CN102526227A

CN102526227A - 藏边大黄提取物在制备防治脂肪性肝病药物中的应用

Info

Publication number: CN102526227A
Application number: CN2012100113960A
Authority: CN
Inventors: 耿向东
Original assignee: Tibet Jinhada Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Tibet Jinhada Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明公开了藏边大黄提取物的新应用，具体是其在制备预防治疗脂肪性肝病药物中的应用。经动物试验证明从藏边大黄中制备的经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物与3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷一方面能够显著抑制脂肪性肝病肝细胞CYP2E1的表达，并能够通过下调PPARγ表达，抑制肝细胞内脂肪生成的作用。因而藏边大黄提取物对多种原因所致的实验动物脂肪性肝病有显著的保护作用，能够应用于治疗或预防脂肪性肝病药物的制备。

Description

藏边大黄提取物在制备防治脂肪性肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及藏边大黄提取物的应用，特别是涉及藏边大黄提取物在制备防治脂肪性肝病药物中的应用，属于化合物或药物制剂的治疗活性领域。

背景技术

藏边大黄(Rheum emodi Wall.)系蓼科大黄属波叶组植物的根与根茎，主要分布在西藏、青海、四川及云南等地，均系野生。藏边大黄味酸、苦，性寒，藏医称曲扎(Quza)，是藏医的传统药材。申请号为201110124226.9名称为一种藏边大黄提取物及其制备方法的中国发明专利申请公开了一种藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物。该提取物含有结构式如式(I)的单体化合物：

式(I)

其中R₁是或H。该提取物中含有30％～99％的结构式如式(II)的单体化合物：

式(II)

结构式如式(II)的单体化合物可以经上述藏边大黄提取物经进一步萃取、洗脱制备得到，并经NMR分析鉴定为3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)(3，5，3′，4′-tetrahydroxystilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside)。基于与现有化合物的比对分析，初步确定3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷具有与何首乌成份2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷类似的生物活性，包括抗肿瘤、降低胆固醇、抑制动脉粥样硬化、保护肝脏、舒张血管、防治老年痴呆、提高记忆力等，能够应用于相关药物的开发。

参考资料：

西藏金哈达药业有限公司.一种藏边大黄提取物及其制备方法[P].CN201110124226.9.

吕丽爽.何首乌中二苯乙烯苷的制备及抗氧化机理研究[D].无锡：江南大学，2006.

发明内容

本发明的目的在于提供藏边大黄提取物用于制备预防治疗脂肪性肝病药物的应用，以及含有藏边大黄提取物的药物组合物在制备治疗或预防缺血性心脏病药物中的用途。

本发明的目的还在于提供3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)用于制备预防治疗脂肪性肝病药物的应用，以及含有PDG的药物组合物在制备治疗或预防缺血性心脏病药物中的用途。

脂肪性肝病(Fatty liver disease，FLD)又称肝内脂肪变性，是一种临床病理性的肝脏损伤，系指各种原因所致的肝脏脂肪(主要为甘油三酯(Triglyceride，TG))蓄积过多，超过肝脏湿重的5％，肝脏代谢平衡失调的病理状态。FLD是一系列病理性肝脏损伤的总称，可表现为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎，并可发展为肝纤维化和肝硬化。根据发病原因不同，脂肪肝可分为酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪肝两类，后者又可细分为肥胖性脂肪肝、营养失调性脂肪肝、药物性脂肪肝、妊娠急性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝等多类。根据肝组织病理学变化，可将脂肪肝分为三个时期：I期为不伴有肝组织炎症反应的单纯性脂肪肝，II期为伴有肝组织炎症和纤维化的脂肪性肝炎，III期为脂肪性肝硬化。

脂肪肝的发病机制至今尚未完全明确，目前的研究认为与脂质代谢异常、反应性氧体系(ROS)生成增多、肝脂质过氧化增加、肝星状细胞活化及细胞因子产生异常有关，而胰岛素抵抗(insulin resistant，IR)和氧应激(oxidativestress)被认为是其发病的中心环节。近年有些学者提出以氧化应激和脂质过氧化为轴心的“二次打击”假说。主要是指以胰岛素抵抗为主要特征的初次打击是肝细胞出现脂肪变，肝细胞对损伤的敏感性增加；再次打击及以后的多次打击是指各种原因引起的氧应激和脂质过氧化的增强，出现肝细胞的炎症、坏死和纤维化改变。脂肪肝之所以进一步发展，主要机制是氧应激和脂质过氧化的增强，加重氧应激和脂质过氧化的因素很多。一些因素如肝细胞色素p4502E1(cytochrome p4502EI，CYP2E1)表达增高、胰岛素抵抗、铁、内毒素和各种细胞因子造成脂质过氧化和氧应激，对肝脏进行第二次打击，同时促进病变进展，而导致脂肪变的肝细胞发生炎症、坏死和纤维化。

本发明所称的脂肪性肝病包括多种原因所致的以肝脏脂肪堆积、肝小叶脂肪性病变的脂肪性肝病，更针对性的所指是由酒精高摄入引发的酒精性脂肪肝。本发明将藏边大黄提取物，特别是3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)应用于预防治疗脂肪性肝病药物制备的药效原理主要在于两方面：

(1)藏边大黄提取物水溶液及PDG水溶液能够显著抑制脂肪性肝病肝细胞CYP2E1的表达，具有防止酒精性脂肪肝的作用。

乙醇(酒精)在体内的代谢过程主要在肝脏器官中进行，主要通过3条代谢途径，其中之一是滑面内质网上的微粒体乙醇氧化***(MEOS)。MEOS的主要成分是肝细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1，CYP2E1)。CYP2E1对肝的损伤主要表现在两方面：一方面，在MEOS中，乙醇由CYP2E1催化生成乙醛和自由基，自由基与细胞膜上的CYP2E 1结合引起抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)产生肝毒性使肝细胞损伤损。这种肝细胞损害的主要特征是集中分布在肝小叶中心区域；另一方面，脂肪肝之所以进一步发展，主要机制是氧应激和脂质过氧化的增强，加重氧应激和脂质过氧化的因素很多，其中CYP2E1为主要因素之一。肝脏发生脂肪性病变时CYP2E1呈诱导表达，诱导的CYP2E1可加重并协同胰岛素抵抗促进脂质在肝细胞内的沉积，CYP2E1代谢过程中氧应激增强，进一步增加脂质代谢异常同时增加脂肪变肝脏的二次打击，CYP2E 1还能启动和促进肝细胞纤维化，故CYP2E1参与了脂肪性肝病的形成过程。研究资料表明，酒精性或非酒精性FLD患者均存在着肝内CYP 2E1的上调表达。

本发明PDG用药的动物试验表明，大鼠酒精性脂肪肝模型肝组织中CYP2E1mRNA和蛋白在腺泡3区的表达增强并向2区弥散，同时伴随着脂质过氧化反应终产物MDA的升高和抗氧化剂SOD，GSH，VE含量的下降。在PDG干预下，PDG水溶液能同时降低脂肪肝大鼠血脂和肝中脂质的含量，阻碍初次打击对脂肪肝形成的作用；同时能显著增加抗氧化物SOD活性、GSH含量与VE含量，抑制氧化代谢产物MDA含量，显著降低CYP2E1的表达，因而能从提高机体抗氧化的能力、增加肝脏的能量供应、以及抑制CYP2EI表达方面阻断第二次打击对肝细胞脂肪病变的进展。

(2)PDG水溶液具有下调PPARγ表达，抑制肝细胞内脂肪生成的作用。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是由配体激活的核转录因子，属核受体超家族的成员。PPARγ主要表达于脂肪组织，作为脂肪细胞基因表达和胰岛素细胞间信号传递的主要调节者，参与调节脂肪细胞特异基因的表达、脂质贮存和代谢，与肥胖的发生、发展密切相关。PPARγ是最主要的脂肪形成调节因子，脂肪细胞分泌的基因表达信号分子如脂联素(Adiponectin)和抵抗素(Resistin)也由PPARγ激活所引发。PPARγ可通过调控肝脏内其他核因子如活性蛋白AP-1和NF-κB的表达，炎性细胞因子如TNF-a，IL-6的生成和肝细胞外基质的产生等，影响肝组织炎症、坏死、凋亡和纤维化的产生和发展，在FLD的发生、发展中起着十分重要的作用，与FLD发病机制的“二次打击”学说密切相关。正常肝细胞有一定量的PPAR-γ表达，在肝脂肪变明显及脂肪性肝炎形成时，PPAR-γ的表达较强。PPARγ在脂肪组织高表达，在脂肪细胞分化中起重要作用，其活化后能使转运至肌肉和肝脏的脂肪酸减少，脂肪合成降低，从而改善胰岛素抵抗，抑制脂代谢，若过度表达则产生严重的脂代谢紊乱。例如高脂饮食引起动物肝脏组织中PPAR-γ的高表达，促进了肝细胞的成脂性，从而引发脂肪肝。本发明的动物PDG用药试验表明，在PDG干预下，酒精性脂肪肝细胞模型甘油三酯水平降低，肝细胞内PPARγ表达明显减弱，表明PDG通过下调PPARγ表达抑制了细胞内脂肪生成。

基于藏边大黄提取物特别是PDG的药效原理，本发明提供以藏边大黄提取物为药效成分的药物组合物与以PDG为药效成分的药物组合物。此二者药物组合分别以藏边大黄提取物与PDG为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料并依照本领域的常规方法制备而成。所制得的药物组合可进一步制备成为药物制剂。基于现有植物提取物的制药技术，特别是现有制药技术对2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的应用，本发明制备的药物制剂可以是：口服给药的剂型诸如片剂、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊)、粉剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型诸如注射剂、栓剂、丸剂、凝胶剂和贴剂。此外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)用于本发明。上述制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。

本发明通过试验研究证明，藏边大黄提取物以及PDG对多种原因所致的实验动物脂肪性肝病变均有显著的保护作用，能够应用于治疗或预防脂肪性肝病变药物的制备。原料药藏边大黄是传统藏医药材，安全可靠；PDG经动物毒性试验同样证明具有药用安全性。

附图说明

图1-1、图1-2、图1-3是试验例三探针药物色谱行为图。

图2-1、图2-2、图2-3是试验例三体内药-时曲线图。

具体实施方式

下面通过相关试验例对本发明的内容做进一步描述。

试验例一

此试验例用以说明3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)通过显著抑制酒精性脂肪肝肝细胞色素CYP2E1的表达，起到防止酒精性脂肪肝的作用。

1、材料和方法

1.1主要试剂与仪器：

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)，依照CN2011101722069公开方法从藏边大黄药材中提取，纯度92.80％。PDG加入生理盐水配置成20mg·ml^-1水溶液，以下简称PDG水溶液；免抗鼠CYP2E1多抗CYP2E1质粒(Chemicon公司)。全长CYP 2 E1cDNA序列(1.6kb)组装在PGEM4质粒中。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学试剂盒(福州迈新生物技术公司)；DIG-DNA标记及检测试剂盒(德国Boebringer Mannheim公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、维生素E(VE)试剂盒(南京建成生物公司)。

1.2大鼠酒精性脂肪肝模型的建立及给药方法

清洁级昆明种小鼠48只，体重(22±2)g，雌雄各半(四川省中药研究所实验动物中心提供)大鼠正常喂养1wk后随机分为造模组(24只)和对照组(6只)。造模方法为：大鼠先随意饮用2％的蔗糖溶液3d，然后加入5％的乙醇(v/v)，每隔4d增加5％直至15％，然后再每周增加5％直至终浓度为40％。当大鼠饮用40％的乙醇16wk时，随机抽取2只处死观察肝脏的病变情况，经病理学检查证实有轻度的脂肪变后，剩余的12只随机分为病理模型对照组(I组)6只，药物防治组(II组)6只，在继续饮用40％的乙醇溶液的同时，每天每100克大鼠经口灌服1ml的PDG水溶液，时间为4wk，III组为对照组，给予大鼠同热量的葡萄糖溶液。三组大鼠均食用普通食料(脂肪占5％)，药物干预4wk后断头处死全部动物，取肝活组织标本作肝匀浆生物化学测定和病理学检查。

1.3肝匀桨的生物化学测定

取肝右叶1g，4℃下制成10％的匀桨，分别测定MDA，SOD，GSH，VE，以每克肝湿重组织的含量表示。按试剂盒说明书操作。

1.4病理学检查

取肝左叶，10％甲醛溶液固定，常规HE染色，观察脂肪肝的程度。CYP2E1、免疫组织化学染色，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化法，DAB显色，一抗CYP2E1多抗的工作浓度1∶400，操作流程按试剂盒说明书进行，每次试验均设阴性对照，以磷酸缓冲液替代一抗。

1.5原位杂交

切片常规脱蜡至水，蛋白酶K处理，以4％多聚甲醛于室温下进行后固定，每片滴加杂交液20μl左右(DIG标记cDNA探针0.5μg/ml，50％甲酞胺，Denhardit′s液，5％硫酸葡聚糖，200ng/L变性的蛙精DNA)，并覆盖大小合适的Parafilm膜，43℃湿盒内杂交过夜。第二天系列SSC洗涤，以封闭液封闭，将切片置于1∶500抗地高辛单抗中，室温6h，NBT+BCIP避光显色，TE液终止反应，核固红复染，中性树胶封片。阴性对照为不加探针的杂交液。

统计学处理：各组数据以

表示，用SPSS12.0软件进行统计处理。各组间用单因素方差分析(ANOVA)，各组之间的两两比较用SNK-q检验。

2结果

2.1肝内MDA和SOD、GSH、VE含量的变化

I组与III组相比，MDA含量显著升高，而SOD、GSH、VE含量显著下降；II组MDA和SOD、GSH、VE的含量又恢复至近似III组的水平(表1)。

表1三组大鼠肝内MDA和SOD、GSH、VE含量

^*I组与II相比，t＝8.735～14.360，P＜0.01，I组与III组相比，t＝-9.127～15.320，P＜0.01

2.2肝组织的病理学变化

(1)光镜下HE染色显示，III组动物肝组织的形态学表现正常；I组动物均出现了中度以上的肝细胞脂肪变性，脂肪变以腺泡III区为重，有少量炎性细胞浸润，并可见点状坏死，而II组的肝细胞排列整齐，形态接近III组。(2)光镜下SP免疫组织化学染色显示，III组的肝细胞CYP2E1表达局限在腺泡3区中央静脉边缘极少数几个肝细胞内；I组动物的肝细胞CYP2E1的表达在腺泡3区增强并向2区扩展，其分布与肝细胞的脂肪变的分布相一致，而II组肝CYP2E1表达与III组相似，在极少数脂肪滴周围有弱阳性。阴性对照未见着色。

2.3原位杂交检测

I组在mRNA水平杂交的阳性信号为胞浆内紫蓝色细密颗粒，在腺泡3区呈弥散性分布，与肝细胞脂变分布相一致，而II组与III组相似，未见CYP2E1mRNA阳性信号的表达。阴性对照未见着色。

本动物试验研究结果显示，PDG水溶液干预的肝组织脂肪变性基本恢复正常，免疫组织化学和原位杂交证明PDG能显著抑制脂肪肝肝细胞色素CYP2E1的表达，同时肝内MDA和SOD、GSH、VE含量恢复到接近正常。

试验例二

本试验例说明3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)下调PPARγ表达水平，防治脂肪肝的药效。

1材料和方法

1.1材料

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG水溶液，同试验例一)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，L02人正常肝细胞(重庆医科大学肝病研究所提供)，RPMI-1640培养基(美国GBICO公司)，PPARγ羊抗人多克隆抗体，Santa Cruz公司)，SP试剂盒(北京中山生物技术公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组用含10％胎牛血清的RP-MI-1640培养液培养人正常肝细胞株L02。以MTT法筛选出的亚致死量浓度乙醇作用于L02细胞，6d为周期传代，传代至第30代标记为Ld30。将PDG配成终浓度分别为0.568，1.136，2.273，4.545，9.090μg/ml的工作液，依次加人种植有Ld30细胞的96孔培养板，MTT法筛选出PDG最佳作用浓度。实验组：①PDG处理组将最佳作用浓度的PDG加入Ld30细胞培养液中，每3d给1次药，6d传代1次，观察30d；②脱离乙醉组不给药和乙醇，仅以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液培养Ld30细胞，6d传代1次，观察30d。

1.2.2透射电镜观察细胞超微结构取浓度为5×104个/ml的对数生长期细胞20ml接种于培养瓶中，培养72hr后消化细胞，1500r/min离心5min，弃上清，4℃冷戊二醛溶液固定细胞团块2hr，标本电镜检测。

1.2.3全自动生化仪检测细胞内TG水平计数细胞106个，1500r/min离心5min，冷PBS洗5min×3次，参照完全裂解2×105个细胞需200μl裂解液(Urea8mol/L，CHAPS 40g/L，Tris-HCl 40mmol/L，叠氮钠0.02％，pH 7.4)这一标准裂解细胞。4℃剧烈振荡、裂解30min，低温离心30min，收集上清液，送检。

1.2.4免疫细胞化学法观察PPARγ表达取浓度为5×104个/ml的对数生长期细胞接种于放有盖玻片的24孔板，培养72hr后，取出盖玻片PBS液冲洗5min×3次，95％乙醇固定45min，按SP试剂盒说明书操作。采用Morphology彩色显微图像分析***对表达结果进行分析，光镜下100倍放大，随机选择5个视野，检测阳性染色平均光密度值(MOD)，阳性表达指数(＝MOD×阳性细胞百分比×100)。

1.2.5统计学分析用SPSS 10.0 for Windows统计软件处理。检测数据以均数±标准差(

)表示，计量资料采用t检验，P＞0.05表示无显著性差异，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

2结果

2.1不同浓度的PDG作用于Ld30细胞72h后的MTT结果

不同作用浓度的PDG，对Ld30细胞生长影响不同。各工作浓度的PDG均有一定程度的抑制细胞生长作用，比较各组抑制率的大小后发现，随PDG作用浓度的增加，抑制率先表现为增加趋势，到作用浓度为2.273μg/ml时有所下降，然后再随作用浓度增加而增加。因此，选取2.273μg/ml作为本实验中PDG的作用浓度(表1)。

表1不同浓度的PDG作用ld30细胞72hR的MTT结果

注：

^*最佳作用浓度。

2.2透射电镜下细胞超微结构

Ld30细胞表面微绒毛明显减少，细胞核大畸形，胞浆凝聚；数目不一、大小不等的均质性脂滴弥漫散在分布；观察PDG组：细胞表面有微绒毛，胞浆内仍可见脂滴，但数量相对减少。

2.3细胞内TG水平

与Ld30组相比，脱离乙醇组TG水平有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)；而PDG组细胞内TG量减少却有极显著性差异(P＜0.01)(表2)。

表2细胞内TG水平

^*Ld30组与PDG处理组比较，P＜0.01；^◆Ld30组与脱离乙醇组比较，P＞0.05^▲Ld30组与L02组比较，P＜0.01

^*最佳作用浓度。

2.4免疫细胞化学观察PPARγ表达

实验中PPARγ表达的强弱根据Morphology彩色显微图像分析***所测得MOD值和阳性表达指数来判定。结果表明：与L02组相比，Ld30组PPARγ表达明显增强；与Ld30相比，PDG组PPARγ表达明显减弱(表3)。

表3PPARγ表达指标

^*★相比于Ld30组，P＜0.01

上述试验选用护肝素作用于体外酒精性脂肪肝细胞模型，观察30d。观察期满检测细胞内TG水平。结果显示PDG处理组细胞内TG明显降低，说明PDG可以减轻体外酒精性脂肪肝细胞模型的脂肪变性；试验结果同时显示脱离乙醇组细胞内TG水平也有所降低，与消除病因的临床治疗措施相符。试验进一步表明，与人正常肝细胞L02相比，体外诱导的酒精性脂肪肝细胞模型内PPARγ表达显著增强。通过PDG干预，则能下调PPARγ表达，抑制细胞内脂肪生成，减轻体外诱导的酒精性脂肪肝细胞脂肪变的作用。

试验例三

本试验例用以说明藏边大黄提取物能够显著抑制酒精性脂肪肝肝细胞色素CYP2E1的表达。

1材料与方法

1.1试验药物藏边大黄提取物，具体是藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物，依照CN2011101722069所述方法从藏边大黄药材中提取获得，本品约含30％3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)，为棕褐色粉末，实验时以生理盐水配制成40mg·ml^-1水溶液，经过0.22μm孔径滤膜滤过除菌后使用，以下称藏边大黄提取物水溶液。

1.2试剂探针药物：咖啡因(coffine)、氨苯砜(dapsone)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)(sigma-Acdrich公司)；内标：安替比林(antipyrine，天津市光复精细化工研究所)；乙腈、甲醇为色谱纯(天津科密欧化学试剂开发中心)，其他试剂均为分析纯；实验用水为重蒸水。

1.3动物同试验例一。

1.4仪器高效液相色谱仪：Agilent 1100，二极管阵列紫外检测器DAD；Agilent色谱化学工作站(美国安捷伦科技公司)；TGL-16G高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；XK96-A快速混匀器(江苏姜堰市新康仪器厂)。

1.5方法

1.5.1色谱条件色谱柱：EclipesXDB-C18柱(46mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(25∶75)，流速1.0ml·min^-1；检测波长：280nm；柱温：室温；进样量：20μl；内标：安替比林(20mg·l^-1)。

1.5.2藏边大黄提取物水溶液配制为浓度相当于原生药0.31g·ml^-1。将大鼠16只随机分为给药组和空白组。给药组每天清晨空腹灌胃给予藏边大黄提取物水溶液灌胃液一次，给药剂量1.1ml·100g^-1，空白对照组给予相同体积的生理盐水，诱导10天。

1.5.3血清样品的处理与测定藏边大黄提取物水溶液诱导后第10日晚上禁食，第11天早上在***麻醉下，于大鼠左侧股动脉处做插管手术，待动物苏醒后给予Cocktail探针药物咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗。咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗分别按10、10、20mg·kg^-1的剂量加入少量Tween 80研磨再加生理盐水制成乳浊液注射给药，并于给药后的0.17，0.5，0.83，1.17，1.5，2.0，2.5，3.0，5.0，8.0，12.0hr由插管处取血约0.25ml立即以8000rpm离心5min，准确取出100μl血清，加入安替比林工作液20μl混匀，再加入500μl氯仿，混悬震荡2min，以6000rpm离心8min，取有机相氯仿400μl挥干后加乙腈-水(1∶1)溶液100μl溶解，取20μl进样。

1.5.4药代动力学参数计算及分析方法药动学计算采用DAS 2.0软件完成，选用非房室分析方法-统计矩进行拟合。

2结果

2.1色谱行为图中A、B、C分别是空白血清、加入探针药物的血清和体内注射探针药物后的血清在上述色谱条件下进行分析所得的液相色谱图。图1-1、图1-2、图1-3中，A——空白血清；B——加入探针药物的血清；C——体内注射探针药物后的血清；1——咖啡因；2——安替比林(内标)；3——氨苯砜；4——氯唑沙宗。由该图可见咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗3种探针药物与内标的分离良好，空白血清实验也未见干扰。

2.2标准曲线取空白血清100μl加入3种探针药物，使血清中咖啡因的浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，16.0mg·μl^-1，氨苯砜的浓度分别为0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.5mg·μl^-1，氯唑沙宗的浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，25.0mg·μl^-1，加入内标液20μl按血清样品处理方法处理，以探针药物和内标的峰面积之比S对探针药物的浓度C(mg·μl^-1)作线形回归，得回归方程，咖啡因：S＝0.4079C+0.068，r＝0.9999；氨苯砜：S＝1.4066C-0.2481，r＝0.9998；氯唑沙宗：S＝0.3069C-0.0039，r＝0.9971。最低定量限分别为：0.5，0.25，0.5mg·μl^-1。

2.3精密度配制低、中、高三种浓度：咖啡因(1.0，4.0，16.0)mg·μl^-1，氨苯砜(0.5，2.0，12.5)mg·μl^-1，氯唑沙宗(1.0，4.0，25.0)mg·μl^-1的血清模拟样品各5份，照血清样品处理方法处理，计算日内精密度；连续测定5日，计算日间精密度，三种探针药物的日内、日间精密度的RSD值均小于5.60％。

2.4回收率取低、中、高三种浓度：咖啡因(1.0，4.0，16.0)mg·μl^-1、氨苯砜(0.5，2.0，12.5)mg·μl^-1、氯唑沙宗(1.0，4.0，25.0)mg·μl^-1的血清模拟样品各5份，测得加样回收率，分别为：咖啡因(103.70±2.95，101.33±1.22，99.91±1.14)％、氨苯砜(107.39±4.42，96.26±4.78，100.45±1.48)％、氯唑沙宗(105.72±3.25，95.69±3.08，102.20±1.85)％。

2.53种探针药物的药-时曲线对照组、PDG组的Wistar雄性大鼠注射Cocktail探针药物后，各时间点采血，按2.1色谱条件测定分析，3种探针药物的血药浓度±时间曲线，如图2-1、图2-2、图2-3，图中A——咖啡因；B——氨苯砜；C——氯唑沙宗。

2.63种探针药物的药动学参数采用DAS2.0程序，将不同时间血药浓度数据对时间进行拟合，采用统计矩方法计算药动学参数，见表1。咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗分别由肝药酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1代谢，作为探针药，这三种药的药动学参数变化尤其是半衰期的变化反应着PDG对大鼠肝药酶的影响。从上表可看出，在藏边大黄提取物水溶液的影响下只有氯唑沙宗半衰期与对照组比显著延长，其他各组的半衰期均无统计学意义。

表1大鼠血清中的3种探针药物药动学参数(n＝8)

与对照组相比^*P＜0.05。

上述动物试验采用Cocktail探针药物法评价了藏边大黄提取物对CYP450的影响。探针药物包括咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗，分别检测CYP450酶系的3种主要代谢酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1的活性。表1结果显示藏边大黄提取物水溶液组中氯唑沙宗的代谢减慢，t_1/2延长，咖啡因、氨苯砜的代谢与对照组变化不明显。这表明藏边大黄提取物对CYP2E1具有抑制作用，对CYP1A2、CYP3A4作用不明显；因此当藏边大黄提取物与通过CYP2E1酶代谢的药物合用时，需密切留意血药浓度的变化，以避免可能发生的药物相互作用。

试验例四

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的化合物毒性试验。

1、实验材料

实验动物：ICR小鼠，雄性，体重18～22g，由四川大学华西实验动物中心提供(合格证号：1037764)。

实验化合物：3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(从依实施例二方法从藏边大黄药材中提取获得，含量92.80％)。

2、试验方法和结果

将本发明化合物作为试验样品给小鼠灌服进行急性毒性试验。结果显示：小鼠灌服本发明化合物的最大耐受量为20g·kg^-1·24hr^-1，约为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷药物的服用剂量标准(60kg体重成人口服日用量1.2g·kg^-1·24hr^-1)的1000倍；小鼠一次性灌服的LD50为15.2g/kg，95％置信限为22.60～34.23g/kg。

长期毒性试验表明，大鼠每日灌服本发明化合物0.4、0.8、1.6g·kg^-1(相当于2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷药物临床量的20、40、80倍)，24周后血液学、血液生化学指标、脏器系数和对照组比较均无明显差异，病理检查结果亦未见保健食品引起的病理性改变。停用发明化合物2周后，各给药组的各项指标与空白对照组比较，均无明显差异，提示该化合物无明显延迟性毒性。说明本发明化合物长期服用也是安全的。