无明显影响。
4.对血清生化学各项指标的影响:大鼠连续灌胃给予实施例1后,在给药各个时期血清生化学各项检测指标均无明显改变,停药后2周也未见任何改变,结果表明:长期灌胃给予实施例1对大鼠血清生化学各项指标无明显影响。
5.对主要器官重量的影响:大鼠连续灌胃给予实施例126周,给药各个时期各组各脏器系数同对照组比较均无明显变化,停药2周也无明显改变,结果表明,长期灌胃给予实施例1对大鼠对大鼠主要脏器重量无明显影响。
6.***尸检及组织病理学检查:①***尸检:肉眼对主要脏器检查对照组、高、中、低剂量组均无明显异常改变。②对器官组织病理形态的影响:大鼠灌胃给予实施例113周及26周对照组及各给药组部分动物肺间质有炎细胞浸润(连续给药13周:对照组2只,高剂量组2只,中剂量组2只,低剂量组2只;连续给药26周:对照组4只,高剂量组4只,中剂量组3只,低剂量组4只),由于各组出现机率近似,且低于20%,因此判断为动物自然产生炎症,非药物所致。对照组及给药各个剂量组其它组织未见明显病理改变,未见药物引起的毒副反应,停药一个月后所有脏器病理检查结果均正常。
上述试验结果表明,大鼠连续26周灌胃给予实施例1,大剂量组动物体重增长明显减慢,进食量同对照组比较稍有减少,饮水量有增加趋势,表明体重减慢可能与大剂量组药物浓度较大,影响食物的吸收有关;饮水量增加可能为对照组按30ml/kg灌胃给水,高剂量组灌胃给予高浓度的药物,相对于对照组而言灌胃给水量减少,因此自然摄水量增加;高剂量组其它各项指标无明显异常改变。中、低剂量组外观行为、体重增长、血常规、血清生化、主要脏器重量、组织病理学检查等各项指标同对照组比较均无明显差异,未见药物引起的任何异常改变。
综上所述,实施例1大剂量(16g/kg)、中剂量组(8g/kg)、低剂量组(4g/kg)连续26周灌胃给药对大鼠无明显毒性反应,高、中、低剂量组分别相当于临床拟用剂量(人按70kg计算)的84.8倍、42.4倍、21.2倍,表明该制剂毒性很低,临床应用较安全。
试验例3本发明实施例1的药效学研究
受试药物:
1、实施例1,深棕色粉末,每克含生药2.57克,为制粒前不含赋型剂干粉;
2、更年安胶囊通化金汇药业股份有限公司产品,批准文号:国药准字Z22020683,批号:20030218。临用时以蒸馏水配成所需浓度混悬液,均灌胃给药,
3、对照组给予同体积(20ml/kg)水。
4、以A处方为熟地黄395g、知母78g、党参235g、地骨皮80g、当归180g、淫羊藿124g、黄芪100g、肉苁蓉255g、酸枣仁224g,按照实施例1所述的方法制备的制粒前不含赋形剂干粉,每克含生药2.61g;
5、以B处方为熟地黄357g、玄参114g、沟藤214g、地骨皮114g、当归214g、淫羊藿114g、五味子143g、何首乌214g、酸枣仁214g,按照实施例1所述的方法制备的制粒前不含赋形剂干粉,每克含生药2.53g;
试剂:5-HT、5-HIAA,Sigma公司;重酒石酸去甲肾上腺素注射液、盐酸多巴胺注射液上海禾丰制药有限公司产品;戊巴比妥钠,北京化学试剂厂产品;E2、LH、FSH、PRL放免试剂盒,美国beckman公司出品;其它试剂均为国产分析纯试剂。
仪器:荧光分光光度计,型号:RF-540型,日本岛津株式会社出品;化学发光仪,美 国beckman公司出品;多功能小鼠自主活动仪,YLS-1A型,山东医学科学院设备站出品;电脑数字式体温计,欧姆龙(大连)公司产品;电子天平,北京赛多利斯天平有限公司产品。
动物:昆明种小鼠25~30g,wistar大鼠160~170g,雌性,购自长春高新医学动物实验研究中心,合格证号:SCXK-(吉)2003。
实验方法
一、″更年期″大鼠模型
1.模型复制
根据现有技术的方法建立模型:大鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹位固定,于最末肋骨下腋中线上,约距脊柱2cm处,剪毛,切开皮肤和背肌,夹出卵巢,分离脂肪团,结扎卵巢下输卵管切除双侧卵巢,术后第4.5、6.7日逐只进行***涂片检查,以确定卵巢摘除完全,术后第七天选取无动情期变化大鼠随机分成五组。各组大鼠灌服热性中药(附子∶干姜=1∶1水煎制成50%)20ml/kg,每天一次,连续14天。
2.分组与给药
大鼠随机分为8组,正常对照组实施假手术,灌胃给予同体蒸馏水,其余7组(去势)分别为模型对照组(20ml/kg水),更年安胶囊1.2g/kg(临床等效剂量的5倍),实施例15g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg(分别为临床等效剂量的4.2倍、2.1倍、1倍),A处方1.25g/kg,B处方1.25g/kg,各组大鼠分别于末次给予热性中药1小时后灌胃给予上述药物,每天一次连续10天。
3.检测指标
3.1.***上皮细胞角化检测
末次给药后1小时各组大鼠做***涂片,95%乙醇固定,巴氏染色,镜下观察角化程度,其中染色为兰色的细胞,为未角化细胞;染色为绿色的细胞,为中低层角化;染色为红色的有核鳞状上皮细胞,为表层角化;染色为红色无核多边形鳞状上皮,为过角化。将中低层角化、表层角化、过角化定为角化细胞,镜下记数100个上皮细胞中角化细胞和未角化细胞所占百分数。
3.2.肛温测量
大鼠于给予受试药物后4、6、8、10天的药后1小时测量大鼠直肠温度(探头深入***约3cm),以直肠的″℃″温度作为大鼠的直肠温度。
3.3.子宫重量测量
动物处死后,立即剖腹摘取子宫,用电子天平称湿重,结果以每g体重的子宫重量数表示(mg/g)
二、小鼠去势模型
1.模型复制
小鼠***麻醉,切开背部皮肤,剥离肌层及脂肪,切除双侧卵巢,饲养9天,术后5、7、9天***涂片,取卵巢切除完全无动情变化的小鼠用于实验。
2.分组与给药
小鼠随机分为8组,正常对照组实施假手术,其余7组分别为模型对照组(20ml/kg水),更年安胶囊1.5g/kg(临床等效剂量的4.2倍),实施例16g/kg、3g/kg、1.5g/kg(分别为临床等效剂量的3.5倍、1.8倍、0.9倍),A处方1.25g/kg,B处方1.25g/kg,各组小鼠分别于去势后9~18天每天灌胃一次连续10天。对照组给予同体积(20ml/kg)水。
3.检测
3.1.自主活动
末次给药后1小时将小鼠放入多功能小鼠自主活动仪中记录10min内活动次数。
3.2对阈剂量戊巴比妥钠的协同作用
末次给药后1小时各组小鼠腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠(阈剂量),观察15min翻正反射消失小鼠只数,计算睡眠率。
实验结果
1.″更年期″大鼠模型造型结果
大鼠造型后***上皮角化细胞明显减少,未角化细胞明显增多,肛温明显升高,血清中E2含量明显降低,LH、FSH、PRL含量明显增高,子宫重量明显减轻,下丘脑中单胺类神经递质NE水平明显降低,5-HT、5-HIAA水平明显增高,5-HT/NE比值明显提高,肛温明显提高,表明血清性激素及下丘脑中神经递质水平已经明显紊乱,更年期模型已明显形成。
2.实施例1对″更年期″大鼠肛温的影响结果见表13.
表13.实施例1对“更年期大鼠肛温的影响
同模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01.
表13结果可见,去势及给予热性中药后模型组大鼠体温明显增高,给予受试药物后不同时间给药组大鼠升高的肛温明显降低,给药后8天5g/kg实施例1和1.2g/kg更年安胶囊2组降温明显,给药后10天5~1.25g/kg实施例1和1.2g/kg更年安胶囊4组均有明显的降温作用。
3.实施例1对″更年期″大鼠子宫重量及子宫角化程度的影响结果见表14.
表14.实施例1对“更年期”大鼠子宫重量及角化程度的影响
同模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01.
结果表明,实施例15~1.25g/kg及更年安胶囊1.2g/kg连续灌胃给药14天可使模型大鼠减轻的子宫重量明显增加,明显增加***上皮细胞角化程度。
4.实施例1对去势小鼠自主活动的影响结果见表15
表15.实施例1对去势小鼠自主活动的影响
同模型对照组比较:*P<0.05.x±S
结果表明,实施例16g/kg、3g/kg及更年安胶囊1.5g/kg可明显减少去势小鼠自主活动次数。
5.实施例1对去势小鼠阈剂量戊巴比妥钠的协同作用结果见表16.
表16.实施例1对去势小鼠阈下剂量戊巴比妥钠的协同作用
同模型对照组比较
结果表明,实施例16g/kg、3g/kg及更年安胶囊1.5g/kg可明显提高阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠率。
上述药效学试验结果还表明,在本发明的基础上,改变处方中9味药材的重量配比(处方A),对药物的治疗效果存在很大的影响,此外,按照本发明所述的重量配比,将处方中的四位药材换成现有技术中具有相同或相似药效的其他药材(处方B),也无法获得与本发明相同或相近的技术效果,从而进一步验证了本发明处方的科学性,合理性,保证了其在临床上的有效性。
女性进入更年期,由于卵巢功能减退,下丘脑-垂体-卵巢轴(性腺轴)平衡失调,生殖内分泌***性激素分泌紊乱,卵巢对***的应激能力减弱,分泌的***大幅度降低,反 馈性的引起下丘脑、垂体分泌亢进,***分泌过多,引起植物神经功能失调,进而出现潮热、多汗、烦躁不安、失眠等多种植物神经紊乱症状。
本试验采用去势+灌服热性中药的方法模拟人类更年期,结果可见,模型大鼠血清中***水平明显降低,促卵泡激素、***、泌乳素水平明显增高,子宫重量明显降低,角化程度明显降低,表明生殖内分泌***已经紊乱。下丘脑中单胺类神经递质去甲肾上腺素含量明显降低,五羟色胺、五羟吲哚乙酸含量明显增高,5-HT/NE比值明显增高,表明下丘脑内正常的单胺类递质平衡已打破,大鼠肛温明显增高表明“内热”症状已经出现。实施例15~2.5g/kg连续灌胃给药14天,可明显降低模型大鼠血清***FSH、LH、PRL含量,对血清***含量有一定增加作用,同时可明显增加模型大鼠子宫重量,明显增加子宫上皮细胞角化程度,表明其对“更年期”大鼠紊乱的生殖内分泌***有明显的正向调节作用,同时可以直接作用于子宫,对子宫有直接营养作用,降低子宫的萎缩老化进程;对模型动物升高的肛温有明显的降低作用,表明其对更年期综合症有明显的抑制作用;明显降低下丘脑中5-HT、5-HIAA含量,提高NA含量,降低5-HT/NE比值,对DA含量及5-HIAA/5-HT比值作用不明显,表明其有部分纠正“更年期”大鼠中枢单胺类神经递质紊乱的作用,进而改善植物神经***紊乱症状,使更年期烦躁不安、失眠等症状得以缓解;明显降低去势小鼠自主活动次数,增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠率,表明其具有一定的镇静安神作用。
综上所述,实施例1对″更年期″大鼠紊乱的神经、生殖内分泌***具有明显的正向调节作用,对更年期烦躁、失眠等症状均有明显的改善作用。为其临床研究提供了药理学基础。发明人在上述研究基础上将本发明投入临床使用,结果表明,以实施例1的颗粒剂为例,口服,一次1袋,每天2次,以14天为1疗程,即可明显改善更年期妇女心烦、气燥、潮热汗出、眩晕耳鸣等症状,是治疗妇女更年期综合症的首选药。
对本发明的其他实施例做上述实验,均得到相同效果。