CN102232114A - 用于数字pcr的方法 - Google Patents

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CN102232114A CN2009801378240A CN200980137824A CN102232114A CN 102232114 A CN102232114 A CN 102232114A CN 2009801378240 A CN2009801378240 A CN 2009801378240A CN 200980137824 A CN200980137824 A CN 200980137824A CN 102232114 A CN102232114 A CN 102232114A
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Abstract

本发明提供了进行核酸反应的方法，包括使用“油包液滴”技术进行数字PCR的方法。在该方法中，将起始样品至少部分分割成一组样品液滴，每个液滴平均包含大约一个或更少的拷贝的靶核酸。使液滴在穿过通道的不混溶载液的持续流中通过热循环仪，其中靶标被扩增。在一个实施方式中，每个液滴是大约350nl，在接近饱和点时计数阳性扩增的液滴数目。

Description

用于数字PCR的方法
相关申请
本发明要求2008年8月12日提交的美国临时申请号61/088,142的优先权，该申请的内容通过引用并入。
技术领域
本发明涉及用于进行核酸扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)的方法和设备。
背景技术
PCR是在医学和生物研究领域常规使用的分子扩增方法，其用于多种任务，例如检测遗传性疾病、鉴定遗传指纹、诊断传染性疾病、克隆基因、亲子鉴定和其它类型的核酸分析。关于PCR方法的综述，参见例如PCR Protocols(Methods in Molecular Biology)，Barlett andStirling(编)，Humana Press(2003)；和PCR，McPherson and Moller，Taylor & Francis(2006)。
数字PCR是允许扩增来自最小稀释的样品的单一DNA模板的技术，因此，其产生专有性地来源于一个模板的扩增子，所述扩增子可以通过使用不同的荧光团进行检测并且可以被测序以区分不同的等位基因(例如野生型相对于突变体，或者，父本的相对于母本的等位基因)。关于数字PCR方法的综述，参见例如Pohl等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，4(1)：41-7(2004)。该技术的基本前提是将大的样品分成数个较小的亚体积(分割的体积)，其中所述亚体积平均包含单一拷贝的靶标。然后，通过计数所述亚体积中的阳性数目，人们可以推导出起始体积中的靶标的起始拷贝数。最常见的是使用多个连续稀释的起始样品以获得亚体积中的适当浓度，通常通过给定的PCR设备测定亚体积的体积。这个另外的步骤增加了要处理的样品的数目。可以测定在统计上代表整个样品的一组亚体积，以减少该数目。但是，在某些状况下，可能需要检测表达程度非常低的基因，导致产生大量的空白的分割的体积，因此，要评估大量的亚体积。虽然在这种情况下使样品更加浓缩是可能的，但是这样做可能引入显著的可变性和损失(参见，例如N.Blow，NatureMethods，4：869-875(2007))。此外，更加浓缩的样品意味着起始时需要更多的样品。
进一步的考虑提示减小扩增反应的体积可能改善检测单一分子的灵敏性。例如，
Figure BDA0000052312830000021
测定法需要接近饱和的量的PCR扩增产物以检测荧光。PCR反应通常在大约1011个产物分子/微升时达到饱和，这部分是由于产物链的重新退火。为了在10μl中在30个循环后达到这样的产物浓度，PCR需要至少103个起始模板分子。如果PCR的体积减少至～10纳升，则单个分子可以产生被
Figure BDA0000052312830000022
测定法检测的所需要的产物。已经尝试使PCR的体积小型化(综述参见例如Zhang等人，Nucl.Acids Res.，35(13)：4223-4237(2007))。但是，随着样品体积的减小，由于逐渐增大的表体比和潜在的其它可变性来源，扩增会更有可能产生生物化学表面吸附的问题。
因此，需要精确测定或定量靶标拷贝数的方法和设备，包括通过数字PCR的方式进行。
发明内容
本发明提供了进行核酸反应的方法，包括通过使用“油包液滴”(droplet-in-oil)技术进行数字PCR的方法，其中样品被分割成液滴，所述液滴置于通过微流通道的载液的持续流中。此类技术的一个实例描述于PCT专利申请公开号WO 2007/091228(对应美国系列号12/092,261)、WO 2007/091230(USSN 12/093,132)和WO 2008/038259以及实施例中。在被称为“持续流PCR”的这些***中的一些之中，液滴在整个反应和检测过程中被完全包裹在载液中。本发明至少部分基于实现了10-500nl的样品滴提供了通过PCR分析低度表达的靶标的优势。以下描述了本发明的各个方面。
在一些实施方式中，方法包括：
a)提供包含待测靶核酸的起始样品；
b)分割至少一部分样品以提供在通过通道(例如毛细管)的不混溶载液(例如油)的持续流中的一组样品液滴，每一个所述液滴平均包含大约1个或更少的拷贝的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的试剂；
c)使所述液滴通过多个热区(thermal zone)，从而允许靶核酸，如果存在的话，在每个液滴中被扩增；和
d)检测所述流中的液滴中的扩增的靶核酸的存在或不存在，和/或测定其数量。
样品液滴的体积是0.1pl-500nl，优选是10-500nl，更优选是30-350nl，而起始样品的体积是0.05-5000μl，优选是5-3500μl。这些体积可以包括在检测步骤之前添加的反应剂(例如引物溶液)的体积。在一些实施方式中，所述液滴是球形的。在一些实施方式中，将通过分割起始样品产生的液滴与包含一个或多个针对靶核酸的引物的第二组液滴合并，从而产生用于扩增反应的最终的液滴。
在一些实施方式(实时检测)中，在多个热循环下进行检测或测定数量的步骤，从而监视例如进行qPCR或实时PCR中所有循环下的扩增的靶核酸的量。通常而言，热循环进行至少数个达到接近饱和的扩增水平所需的循环。循环的数目取决于靶标的浓度和其它条件，通常是20-40个循环。
在优选的实施方式(末端点检测)中，在达到接近饱和点之后进行检测或测定数量的步骤。对于末端点检测，可以通过计数给定液滴组中阳性扩增的液滴数来测定靶核酸的起始拷贝数。
被分析的组中的液滴数目是这样的：它们的组合体积代表了起始样品。液滴组包含整个起始样品或仅包含其一部分，这取决于存在于或怀疑存在于起始样品中的靶核酸的拷贝数。可以通过稀释或通过浓缩起始样品来调整靶核酸的起始浓度。在诠释性的实施方式中，液滴组包含一串10个液滴，在起始样品中有0.005ng/μl cDNA。
本发明还提供了平行处理多个起始样品的方法，其中至少一些起始样品具有a)不同浓度的靶核酸；和/或b)不同的靶核酸。在一些实施方式中，来自不同起始样品的液滴组形成在通道中的载液的持续流中的一串交替液滴。以下具体描述了本发明的这些和其它实施方式。
附图说明
图1诠释了在4个浓度的GAPDH cDNA：5、0.5、0.05和0.005ng/μl下的连续稀释的样品的扩增曲线。按照实施例1中的描述进行扩增。每条扩增曲线与阈值(本文中设定为0.3)的交叉点确定了Ct值。
图2显示了Ct值作为基于图1显示的结果的浓度的函数。线的斜率允许测定扩增效率。
图3显示了来自具有逐渐降低的模板浓度(如图1所示)的4组10个液滴的荧光信号。图中比较了在第7个循环(图3A)和第42个循环(图3B)获取的荧光测定值。
图4显示了基于实施例2中描述的研究的扩增痕迹。图4A显示了在第42个循环时的无模板对照(NTC)液滴与7个浓度渐增的样品的液滴荧光痕迹。图4B显示了10个1650pg/μl液滴的扩增曲线。图4C显示了从Ct数据产生的标准曲线，其显示了在300nl液滴中的接近单分子的检测。
图5显示了如实施例3中的描述进行的来自具有0.005ng/μl cDNA的300μl样品的一组3,000个液滴的典型的PCR热循环痕迹。
具体实施方式
一般方法
本发明提供了在包含或怀疑包含待测靶核酸的样品中进行核酸扩增反应例如PCR的方法。虽然本文描述的方法使用PCR作为所选的扩增方法，但是替代性的核酸扩增技术可以类似地应用以替代PCR。此类技术包括例如，连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增***(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、超分支滚环扩增(HRCA)等。
本发明大体上涉及所谓的“数字PCR”以及类似方法，其允许人们通过将起始样品分割成较小的反应体积(其中多数包含1个拷贝或更少的靶标)而定量核酸模板的起始拷贝数。
本发明的方法可用于测定核酸靶标的存在数量，以及例如用于基因表达分析，其对于低度表达的基因是特别有用的。
一般地，本发明的方法至少包括以下步骤：
a)提供包含待测靶核酸的起始样品；
b)分割至少一部分样品以提供在通过通道(例如毛细管)的不混溶载液(例如油)的持续流中的一组样品液滴，每一个所述液滴平均包含大约1个拷贝或更少的拷贝的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的试剂；
c)使所述液滴通过多个热区，从而允许靶核酸，如果存在的话，在每个液滴中被扩增；和
d)检测所述流中的液滴中的扩增的靶核酸的存在或不存在，和/或测定其数量。
在一些实施方式中(“实时检测”)，在多个热循环下进行检测或测定数量的步骤，从而监视例如进行qPCR或实时PCR中所有循环下的扩增的靶核酸的量。通常而言，热循环进行至少数个达到接近扩增的饱和水平所需的循环。循环的数目取决于靶标的浓度和其它条件，通常是20-40个循环。Ct对靶标浓度的依赖性诠释于实施例1。在一些此类实施方式中，通过测定每个循环下的扩增进程来确定靶核酸的Ct值。“实时”检测可用于构建标准曲线以及用于定量测试样品中的靶标。
在优选的实施方式(末端点检测)中，在达到接近饱和点之后进行检测或测定数量的步骤。对于末端点检测，可以通过计数给定液滴组中阳性扩增的液滴数来测定靶核酸的起始拷贝数。
液滴和样品
起始样品包含(或怀疑包含)至少一个靶核酸。如本文使用的术语“起始样品”是指从中产生液滴的样品。例如，起始样品可以置于常规的384孔板的孔中，从中取出样品液滴。起始样品的体积可以变化，可以是例如0.05-5000μl，优选5-3500μl，例如5-1000μl，50-500μl，100-350μl。在一些实施方式中，将通过分割起始样品产生的液滴与第二组包含一个或多个针对靶核酸的引物的液滴合并，以产生最终的液滴。在一些实施方式中，起始样品包含至少2、5、10、100、1000或更多个拷贝的靶核酸。
样品液滴的体积是0.1pl-500nl，优选1pl-500nl，10pl-500nl，100pl-500nl，1-500nl或10-500nl，更优选30-350nl。在一些实施方式中，样品液滴的体积是50-500，100-500，150-500，200-500，50-400，100-400，150-400，200-400，50-300，100-300，150-300，200-300或150-250nl。这些体积可以包括在检测步骤之前加入的反应剂(例如引物溶液)的体积。在一些实施方式中，所述液滴是球形的；而在其它实施方式种，液滴沿着通道的轴伸长。
被分析的组中的液滴数目是这样的：它们的组合体积代表了起始样品。液滴组包含整个起始样品或仅包含其一部分，这取决于存在于或怀疑存在于起始样品中的靶核酸的拷贝数。例如，一组总共包含起始样品体积的10％的液滴可以认为代表包含100个拷贝的靶核酸的起始样品。因此，取决于所分析的液滴组的预期数目，所述组可以包含数个液滴至数千个液滴。在一些实施方式中，给定靶核酸的液滴组包含例如5-10000个液滴，例如100-5000，5-1000，100-500，5-50，6-30，10-25，8个或更多，或者10个或更多个液滴。在其它实施方式中，至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％的起始样品或全部起始样品被分割成液滴。
标准的数字PCR旨在确定：样品在何种稀释度时仅有一半的分割体积是阳性的。该稀释度表示：对于每个分割体积，靶核酸平均被稀释至1/2。本方法允许人们分析数目多得多的分割体积，其中很多可以是空白的。在一些实施方式中，组中至少30％，40％，50％60％，70％，80％，90％，95％，99％或更多的液滴不包含靶核酸。例如，对于末端点检测，10或更多(例如20，50，100，1000，5000或10000)的组中少于50％(例如30％，20％，10％，5％或更少)的液滴被阳性扩增。因此，在一些实施方式中，不论体积是多少，起始样品包含一个基因组当量的核酸或更少的核酸。在一些应用中，可以假设DNA的量是～3pg/基因组(例如3.3pg/基因组)。
可以将样品分成重复份(例如重复两份、重复三份等)，测定其中的表达水平。样品可以源自相同的来源，并且在扩增之前分成重复份。另外，可以产生样品的连续稀释物。可以以连续或平行方式分析重复份样品和稀释样品。在平行处理***中，对应于单独的起始样品的液滴组形成交替液滴的序列，其通过热循环仪，液滴在所述热循环仪中被扩增，例如见WO 2008/038259中的描述。可以按照这种方式平行地处理具有不同浓度的靶核酸和/或不同靶核酸的多个起始样品。
样品可以含有来自获得的细胞或组织例如细胞或组织裂解物或提取物的物质。提取物可以包含富含亚细胞组件例如来自高尔基复合体、线粒体、溶酶体、内质网、细胞膜和细胞骨架等的亚细胞组件的物质。在一些实施方式中，生物样品包含获自单个细胞的物质。生物样品可以来自多种来源。例如，生物样品可以获自来自发育、分化或疾病状态的不同时期的以及来自不同物种(人类和非人类，包括细菌和病毒)的整个生物体、器官、组织或细胞。样品可以代表不同的治疗状况(例如来自化学实验室的测试化合物)、组织或细胞类型，或来源(例如血液、尿液、脑脊髓液、***、唾液、痰、粪便)等。从生物样品中提取核酸的多种方法是已知的(参见，例如Nucleic Acids Isolation Methods，Bowein(编)，American Scientific Publishers(2002)。通常而言，基因组DNA获自经历机械剪切以产生随机的长片段的核提取物。例如，可以根据生产商的说明书使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit从组织或细胞中提取基因组DNA。
在分析RNA(例如mRNA、siRNA等)的情况下，例如，如在基因表达分析的情况下，在进行PCR之前首先将核酸逆转录为cDNA。这种类型的PCR通常被称作“RT-PCR”，在实施例中有解释。
油包液滴***
任何合适的设备都可用于实施本发明的方法。一般地，PCR设备包括样品制备***、热循环仪和检测装置。在样品制备过程中，将样品分割成液滴，所述液滴被包裹在不混溶流体(例如硅油、矿物油)中，所述流体持续流过通道，例如具有圆形截面的毛细管。包裹了每个液滴的油避免了连续液滴与遗留污染之间的交叉污染。样品可以预先与引物混合，或者可以将引物加入至液滴中。在一些实施方式中，将通过分割起始样品产生的液滴与第二组包含一个或多个针对靶核酸的引物的液滴合并，以产生最终的液滴。可以使用例如在WO 2007/091230(USSN12/093,132)和WO 2008/038259中描述的一种或多种液桥实现液滴的合并。
可以使来自制备***的液滴队列通过热循环仪。通过控制载液的速度(载液速度由外部泵***控制)来确定通过装置的样品的速度。随着样品穿过整个热装置的N个扩增循环，其经历相同的热循环和化学反应。这导致在每个循环之后产生最大2倍的扩增和I(1+E)N的总扩增，其中I是最初产物，E是反应效率，N是循环数目。在每个样品液滴中包含荧光探针。在每个循环例如在实时PCR的情况下，检测每个液滴中的荧光水平。这可以包括使用荧光探针，例如
Figure BDA0000052312830000081
深针，和***荧光染料，例如SYBR Green和
Figure BDA0000052312830000082
如描述于例如美国专利号5,723,591和5,928,907；www.idahotech.com；Gudnason等人，NucleicAcids Res.，35(19)：e127(2007)；以及实施例中。
用于本发明的方法的示例性***描述于例如PCT专利申请公开号WO  2007/091228(USSN 12/092,261)；WO 2007/091230(USSN12/093,132)；和WO 2008/038259。一种此类***由Stokes Bio(www.stokebio.ie)生产。其它适合用于本发明的方法的示例性***描述于例如Zhang等人Nucleic Acids Res.，35(13)：4223-4237(2007)，包括由Fluidigm(www.fluidigm.com)，RainDance Technologies(www.raindancetechnologies.com)，Microfluidic Systems(www.microfluidicsystems.com)；Nanostream(www.nanostream.com)和Caliper Life Sciences(www.caliperls.com)生产的那些。关于另外的***，参见例如Wang等人，J.Micromech.Microeng.，15：1369-1377(2005)；Jia等人，38：2143-2149(2005)；Kim等人，Biochem.Eng.J.，29：91-97；Chen等人，Anal.Chem.，77：658-666；Chen等人，Analyst，130：931-940(2005)；Munchow等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，5：613-620(2005)；Charbert等人，Anal.Chem.，78：7722-7728(2006)；和Dorfman等人，Anal.Chem，77：3700-3704(2005)。
以下实施例提供了本发明的诠释性实施方式，不仪任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：通过连续稀释法测定qPCR扩增效率
从培养的细胞中提取总RNA，将其逆转录为cDNA并用作qPCR反应的模板。模板的起始浓度是5ng/μl，然后将其稀释10倍至0.5ng/μl。重复进行该10倍稀释，产生具有以下4种浓度的cDNA模板的样品：5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl和0.005ng/μl。使用Stokes Bio设备(www.stokesbio.ie)获得的扩增曲线显示于图1。如图所示，对于较低的起始浓度的模板，需要更多的PCR循环以使荧光信号达到阈值水平。事实上，如果PCR反应的效率是100％，就达到相同的阈值而言，0.5ng/μl的样品所需的PCR循环数将比5ng/μl的样品(其为0.5ng/μl的样品的10倍)多3.32个。扩增曲线达到阈值时的小数循环被称作Ct值：其为样品的基因表达的度量。将阈值设定为0.3，读出图1中每组扩增曲线的相应Ct值。在图2中将Ct值针对cDNA浓度作图。分析该数据提示最佳拟合线的斜率是-3.53±0.13，由此估计扩增效率是92％±4％，其落在标准PCR***如Applied Biosystems的7900HT的qPCR的预期范围内。
图3A显示了使用Stokes Bio设备，来自50个循环扩增中的第7个循环的荧光信号。每个小的信号峰代表一个液滴通过。最左侧的信号峰代表引导液滴。每组液滴的浓度介于0.005至5ng/μl范围内，如图所示。清晰地显示了数据的两个方面——存在来自油填充的毛细管的背景荧光，以及来自每个液滴的背景信号——二者都是恒定的。图3B显示了当扩增完成时的第42个循环的相同液滴。注意：一组10个中的每个液滴的信号在液滴与液滴之间存在差异。这是由于对于每个通道的光***是不同的。在数据处理过程中可以容易地校正该效应。在最高稀释水平(0.005ng/μl)，10个液滴中仅有4个被扩增。这是统计上的效应，对于该水平的模板稀释和液滴体积是预期到的。将数据处理算法设计为将这个方面考虑在内。
实施例2：高通量qPCR性能验证
基因表达的分析是功能基因组学中必不可少的方面，基于qPCR的表达特征谱是精确监视所选基因的黄金标准。基因表达依赖于mRNA逆转录为cDNA。但是，一般不可能使用cDNA作为mRNA的绝对值定量的标准物，因为没有针对逆转录步骤的效率的对照。本实施例呈现了来自基因组DNA(gDNA)的Stokes Bio的扩增代表性性能数据，其被普遍用于标准的qPCR。
RNase P基因引物和探针组用于评估仪器性能。RNase P基因是编码RNase P酶的RNA部分的单拷贝基因。从已知的gDNA拷贝数的贮液产生数个2倍稀释物。这些稀释物用于制备完整的qPCR反应物，以用于在Stokes Bio仪器中扩增。表1显示了7个反应组的每一个的gDNA模板浓度与相应的平均Ct值，以及估计的起始拷贝数。无模板对照(NTC)也包括在内，并且显示无扩增。图4A显示了3个NTC反应(7组，每组10个300nl的液滴)的液滴荧光痕迹。从不同浓度的样品取出每个组，每组10个重复份。***的小图显示了对于每个300nl的液滴的非常好的数据分辨率。图4B显示了具有26.4的Ct值的最浓缩的反应组的经校正的扩增图。图4C显示了从表1中的Ct数据得出的标准曲线。误差条表示10个重复份的组的每一组的Ct范围。Ct差异可归因于泊松噪声，或在给定浓度的液滴与液滴之间的起始拷贝数之间的差异。
表1
  gDNA(pg/μl)   平均Ct   标准偏差   每300nl反应的拷贝数＊
  1650   26.4   0.11   150
  825   27.7   0.16   75
  412   28.9   0.35   37.5
  206   29.8   0.44   18.75
  103   30.9   3.4   9.4
  51.5   31.6   0.76   4.7
  25.75   32.47   0.76   2.34
＊使用1个拷贝/3.3pg测定
实施例3：数字PCR末端点检测
该技术的前提是将大的体积分成不连续数目的较小体积，从而减少每个样品中的拷贝数，通过扩增方法在形成的液滴中进行荧光检测。然后，通过扩增得到的总的液滴数可用于确定起始拷贝数。其还可用于稀有靶标的检测，其中对于稀有靶标而言，扩增的统计学概率增加，因为背景分子的数目由于分割而被降低。
使用统计学预测模型，可以产生分布于分割的液滴中的靶分子的概率。这对于低浓度样品而言尤其具有重要意义，因为其提供了包含分子的液滴数的预测，并因此提供了预期发荧光的液滴数的预测。
所用的二项分布模型是在很多常见情形中出现的离散概率分布。公认的二项分布的实例是计数固定数目的独立扔硬币时出现的头像数；在本例中，其是计数从原始样品中产生的固定的已知数目的液滴中的拷贝数。在n个独立试验的系列中，或n个独立拷贝中，每个试验或拷贝产生成功(被计数的结果)或失败。换言之，每个拷贝具有两种可能结果，其进入被监视的液滴或不进入。对于被分割为3000个液滴的样品，每个拷贝具有相同的成功概率p：对于每个被监视的液滴是1/3000。二项分布模型计数固定数目的试验中的成功数。二项分布完全由两个参数n和p确定：n是主体积中的cDNA拷贝数；p是每个拷贝共同的成功概率。因此，知晓拷贝数和液滴的数目允许使用二项分布。
图5显示了0.005ng/μl样品的典型痕迹。在此显示的数据使用300μl的样品体积，其被分割为～3000个体积为100nl的液滴。
在另一个实验中，数字PCR包括从最小稀释的样品扩增单一DNA模板，产生专有性地源自一个模板的扩增子。其将获自常规PCR的指数模拟信号转化为线性数字信号，因此允许对PCR产物进行统计学分析。
为了确定对应于靶核酸序列的拷贝数的基因组DNA的质量，使用以下公式
N＝(mxNA)/M
M＝nx1.096x 10-21g/bp
其中n是碱基对的数目，m是DNA的质量，NA阿伏伽德罗常数(6.02X1023bp/mol)，M是碱基对的平均分子重量。
对10ng/μl的人类基因组DNA进行连续2倍稀释。感兴趣的基因是RNAse P基因，其以单个拷贝/单倍体基因组存在。基于以上公式，每350nl液滴中的RNAse P基因的拷贝数显示于表2。
表2
每个基因组的DNA质量假设为3.3pg/基因组。使用Stokes HTI，在一系列10个无模板对照(NTC)、然后在10个体积为350nl的液滴中以每一拷贝数进行PCR扩增。结果表明：在较少的拷贝数时，出现液滴的不连续扩增。该扩增的S-曲线分析似乎表明循环阈值(Ct)集中在特定的Ct值。
本文中引用的所有公开物、专利、专利申请和生物序列均通过引用方式全文并入。

Claims (23)

1.进行核酸扩增反应的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的起始样品；
b)分割至少一部分样品以提供在通过通道的不混溶载液的持续流中的一组样品液滴，每一个所述液滴平均包含大约1个或更少的拷贝的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的试剂；
c)使所述液滴通过多个热区，从而允许靶核酸，如果存在的话，在每个液滴中被扩增；和
d)检测所述流中的液滴中的扩增的靶核酸的存在或不存在，和/或测定其数量。
2.权利要求1的方法，其中每个液滴的体积是0.1pl-500nl。
3.权利要求2的方法，其中每个液滴的体积是10-500nl。
4.权利要求3的方法，其中每个液滴的体积是30-350nl。
5.权利要求1的方法，其中代表整个样品的一部分样品被分割成液滴。
6.权利要求5的方法，其中起始样品包含至少10个拷贝的靶核酸并且至少10％的样品被分割。
7.权利要求5的方法，其中液滴组包含5-50个液滴。
8.权利要求5的方法，其中来自起始样品的液滴组包含100个或更少的液滴，每个液滴为500nl或更少。
9.权利要求1的方法，其中8个或更多个的组中的50％的液滴不包含靶核酸。
10.权利要求1的方法，其中步骤d)在多个热循环下进行，从而监视所有循环中所扩增的靶核酸的数量。
11.权利要求1的方法，包括测定靶核酸的Ct值。
12.权利要求1的方法，其中在饱和之后计数阳性扩增的液滴的数目。
13.权利要求12的方法，其中10个或更多个的组中的少于50％的液滴被阳性扩增。
14.权利要求1的方法，其中所述方法包括逆转录mRNA以制备起始样品。
15.权利要求1的方法，其中所述起始样品包含一个基因组当量的核酸或更少的核酸。
16.平行处理多个起始样品的方法，每个根据权利要求1进行处理，其中至少一些起始样品具有a)不同浓度的靶核酸；和/或2)不同的靶核酸。
17.权利要求16的方法，其中所述平行处理包括来自不同样品的液滴组，其构成通道中的持续流中的一串交替液滴。
18.权利要求1的方法，其中所述液滴保持包裹在流体中的不混溶载液内。
19.权利要求1的方法，其中所述通道包括具有圆形截面的毛细管。
20.权利要求1的方法，其中所述液滴是球形的。
21.权利要求1的方法，其中将通过分割起始样品产生的液滴与第二组包含一个或多个针对靶核酸的引物的液滴合并，以产生最终的液滴。
22.权利要求21的方法，其中使用一个或多个液桥合并所述液滴。
23.进行核酸扩增反应的方法，所述方法包括：
a)提供包含大约1个基因组当量的核酸的起始样品；
b)分割至少一部分样品以提供在通过通道的不混溶载液的持续流中的一组至少10个样品液滴，所述液滴包含足以进行聚合酶链式反应的试剂；
c)使所述液滴通过多个热区，从而允许靶核酸，如果存在于液滴中的话，被扩增至接近或超过饱和水平；和
d)检测所述流中的液滴中的扩增的靶核酸的存在或不存在，和/或测定其数量。
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