CN110066856A - 不同体积数字pcr定量分析方法 - Google Patents

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CN110066856A CN201810070368.3A CN201810070368A CN110066856A CN 110066856 A CN110066856 A CN 110066856A CN 201810070368 A CN201810070368 A CN 201810070368A CN 110066856 A CN110066856 A CN 110066856A
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Abstract

通过不同体积数字PCR的定量分析方法，可以获得的ln(c)相应的标准差σ以及置信区间。通过ln(c)相应的标准差σ以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，因此也可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。所述不同体积数字PCR的定量分析方法可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，提高了数字PCR检测仪器的检测动态范围。并且，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。

Description

不同体积数字PCR定量分析方法
技术领域
本发明涉及数字PCR定量分析领域，特别是涉及一种不同体积数字PCR定量分析方法。
背景技术
数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。但是，目前数字PCR定量检测无论是微孔式还是液滴式的数字PCR技术，采用的都是是单一体积数字PCR技术。
单一体积数字PCR的定量上限主要取决于反应单元的体积和数量，检测下限与样本总体积相关。单一体积数字PCR的定量分析方法需要连续对待测核酸扩增反应液进行稀释，增加了试剂的用量和交叉污染的风险，操作步骤繁琐。因此，单一体积数字PCR的定量分析方法缩小了数字PCR检测仪器的检测动态范围，从而无法提高检测灵敏度。
发明内容
基于此，有必要针对单一体积数字PCR的定量检测方法灵敏度低的问题，提供一种检测动态范围大的的不同体积数字PCR定量分析方法。
本发明提供一种不同体积数字PCR的定量分析方法，包括：
S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm；
S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；
S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；
S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；
S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述待测核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。
在其中一个实施例中，所述S4310包括：
S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v1，v2，...vm的微液滴，所述微液滴体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm；
S4313：将所有微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所述所有微液滴的荧光图像；
S4315：根据所述所有微液滴的荧光图像，获取所述所有微液滴的体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。
在其中一个实施例中，所述S4310还包括：
S4312：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，形成多个微液滴；
S4314：将所述多个微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所有微液滴核酸扩增后的荧光图像；
S4316：根据所述荧光图像，获取所述所有微液滴核酸扩增后的体积，所述体积分别为v1，v2，...vm，所述体积分别为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。
在其中一个实施例中，所述S4320构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)为：
在其中一个实施例中，所述S4330包括：
S4331：将所述联合二项分布函数f(c)求导，获取所述联合二项分布函数f(c)的导数；
S4332：将所述联合二项分布函数f(c)的导数为0，获取所述联合二项分布函数f(c)取极值时的待测核酸扩增反应液浓度c的值。
在其中一个实施例中，所述S4340中所述关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)为：
在其中一个实施例中，所述S4340包括：
S4341：将所述函数F(Λ)取对数，获取函数L(Λ)；
S4342：对所述函数L(Λ)求一阶导数，并将函数L(Λ)的一阶导数为0；
S4343：获取ln(c)相应的标准差σ；
S4344：根据ln(c)相应的标准差σ，获取ln(c)的置信区间。
在其中一个实施例中，所述S4343中根据ln(c)的Fisher信息量I(Λ)获取标准差σ。
在其中一个实施例中，ln(c)的Fisher信息量I(Λ)为：
在其中一个实施例中，所述ln(c)相应的标准差σ以及置信区间分别为：
CI＝ln(c)±Zσ。
通过不同体积数字PCR的定量分析方法，可以获得的ln(c)相应的标准差σ以及置信区间。通过ln(c)相应的标准差σ以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，因此也可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。所述不同体积数字PCR的定量分析方法可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，提高了数字PCR检测仪器的检测动态范围。并且，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。
附图说明
图1为本发明提供的数字PCR检测仪的整体结构示意图；
图2为本发明荧光检测装置结构示意图；
图3为本发明数字PCR检测仪的分析方法流程图；
图4为不同体积数字PCR的定量分析方法流程图。
其中：10-微液滴生成装置；20-温控装置；30-荧光检测装置；310-第三控制器；330-荧光探测组件；331-相机；332-物镜；333-第二滤光片；340-激发光源；341-LED光源；342-准直镜；343-第一滤光片；344-二向色镜；345-复眼透镜；346-聚焦透镜；40-定量分析装置；50-控制器。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参见图1，本发明提供一种数字PCR检测仪1，所述数字PCR检测仪1包括：微液滴生成装置10、温控装置20、荧光信号检测装置30、定量分析装置40以及控制器50。所述微液滴生成装置10用以将核酸扩增反应液微滴化，形成多个微液滴。所述温控装置20与所述微液滴生成装置10通过轨道连接，用以将所述多个微液滴转移至所述温控装置20，进行温度循环，实现核酸扩增。所述荧光信号检测装置30与所述温控装置20相对设置，用以对核酸扩增后的所述多个微液滴进行拍照检测。所述定量分析装置40与所述荧光信号检测装置30通过数据线连接，用以实现所述多个微液滴荧光信息的传输，进行定量分析。所述控制器50分别与所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40连接，用以控制所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40。
所述数字PCR检测仪1在工作时，所述微液滴生成装置10可以将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，从而形成多个微液滴。所述温控装置20可以对所述多个微液滴进行核酸扩增。所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图片。通过所述多个微液滴的荧光变化图片。
在一个实施例中，所述定量分析装置40为计算机。通过所述荧光信号检测装置30可以获得所述多个微液滴的荧光信息照片。所述计算机设置有分析软件，如matlab、microsoft office、origin以及Microsoft Office visual.c++等分析软件，用以实现对获得的所述多个微液滴的荧光信息进行定量分析。
所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，形成多个微液滴。然后，通过所述温控装置20对所述多个微液滴进行加热的过程中，采用所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图像。通过所述定量分析装置40对所述多个微液滴的荧光变化图像进行分析，获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始核酸的浓度进行定量分析。
所述数字PCR检测仪1将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，使得所述操作人员可以通过一体式数字PCR检测机1实现自动化操作，提高了所述数字PCR检测仪1的工作效率。
所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，形成多个微液滴。然后，通过所述温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增。同时，采用所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图片。通过所述多个微液滴的荧光变化图片，获取所述多个微液滴的荧光变化曲线。根据所述荧光变化曲线，可以获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始DNA的浓度进行定量分析。其中，Ct值是指每个微液滴的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
在一个实施例中，所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，形成多个微液滴。其中，所述微液滴生成装置10生成的为体积不同的微液滴。然后，通过所述温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增。同时，采用所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图像。通过所述多个微液滴的荧光变化图像，获取所述多个微液滴的荧光变化曲线。根据所述荧光变化曲线，可以获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始核酸的浓度进行定量分析。
其中，Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个所述微液滴内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光PCR中，Ct值是指每个所述微液滴内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。也就是说Ct值的含义是：每个微液滴的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一核酸模板不同时间扩增或同一时间不同微液滴容器内扩增，得到的Ct值是恒定的。当所述微液滴对应的荧光曲线为扩增曲线时，此时表明所述微液滴中含有目标基因成分。当所述微液滴对应的荧光曲线为一条直线时，此时表明所述微液滴中不含目标基因成分。从获取的实时荧光曲线，可以获得Ct值，每个微液滴的Ct值在获取时，对所述实时荧光曲线进行求导，所述实时荧光曲线的斜率固定的荧光曲线的起始循环次数即为所需要的Ct值。
所述数字PCR检测仪1的检测过程主要包括5个环节：制备待测核酸扩增反应液、待测核酸扩增反应液微滴化、核酸扩增、荧光信息的采集以及定量分析。
请参见图3，在一个实施例中，一种数字PCR检测仪的分析方法，包括以下步骤：
S10，制备待测核酸扩增反应液；
S20，将所述待测核酸扩增反应液微滴化，形成多个微液滴；
S30，将所述多个微液滴进行核酸扩增，并实时获取所述多个微液滴的荧光信息；
S40，根据所述多个微液滴的荧光信息，对所述多个微液滴进行定量分析。
在一个实施例中，所述步骤S10包括：
制备需要检测的核酸扩增反应液。所述核酸扩增反应液中包含待检测的核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质等。
其中，核酸扩增反应液，可以是以脱氧核糖核酸(DNA)为模板的核酸扩增反应液(可称为DNA扩增反应液)，也可以是以核糖核酸(RNA)为模板的逆转录核酸扩增反应液(可称为RNA反转录反应液)，还可以是其它核酸扩增反应液，如环介导等温扩增(LAMP)反应液。其中，所述DNA扩增反应液的特点是含有DNA扩增所需要的dNTP、缓冲液、无机盐离子、聚合酶、引物、待检测的DNA模板以及荧光染料或荧光探针等。反应液中的荧光染料或荧光探针能指示核酸扩增，可以是SYBR Green等与DNA结合的荧光染料，也可以是同时含有荧光基团和淬灭基团的寡糖核苷酸探针，如TaqMan荧光探针等。
将制备好的核酸扩增反应液通过所述微液滴生成装置，可以制备出大批量的微液滴。在制备所述多个微液滴的过程中，将所述多个微液滴放置于所述微液滴容器内，用以方便对所述多个微液滴进行检测。
在一个实施例中，通过所述微液滴生成装置10在所述第二液体中生成大量的微液滴，可以保持所述多个微液滴之间不融合。
在一个实施例中，所述步骤S30包括：
S310：将所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器中；
S320：将平铺后的所述多个微液滴进行核酸扩增；
S330：在所述多个微液滴进行核酸扩增时，实时对所述多个微液滴进行拍照检测。
在一个实施例中，在所述多个微液滴进行核酸扩增的过程中，通过所述荧光信号检测装置30对所述多个微液滴进行拍照检测。
请参见图2，通过所述荧光信号检测装置30，对所述多个微液滴进行拍照。其中，所述激发光源340给所述多个微液滴提供蒸发、原子化或激发的能量，从所述微液滴容器60上方采取倾斜角度照射在所述微液滴容器60上。采用所述荧光信号检测装置30实现对所述多个微液滴进行周期性的二维扫描，并实时进行拍照。所述微液滴容器60内的所述多个微液滴的内部荧光被激发，通过所述第二滤光片333被上方的所述物镜332收集，进入所述相机331，所述相机331采集所述多个微液滴的荧光图像。所述第三控制器310可以同步开启所述多个不同颜色的LED光源341和所述相机331。
通过所述荧光信号检测装置30可以使得所述多个微液滴荧光成像，一次拍摄一定数量的所述多个微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。
在一个实施例中，通过所述荧光检测装置30拍照步骤，所述微液滴容器60中的每个微液滴可以获得45张荧光图片，用以进行定量分析。
在一个实施例中，所述步骤S330在所述多个微液滴进行核酸扩增时，实时对所述多个微液滴进行拍照检测的步骤如下：
首先，将所述多个微液滴进行升温加热，将温度加热至95℃，并加热10min；将所述多个微液加热至95℃，并加热10min，用以将所述多个微液滴中的酶进行热启动；
然后，所述多个微液滴完成酶热启动之后，对所述多个微液滴进行变性30s；
其次，所述多个微液变性之后，降温至55℃，并退火延伸45s，通过所述荧光检测装置对所述多个微微液进行拍照，并进行45次循环，获得45张所述多个微液滴的荧光图像；
最后，循环45次之后，降温至4℃，对所述多个微液进行长时间保存。
通过所述聚焦透镜346的光路倾斜照射于所述多个微液滴，使得所述微液滴容器60中含有荧光物质的微液滴产生荧光。通过所述荧光探测组件330对所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息采集，并将所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息以荧光图像的形式传输至计算机，用以进行定量分析。
采用所述荧光成像的检测方法一次拍摄一定数量的所述微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。由于所述荧光成像的检测方法的成像范围大，因此，在检测的时候对所述微液滴所处的检测环境的要求较低。
在一个实施例中，如果所述微液滴生成装置10生成的所述多个均一微液滴的体积有特殊情况下，改变了所述微液滴的体积时，就会存在体积不均一的情况。同时，通过所述微液滴生成装置10也可以生成多个体积不同的微液滴，用以进行医学临床检测。
无论是微孔式还是液滴式数字PCR技术，其反应单元的体积往往保持高度一致，可视为单一体积数字PCR技术。单一体积数字PCR的定量上限主要取决于反应单元的体积和数量，检测下限与样本总体积相关。单一体积数字PCR技术的分辨率和动态范围无法独立调节。同时，连续对待测样本进行稀释，虽然可以扩展其动态范围，但是无法提高检测灵敏度。并且连续稀释的方法增加了试剂的用量和交叉污染的风险，操作步骤繁琐。
多重体积数字PCR(multivolume digital PCR，MVdPCR)，能够在规避连续稀释弊端的同时，使研究人员独立调节动态范围和分辨率，
多重体积数字PCR的微液滴容器中含有一系列不同体积的反应单元，小体积的反应单元可以对高浓度样本进行定量，大体积的反应单元利用足够的容积实现了高灵敏检测。多重体积数字PCR不需要大量的反应单元却能够达到单一体积数字PCR的动态范围，因此可以再所述微液滴容器中完成更多的样本分析，同时其试剂耗量有效降低。
在所述数字PCR检测仪中，会在成像***中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少。
在一个实施例中，所述样本溶液为核酸扩增反应液，应用于数字PCR检测仪的定量分析方法中。
请参见图4，一种不同体积数字PCR的定量分析方法包括：
S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm；
S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；
S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；
S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；
S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。
若含有目标DNA的微液滴扩增后，其荧光信号的强度达到一定水平，显示为阳性；若DNA含量为零的微液滴几乎检测不到荧光信号，视为阴性。
假设：数字PCR中的微液滴含有的起始DNA拷贝数为x，根据数理统计理论，x＝k(k＝0，1，2，3.....)的概率分布函数P符合泊松概率模型，其中λ为微液滴中含有的平均分子拷贝数。
因此，通过所述泊松分布模型期望值μ与方差σ2，可知期望值μ为λ，方差σ2为λ。因此，可知数字PCR中每个微液滴中包含目标DNA分子的拷贝数为λ，所以求得的λ值就能够实现核酸的定量检测。
假设所述待测核酸扩增反应液的总体积为V(每个微液滴的体积为v)，则所述待测核酸扩增反应液浓度c(copy/μL)为：
所以，求得λ的值，就能实现DNA的定量检测。
其中，实时荧光定量PCR无需内标是建立在Ct值的重现性与Ct值与起始DNA浓度的线性关系基础之上的。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一DNA模板不同时间扩增或同一时间不同微液滴容器内扩增，得到的Ct值是恒定的。
当所述微液滴对应的荧光曲线为扩增曲线时，此时表明所述微液滴中含有目标基因成分。当所述微液滴对应的荧光曲线为一条直线时，此时表明所述微液滴中不含目标基因成分。
从获取的实时荧光曲线，可以获得Ct值，每个微液滴的Ct值在获取时，对所述实时荧光曲线进行求导，所述实时荧光曲线的斜率固定的荧光曲线的起始循环次数即为所需要的Ct值。
在一个实施例中，所述S4310包括：
S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v1，v2，...vm的微液滴，所述微液滴体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm；
S4313：将所有微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所述所有微液滴的荧光图像；
S4315：根据所述所有微液滴的荧光图像，获取所述所有微液滴的体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。
在一个实施例中，所述S4310还包括：
S4312：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，形成多个微液滴；
S4314：将所述多个微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所有微液滴核酸扩增后的荧光图像；
S4316：根据所述荧光图像，获取所述所有微液滴核酸扩增后的体积，所述体积分别为v1，v2，...vm，所述体积分别为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。
一个实施例中，所述步骤采集所述多个微液滴的荧光图像，并进行图像追踪。在获取每个微液滴的实时荧光曲线时，需要对每张图像中的每个微液滴分别进行定位，获取每个微液滴的荧光强度。在所述数字PCR检测仪中，会在成像***中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少根据之前。
在一个实施例中，对每个微液滴进行追踪时，还可以通过在每个温度循环过程中拍摄的照片，进行NCAST图像差分及聚类运算，识别到每个微液滴的位置，进而获取所述多个微液滴的荧光强度。
在一个实施例中，根据每个温度循环过程中每个微液滴的荧光强度值，获取每个微液滴的荧光曲线。每一个荧光曲线代表一个有用信息的曲线的变化过程，参加了液滴样本信息，以实现实时监测；以设定算法消除相邻液滴之间的相互影响。通过对每次温度循环过程中每个微液滴的各个部位的荧光强度值求和，作为每个微液滴的某一特定时刻的荧光强度值。
在一个实施例中，为了防止相邻的每个微液滴的边缘部位的互相影响，每个微液滴的某一特定时刻的荧光强度值采用部分求和方式。通过每次温度循环过程中所述多个微液滴的荧光强度值，可以获得所述多个微液滴在全部循环过程中的变化情况，获取每个微液滴的荧光曲线。在一个实施例中，每个微液滴进行了45次循环，共获得45张荧光图片。通过对45张荧光图片中每个微液滴进行定位，并获取每个微液滴的45个荧光强度值，从而获取每个微液滴的荧光曲线。
在一个实施例中，所述S4320构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)为：
假设，在单一体积数字PCR中，每个微液滴的体积为v，待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，则每个微液滴含有的平均DNA数目为vc，假设每个微液滴含有的分子数为k，则可以通过泊松分布概率模型推导出k的概率分布P：
对于k＝0即不含目标DNA分子的阴性微液滴，上式可改写为
p(k＝0)＝e-cv
在单一体积数字PCR分析中，可以通过微液滴总数n和阴性微液滴b估计出阴性微液滴的概率。
因此，推导出
对于特定的实验结果，阴性微液滴数目b和总数n是已知的。因此，构建二项方程式：
根据单一体积数字PCR分析过程，假设每个微液滴的体积分别为v1、v2，...vm，每个微液滴的体积分别对应的数目依次为n1，n2，…，nm。构建关于c的联合二项分布函数：
在一个实施例中，所述S4330包括：
S4331：将所述联合二项分布函数f(c)求导，获取所述联合二项分布函数f(c)的导数
S4332：将所述联合二项分布函数f(c)的导数为0，获取所述联合二项分布函数f(c)取极值时的核酸扩增反应液浓度c的值。
通常函数导数为0时，函数值取极大或极小值。由于二项分布只有一个极大值，因此使函数的导函数为0时的解即为最可能的浓度值。通过使得所述联合二项分布函数f(c)取最大值时，获取相应的c的最大可能数。
在一个实施例中，所述步骤S4340中所述关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)为：
将ln(c)代替c，并令θ＝e-λ，Λ＝ln(c)，将所述二项分布函数f(c)转化为：
P函数关于ln(c)比c更具有对称性，因此ln(c)的标准差σ更具有统计学意义。通过强化浓度为正值的约束条件，在低浓度样本分析时有较好的准确度。为简化计算，在计算ln(c)相应的标准差σ时，需要替换相应变量，令
在一个实施例中，所述S4340包括：
S4341：将所述函数F(Λ)取对数，获取函数L(Λ)；
S4342：对所述函数L(Λ)求一阶导数，并将函数L(Λ)的一阶导数为0；
S4343：获取ln(c)相应的标准差σ。
S4344：根据ln(c)相应的标准差σ，获取ln(c)的置信区间。
将所述函数F(Λ)取对数，转化为：
通过对所述函数F(Λ)取自然对数，可以使得相应的乘法关系变为独立的加法关系，使得对应的导函数更容易处理。
对所述L(Λ)求一阶导数，获得：
令-vi代替ln(θi)，并用ti表示第i重体积中阳性微液滴的数量，bi＝ni-ti，将步骤4中的式子转化为：
将所述的式子为0，求解
在一个实施例中，所述S4343中根据ln(c)的Fisher信息量I(Λ)获取标准差σ。
在一个实施例中，所述S4343中ln(c)的Fisher信息量I(Λ)为：
对于标准差σ，可以结合ln(c)的Fisher信息量I(X)获取，相应的Fisher信息量可用下公式表示，其中E[]表示相应变量的期望值。
在一个实施例中，所述ln(c)相应的标准差σ以及置信区间分别为：
CI＝ln(c)±Zσ。
根据的的公式，求解：
将的式子带入到步骤6中，获得：
将公式带入步骤8中的式子，可以获得:
从而可以从上式中可以获得ln(c)相应的标准差σ，以及置信区间：
CI＝ln(c)±Zσ
其中，Z为标准正态分布的上临界值。
从获得的ln(c)相应的标准差σ，以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c。通过标准正态分布表可以获知相应的数值，从而可以获知ln(c)的的置信区间，进而可以获知待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，从而可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。
其中，置信区间是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，一个概率样本的置信区间(Confidence interval，CI)是对这个样本的某个总体参数的区间估计。置信区间展现的是这个参数的真实值有一定概率落在测量结果的周围的程度。置信区间给出的是被测量参数的测量值的可信程度，即前面所要求的"一个概率"。
数字PCR的定量结果通常需要结合置信区间和置信水平表示。在数字PCR中，置信区间展现的是样本真实浓度以一定概率落在测量结果λ的周围区间的程度，这个概率被称为置信水平。置信区间的两端被称为置信极限。
相比单一体积数字PCR，不同体积数字PCR可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。同时，也可以对所述微液滴均一体积存在的特殊情况进行修正，使得所述数字PCR检测仪1检测精度提高。
通过所述不同体积数字PCR定量分析方法解决了结果的假阳性和假阴性。测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测。同时能利用不同种类的荧光，进行多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。采用数字PCR检测仪通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，大大简化操作步骤，有效节约了准备时间和检测时间，且结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，提高了检测的灵敏度和精确性。
所述数字PCR定量检测方法可以应用于临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全、科学研究以及应用行业等领域。例如：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断等。
在实际过程中，所述不同体积数字PCR定量分析方法，不依赖于标准曲线而能够高精度地测定所述多个微液滴的起始DNA浓度。在所述数字PCR检测仪1中，会在成像***中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少。
通过数字PCR定量检测方法可以实现所述多个微液滴的动态跟踪，在所述多个微液滴进行温度循环过程中都可以找到每个微液滴对应的具***置，可以实现核酸扩增的全部过程的监测。因此，通过所述数字PCR定量检测方法可以解决所述多个微液滴中存在假阳性的问题。同时，通过对所述多个微液滴荧光曲线进行处理，并进行不依赖于均匀性假设进行的统计修正，而取得真正的绝对定量。
不仅摆脱了对标准曲线的依赖，排除了由标准曲线引起的定量结果不确定的问题，并且解决了液滴式数字PCR终点检测方式的限制，打破了只采用了一个p(x＝0)的数据对待测样本整体进行参数估计的局限性。采用所述实时荧光定量PCR检测方法，提高了数字PCR定量检测的准确性。
所述数字PCR定量检测方法依赖抽象的数学模型，实现了重复性、高灵敏性，并且动态范围变大，可以利用少量液滴实现监测。用小量的数据覆盖更多的信息。同时，所述数字PCR定量检测方法避免了之前泊松分布概率模型的误差，实现绝对定量，更加直观。综合了所有数据，消除了随机误差。获取液滴样本荧光曲线，实时监测液滴样本的荧光亮度的变化，用以去除假阳性；消除相邻液滴之间的相互影响，为后续定量分析模型提供更精确的数据源。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，包括：
S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm；
S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；
S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；
S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；
S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述待测核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。
2.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4310包括：
S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v1，v2，...vm的微液滴，所述微液滴体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm；
S4313：将所有微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所述所有微液滴的荧光图像；
S4315：根据所述所有微液滴的荧光图像，获取所述所有微液滴的体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。
3.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4310还包括：
S4312：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，形成多个微液滴；
S4314：将所述多个微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所有微液滴核酸扩增后的荧光图像；
S4316：根据所述荧光图像，获取所述所有微液滴核酸扩增后的体积，所述体积分别为v1，v2，...vm，所述体积分别为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。
4.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4320构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)为：
5.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4330包括：
S4331：将所述联合二项分布函数f(c)求导，获取所述联合二项分布函数f(c)的导数
S4332：将所述联合二项分布函数f(c)的导数为0，获取所述联合二项分布函数f(c)取极值时的待测核酸扩增反应液浓度c的值。
6.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4340中所述关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)为：
7.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4340包括：
S4341：将所述函数F(Λ)取对数，获取函数L(Λ)；
S4342：对所述函数L(Λ)求一阶导数，并将函数L(Λ)的一阶导数为0；
S4343：获取ln(c)相应的标准差σ；
S4344：根据ln(c)相应的标准差σ，获取ln(c)的置信区间。
8.如权利要求5所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4343中根据ln(c)的Fisher信息量I(Λ)获取标准差σ。
9.如权利要求8所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，ln(c)的Fisher信息量I(Λ)为：
10.如权利要求7所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述ln(c)相应的标准差σ以及置信区间分别为：
CI＝ln(c)±Zσ。
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