KR100552706B1 - 핵산 증폭 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

핵산 증폭 방법과 이 방법을 수행하기 위한 핵산 증폭 장치가 개시된다. 개시된 핵산 증폭 방법은, 핵산 증폭용 반응물이 함유된 반응물 수용액과, 반응물 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 서로 다른 인렛 채널을 통해 반응 용기 내에 주입시키는 제1 단계와, 반응물 수용액이 유체와 만나 반응 용기 내에 유체에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울을 형성하는 제2 단계와, 다수의 반응물 수용액 방울 내에서 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제3 단계를 구비한다. 그리고, 개시된 핵산 증폭 장치는, 기판과, 기판의 내부에 형성된 반응 용기와, 기판의 내부에 형성되며 반응 용기의 일단에 연결되어 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액을 반응 용기 내부로 주입하기 위한 적어도 하나의 제1 인렛 채널과, 기판의 내부에 형성되며 반응 용기의 일단에 연결되어 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 반응 용기 내부로 주입하기 위한 제2 인렛 채널과, 기판에 열적으로 접촉되도록 설치되어 기판을 가열하는 가열 장치를 구비한다.

Description

핵산 증폭 방법 및 장치{Method and apparatus for nucleic acid amplification}
도 1a는 본 발명의 바람직한 제1 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 1b는 도 1a에 도시된 핵산 증폭 장치의 분리 사시도이다.
도 2는 본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 3과 도 4는 본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치와 방법을 사용하여 PCR을 수행한 경우, 각 수용액 방울에서 발산되는 형광 시그널에 대한 CCD 이미지를 보여주는 도면과, 사이클 수에 따른 형광 시그널의 세기를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 제3 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 6은 본 발명의 제4 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 7은 본 발명의 제5 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 8은 본 발명의 제6 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 제7 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도로서, 도 9a는 1단계 PCR을 설명하기 위한 도면이고, 도 9b는 2단계 PCR을 설명하기 위한 도면이다.
도 10a와 도 10b는 2차원 시뮬레이션 조건을 설명하기 위한 개략적인 증폭 장치 단면도들이다.
도 11은 도 10a에 도시된 조건에 따라 실시된 2차원 시뮬레이션 결과, 95℃ 에서 60℃ 로 냉각시 시간에 따른 온도 분포를 보여주는 도면이다.
도 12는 표 2의 조건에 따라 2차원 시뮬레이션을 실시한 결과, 시간에 따른 물의 온도 변화를 보여주는 그래프이다.
도 13은 도 12의 그래프에 나타난 온도 변화를 총 온도 변화값으로 정규화하여 그 값을 시간에 대해 표시한 그래프이다.
도 14는 표 2의 조건에 따라 2차원 시뮬레이션을 실시한 결과, 시간에 따른 물의 온도의 표준편차를 보여주는 그래프이다.
도 15는 도 14의 그래프에 나타난 온도의 표준편차의 총 온도 변화량에 대한 비율을 나타낸 그래프이다.
도 16은 3차원 시뮬레이션을 위한 증폭 장치의 구조를 도시한 개략도이다.
도 17은 도 16에 도시된 조건에 따라 실시된 3차원 시뮬레이션 결과, 시간에 따른 각 영역의 온도 분포를 보여주는 도면이다.
도 18은 채널의 길이 방향을 따른 채널 내부의 온도 분포룰 도시한 그래프이다.
도 19는 도 16에 도시된 조건에 따라 3차원 시뮬레이션을 실시한 결과, 시간에 따른 물의 온도 변화를 보여주는 그래프이다.
도 20은 도 19의 그래프에 나타난 온도 변화를 총 온도 변화값으로 정규화하여 그 값을 시간에 대해 표시한 그래프이다.
도 21은 3차원 시뮬레이션 결과, 온도의 표준편차의 총 온도 변화량에 대한 비율을 나타낸 그래프이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
110...기판 111...하부 기판
112...상부 기판 120,520...가열 장치
121,122,5211~521n,621~625,721...히터
130...반응 채널 131,661,731...유체(오일)
132,232,332a,332b,332c,432,662a,662b,662c,732a,732b,732c...수용액 방울
141,241,341,441,641,741...제1 인렛 채널
151,651,653,751...제2 인렛 채널
233...NTC 수용액 방울 234...표준 샘플 수용액 방울
243...제3 인렛 채널 245a,245b...표준 샘플 인렛 채널
247...증류수 인렛 채널 249...제4 인렛 채널
343,443...프라이머 인렛 채널 445...공통 성분 인렛 채널
631,632...1차 반응 채널 633...2차 반응 채널
730...반응 챔버 761...아웃렛 채널
본 발명은 핵산 증폭 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미량의 핵산을 그 분석에 필요한 양 만큼 대량으로 증폭시키는 방법 및 이 방법을 수행하기 위한 핵산 증폭 장치에 관한 것이다.
염기서열 분석 및 질병 진단 등을 목적으로 DNA 및 RNA와 같은 핵산의 유전정보를 분석하기 위해서는, 미량의 핵산을 그 분석에 필요한 양 만큼 대량으로 증폭시킬 필요가 있다. 이러한 핵산의 증폭 방법에는 당업자들에게 잘 알려져 있는 바와 같이 LCR, SDA, NASBA, TMA 및 RAMP와 같은 전통적인 등온 증폭(isothermal amplification) 방법과, 최근에 주로 이용되고 있는 PCR과 같은 비등온 증폭(non-isothermal amplification) 방법이 있다.
이 중에서, PCR(Polymerase Chain Reaction ; 중합효소 연쇄반응) 방법에 대하여 상세히 설명하면, PCR은 3가지 반응 단계로 진행된다. 첫째는, 변성(Denaturation) 단계로서, 이 단계에서는 이중가닥의 DNA를 대략 90℃ 이상으로 가열하여 단일가닥의 DNA로 해리시킨다. 그리고, 둘째는 어닐링(Annealing) 단계로서, 이 단계에서는 두 종류의 프라이머(primer)를 각각 상보적인 단일가닥의 DNA에 결합시킨다. 이 때, 반응조건은 보통 55∼65℃에서 30초 내지 수 분 정도가 된다. 셋째는, 신장(extension) 단계로서, 이 단계에서는 DNA 중합효소(polymerase)를 작동시켜 프라이머로부터 뉴클레오티드(nucleotide)를 하나씩 연장하여 이중가닥의 DNA를 합성시키는 단계이다. 신장 반응에 필요한 시간은 주형(template) DNA의 농도, 증폭 단편의 크기, 반응 온도에 따라 다르다. 일반적으로 많이 사용되고 있는 Taq(Thermusaquaticus) 중합효소(polymerase)를 사용할 경우 72℃에서 30초 내지 수 분 정도가 된다.
그런데, 상기한 바와 같은 증폭 방법을 이용하여 핵산을 증폭할 때, 핵산이 매우 적은 농도로 존재하는 경우에는, 반응 효율이 떨어져서 증폭이 거의 되지 않거나 비특이적인 반응이 자주 생기는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, Kemp 등은 Nested PCR 방법을 제안하였는데, 이 방법은 외측 프라이머(outer-primer)와 내측 프라이머(inner-primer)를 사용하여 두 단계로 PCR을 시행하는 방법이다(David J. Kemp 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 86, 2423~2427). 다시 설명하면, Nested PCR 방법은, 1 단계로는 외측 프라이머를 사용하는 증폭 반응을 수행하고, 2 단계로는 내측 프라이머를 사용하는 PCR을 수행함으로써, 비특이적인 산물의 발생을 억제하는 방법이다. 그러나, 이 방법에 있어서, 2 단계 PCR 수행 이전에 외측 프라이머를 제거하지 않으면, 외측 프라이머와 내측 프라이머 사이의 상호 작용을 미리 고려하여야 하는 어려운 점이 있다. 또한, 1 단계 반응과 2 단계 반응 사이에 반응용기(reaction vessel)를 열고 반응물을 주입하여야 하므로, 이 과정에서 상호 오염(cross contamination)의 가능성이 있으므로 주의하여야 하는 불편한 점이 있다.
최근에는 반응용기의 크기가 작다는 장점을 가진 마이크로 디바이스를 이용하여 단일 분자(single molecule)에서 출발하여 빠른 시간 내에 PCR 증폭을 수행하는 방법도 보고되고 있다(E. T. Lagally 등, 2001, Anal. Chem. 73, 565~570). 그러나, 이 방법에 있어서는, 실리콘이나 유리 등으로 이루어진 미세 반응용기 표면에 핵산이 비정상적으로 흡착하여 증폭 반응에 부정적인 영향을 미칠 수도 있고, 반응물의 체적이 작아서 증발의 위험성이 있다는 문제점이 있다.
그리고, PCR을 수행할 때, 온도가 융해 온도(melting temperature) 이하로 떨어지면, 프라이머-다이머(primer-dimer) 형성을 비롯한 비특이적인 반응이 생기는 문제점이 있다.
이를 방지하기 위하여, 첫번째 사이클에서 융해 온도에 이르기 전에는 증폭 반응의 공통 성분, 예를 들면 중합효소 등을 넣어 주지 않는 방법과, 핫 스타트(hot start) PCR 방법 등이 제안된 바 있다. 구체적으로, 첫번째 사이클에서 융해 온도에 도달한 이후에 공통 반응 성분을 첨가하는 방법과, 왁스 비드(wax bead)를 반응용액 위에 놓고 가열 융해한 다음, 고형화층을 만들고, 고형화층 위에 공통 반응 성분을 넣어, 첫번째 사이클에서 융해 온도에 도달한 이후에 반응용액과 공통 반응 성분이 서로 섞이도록 하는 방법과, Taq DNA 중합효소 항체를 첨가하여서, 첫번째 사이클에서 융해 온도에 이르는 과정에서 중합효소로부터 Taq 스타트 항체(start antibody)가 유리되면서 중합효소가 활성화되도록 하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들에 의하면, 반응 중간에 반응물을 첨가하는 과정이 번거롭고, 또한 상호 오염의 소지가 있으며, Taq 스타트 항체를 사용하는 경우에는 보 통 10분 이상의 활성화 시간을 거쳐야 하는 단점이 있다.
PCR 방법에 있어서, n 사이클 이후의 증폭산물의 양은 이론적으로 초기 반응물의 양의 2n 배라고 할 수 있다. 그러나, 실제로는 프라이머의 어닐링 효율이나, DNA 가닥의 합성 효율이 100%가 되지 않으므로, 반응 초기에는 증폭산물의 양이 사이클에 따라 대수적으로 증가하나, 증폭산물의 양이 어느 한도를 넘으면, 증폭산물의 증가가 저하되면서 최종적으로는 증폭되지 않는 안정기(Plateau) 현상이 나타나게 된다. 따라서, PCR 증폭산물의 양으로서 증폭 전의 초기 DNA 양을 추정할 수는 없으므로, 종래에는 내부 표준 샘플을 이용하여 타겟 핵산의 초기량을 정량하고 있다.
Kopp 등은 칩내에 서로 다른 온도로 제어되는 영역을 두고, 마이크로 채널을 통하여 PCR 반응용액을 흘림으로써 반응용액이 서로 다른 온도 영역을 지나가면서 연속적인 PCR 증폭이 이루어지도록 하였다(Martin U. Kopp 등, 1998, Science, Vol. 280, 1046~1048). 이 방법은 반응용기 전체를 가열하는 방식이 아니므로, 반응 속도가 승온/냉각 속도에 의해 정해지는 것이 아니라 유속에 의해 정해진다. 그러나, 이러한 PCR 방법에 있어서는, 정량 분석을 위해서 여러개의 표준 샘플을 위한 별도의 채널이 필요하고, 따라서 칩의 크기가 매우 커지는 단점이 있다. 또한, 반복 실험을 위해서는, 많은 수의 칩을 사용해야 한다. 만약, 하나의 채널을 사용하여 서로 다른 샘플을 증폭하는 경우에는, 채널의 표면에 흡착된 DNA 등에 의해 오염 등의 문제점이 발생하게 된다.
Baker 등은 글라스 칩을 이용하여 유체가 흘러가면서 PCR 증폭이 이루어지도록 하였다(Jill Baker 등, 2003, Micro TAS, 1335-1338). 그리고, 칩의 온도 조절은 채널 사이에 있는 히터를 사용하여 칩 전체를 승온 하고 칩 아래에 있는 냉각수를 이용하여 칩을 냉각하는 방식을 채택하였다. Baker 등은 채널 내에 샘플을 희석하여 채우고, 증폭을 위한 온도 사이클이 반복되는 동안 형광 시그널을 측정한 결과, 단일 분자(single molecule)가 존재하는 곳에서 형광 시그널의 피크(peak)를 감지할 수 있었다고 주장하고 있다. 그러나, 이러한 결과를 얻기 위해서는 미약한 형광 시그널에서 배경 시그널을 제거하는 등의 분석 과정을 통해야만 했다. 따라서, 형광 시그널의 분석 과정이 명확하지 않고, 그 형광 시그널이 정말 단일 분자에 대한 것인지에 관한 정량은 할 수 없는 단점이 있다.
Nakano 등은 반응기(reactor)로서 water-in-oil 에멀션(emulsion)을 이용하는 단일 분자 PCR 방법을 제안하였다(Michihiko Nakano 등, 2003, J. Biotechnology, 102, 117-124). 이 방법을 설명하면, 먼저 PCR 혼합액이 든 수용액과 오일, 계면활성제를 PCR 튜브에 넣고 마그네틱 교반바(magnetic stirrer bar)를 이용하여 혼합하여 water-in-oil 에멀션(emulsion)을 만든다. 이어서, PCR의 초기 몇 사이클은 작은 수용액 방울 내에서 반응이 일어나게 한다. 다음으로, 원심분리에 의해 수용액과 오일의 층분리가 일어나게 하여 작은 수용액 방울들이 합쳐지게 한 이후에 증폭 반응의 후기 사이클을 진행한다. Nakano 등은 이와 같은 방법을 사용하여 단일 분자 PCR 방법이 가능하도록 하였다고 주장하고 있다. 일반적으로, 주형(template) DNA의 농도가 매우 낮은 경우, 주형과 프라이머 사이의 반응보다 상 대적으로 농도가 높은 프라이머들 사이의 반응이 더 쉽게 일어나서 비특이적인 산물이 생길 가능성이 더 높다. 따라서, 이 방법은 water-in-oil 에멀션을 반응기로 사용하여, 초기 반응은 상대적으로 높은 농도의 주형이 함유된 수용액 방울 안에서 1차적인 증폭 반응이 일어나게 하였다. 이어서, 초기 몇 사이클을 거치면서 주형이 존재하는 수용액 방울 내의 반응물의 하나인 프라이머가 모두 소비되면, 원심분리를 통하여 이 수용액 방울과 주형이 존재하지 않았던 다른 수용액 방울을 합쳐지게 함으로써 다른 수용액 방울 내에 남아 있는 프라이머에 의해 2차적인 증폭 반응이 일어나게 하였다. 그러나, 이러한 방법을 실제로 적용하기에는 여러가지 어려움이 있다. 첫째, 전염성 있는 질병 진단을 위해서 매번 에멀션을 만들 때 마다 마그네틱 교반바를 사용하는 것은 불편할 뿐만 아니라 오염의 소지가 농후하다. 그리고, 이렇게 만들어진 수용액 방울은 그 크기가 다양하여 재현성의 문제가 있을 수 있다. 또한, 주형 DNA의 농도가 매우 낮은 경우에는 실험을 많이 반복하여 진단하여야 하는 문제점이 있고, 반응용액의 부피가 대략 50㎕ 정도로 크고, 정량(quantitative) PCR이 불가능한 단점이 있다.
한편, 종래의 PCR은 단지 반응의 종말점(end-point)에서 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 증폭된 DNA의 정성적인 결과만을 보여주는 것으로서, DNA의 정량적 검출에 있어서는 부정확성 등 많은 문제점을 가지고 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 광학적 검출시스템을 이용하여 증폭된 DNA의 농도에 비례하는 형광의 세기를 검출함으로써 DNA의 정량분석을 가능케 해주는 실시간(real time) PCR 방법이 개발되었다.
그러나, 종래의 실시간 PCR 방법을 이용하여 정량 PCR을 수행하는 경우에는, 네거티브 컨트롤러(negative controller), 포지티브 컨트롤러(positive controller) 및 적어도 3개의 서로 다른 농도를 가진 표준 샘플들을 사용하여 3회 이상 반복 실험하여야 하므로, 많은 수의 반응기가 필요하였다. 따라서, PCR 칩에 상기한 바와 같이 많은 수의 반응기를 구성하는 것은 무리가 있으며, 칩의 크기가 커질 수 밖에 없는 단점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 특히 서로 분리되는 유체와 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액을 서로 다른 유입 채널을 통해 반응 용기 내에 유입시켜 반응 용기 내에 유체에 의해 둘러싸인 수용액 방울들을 형성하고, 이 수용액 방울 내에서 핵산의 증폭 반응이 이루어지도록 하는 핵산 증폭 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
그리고, 본 발명은 상기 핵산 증폭 방법을 수행하기 위한 핵산 증폭 장치를 제공하는 데 다른 목적이 있다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은,
핵산 증폭용 반응물이 함유된 반응물 수용액과, 상기 반응물 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 서로 다른 인렛 채널을 통해 반응 용기 내에 주입시키는 제1 단계;
상기 반응물 수용액이 상기 유체와 만나 상기 반응 용기 내에 상기 유체에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울을 형성하는 제2 단계; 및
상기 다수의 반응물 수용액 방울 내에서 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제3 단계;를 구비하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.
여기에서, 상기 유체는 실리콘 오일, 광물성 오일, 과불화(perfluorinated) 오일, 탄화수소 오일 및 식물성 오일로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 오일인 것이 바람직하다.
상기 제3 단계에서, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산 증폭 반응은 PCR 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이 외에도 LCR, SDA, NASBA, TMA 또는 RAMP 방법에 의해 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산의 증폭 반응은, 상기 기판 전체를 일정한 온도로 가열 및 냉각을 반복함으로써 핵산의 증폭 반응이 이루어지게 하는 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다.
또한, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산의 증폭 반응은, 상기 기판을 서로 다른 온도를 가진 적어도 두 개의 영역으로 가열한 상태에서, 상기 다수의 반응물 수용액 방울을 상기 두 개의 영역을 번갈아 반복적으로 통과하게 함으로써 핵산의 증폭 반응이 이루어지게 하는 연속 흐름 PCR 방법에 의해 수행될 수도 있다. 이 경우, 독립적으로 제어되는 다수의 히터를 사용하여 상기 기판을 변경 가능한 적어도 두 개의 온도 영역으로 가열할 수 있다.
그리고, 실시간 PCR을 위해, 상기 제1 단계에서, 정량 분석을 위한 네거티브 컨트롤러 및 포지티브 컨트롤러 중 적어도 하나의 수용액과 표준 샘플 수용액을 상 기 인렛 채널들과는 또 다른 각각의 인렛 채널을 통해 상기 반응 용기 내에 주입시키고, 상기 제2 단계에서, 상기 네거티브 컨트롤러 및 포지티브 컨트롤러 중 적어도 하나의 수용액과 상기 표준 샘플 수용액이 상기 유체와 만나 상기 반응 용기 내에 상기 다수의 반응물 수용액 방울과 함께 다수의 컨트롤러 수용액 방울과 다수의 표준 샘플 수용액 방울을 형성할 수 있다. 이 경우, 상기 표준 샘플 수용액은 적어도 두 가지의 농도로 조절되어 상기 반응 용기 내에 주입될 수 있다.
또한, 다중 PCR을 위해, 상기 제1 단계에서, 적어도 두 종류의 프라이머가 각각 함유된 적어도 두 종류의 반응물 수용액이 서로 다른 인렛 채널을 통해 상기 반응 용기 내에 주입될 수 있다.
또한, 핫 스타트 PCR을 위해, 상기 제1 단계에서, 핵산 수용액, 중합효소와 dNTP를 포함하는 공통 성분 및 프라이머를 각각의 인렛 채널에 주입하고, 이들이 상기 반응 용기에 주입되기 직전에 혼합되어 상기 반응물 수용액을 형성하도록 하는 것이 바람직하다.
또한, 단일 분자 PCR을 위해, 상기 반응 용기는, 두 개의 1차 반응 채널과, 상기 두 개의 1차 반응 채널 각각의 말단에 연결되는 하나의 2차 반응 채널로 이루어지고, 상기 제1 단계, 제2 단계 및 제3 단계는 상기 두 개의 1차 반응 채널 각각에 대해 수행되며, 상기 제3 단계에 이후에, 상기 2차 반응 채널의 시작단에서 상기 다수의 반응물 수용액 방울이 합쳐져 상기 2차 반응 채널 내에 다수의 합쳐진 반응물 수용액 방울을 형성하는 제4 단계; 및 상기 다수의 합쳐진 반응물 수용액 방울 내에서 다시 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제5 단계;를 더 구비할 수 있다.
한편, 상기 반응 용기는, 적어도 하나의 반응 챔버로 이루어지며, 상기 제3 단계 이후에, 상기 반응 챔버 내의 상기 다수의 반응물 수용액 방울을 합쳐지게 하는 제4 단계; 및 상기 합쳐진 반응물 수용액 방울 내에서 다시 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제5 단계;를 더 구비할 수도 있다. 이 경우, 상기 다수의 반응물 수용액 방울은 원심 분리에 의해 합쳐질 수 있다.
그리고, 상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은,
기판;
상기 기판의 내부에 형성된 반응 용기;
상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액을 상기 반응 용기 내부로 주입하기 위한 적어도 하나의 제1 인렛 채널;
상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 상기 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 상기 반응 용기 내부로 주입하기 위한 제2 인렛 채널; 및
상기 기판에 열적으로 접촉되도록 설치되어 상기 기판을 가열하는 가열 장치;를 구비하며,
상기 반응물 수용액이 상기 유체와 만나 상기 반응 용기 내에 상기 유체에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울을 형성하고, 상기 다수의 반응물 수용액 방울 내에서 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장 치를 제공한다.
여기에서, 상기 기판은 소수성의 표면 성질을 가진 것이 바람직하다. 그리고, 상기 기판은 PDMS(Poly Dimethyl Siloxane), 실리콘, 실리콘 다이옥사이드, 플라스틱 및 글라스로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 물질로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 기판은 하부 기판과 상부 기판으로 이루어지며, 상기 하부 기판과 상부 기판 사이에 상기 반응 용기, 제1 인렛 채널 및 제2 인렛 채널이 형성될 수 있다.
그리고, 연속 흐름 PCR을 위해, 상기 반응 용기는 꾸불꾸불하게 형성된 반응 채널이며, 상기 반응 채널의 시작단에 상기 제1 인렛 채널과 제2 인렛 채널이 연결되고, 상기 반응 채널의 말단에 상기 유체와 증폭산물을 배출시키기 위한 배출구가 마련될 수 있다.
이 경우, 상기 가열 장치는, 상기 기판의 하부에 배치되어 상기 기판을 서로 다른 온도를 가진 적어도 두 개의 영역으로 가열하는 적어도 두 개의 히터를 가질 수 있다.
한편, 상기 가열 장치는, 상기 기판을 변경 가능한 적어도 두 개의 온도 영역으로 가열할 수 있도록, 상기 기판의 하부에 서로 평행하게 배치되며 독립적으로 제어되는 다수의 히터를 가질 수도 있다.
그리고, 상기 반응 채널은 상기 두 개의 온도 영역을 번갈아 반복적으로 통과하도록 형성될 수 있다.
또한, 상기 제2 인렛 채널은 상기 반응 채널의 시작단으로부터 직선상으로 연장되도록 형성되며, 상기 제1 인렛 채널은 상기 제2 인렛 채널에 대해 직교하도록 형성될 수 있다.
그리고, 실시간 PCR을 위해 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는, 상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 정량 분석을 위한 네거티브 컨트롤러 및 포지티브 컨트롤러 중 적어도 하나의 수용액을 상기 반응 채널 내부로 주입하기 위한 제3 인렛 채널과,
상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 정량 분석을 위한 표준 샘플 수용액을 상기 반응 채널 내부로 주입하기 위한 제4 인렛 채널을 더 구비할 수 있다.
이 경우, 상기 제4 인렛 채널에는, 표준 샘플이 각각 주입되는 적어도 두 개의 표준 샘플 인렛 채널과, 상기 표준 샘플을 소정 농도로 희석하기 위한 증류수가 주입되는 증류수 인렛 채널이 연결될 수 있다. 또한, 상기 제4 인렛 채널은 꾸불꾸불하게 형성된 것이 바람직하다.
그리고, 다중 PCR을 위해, 상기 제1 인렛 채널은 적어도 두개가 형성되고, 상기 적어도 두 개의 제1 인렛 채널에 서로 다른 종류의 프라이머를 주입하기 위한 적어도 두 개의 프라이머 인렛 채널이 상기 적어도 두 개의 제1 인렛 채널에 각각 연결될 수 있다. 이 경우, 상기 적어도 두 개의 제1 인렛 채널 각각은 꾸불꾸불하게 형성된 것이 바람직하다.
그리고, 핫 스타트 PCR을 위해, 상기 제1 인렛 채널에는, 상기 제1 인렛 채널에 프라이머를 주입하기 위한 프라이머 인렛 채널과, 상기 제1 인렛 채널에 중합 효소와 dNTP를 포함하는 공통 성분을 주입하기 위한 공통 성분 인렛 채널이 연결될 수 있다. 이 경우, 상기 반응 채널의 시작단 가까이의 일부분은 꾸불꾸불하게 형성된 것이 바람직하다.
그리고, 단일 분자 PCR을 위해, 상기 반응 용기는, 꾸불꾸불하게 형성된 두 개의 1차 반응 채널과, 상기 두 개의 1차 반응 채널 각각의 말단에 함께 연결되며 꾸불꾸불하게 형성된 하나의 2차 반응 채널로 이루어지며, 상기 제1 인렛 채널과 제2 인렛 채널은 상기 두 개의 1차 반응 채널의 시작단에 연결될 수 있다.
이 경우, 상기 가열 장치는, 상기 두 개의 1차 반응 채널과 한 개의 2차 반응 채널 각각에 두 개의 온도 영역을 제공할 수 있도록, 상기 기판의 저면에 배치되며 독립적으로 제어되는 다수의 히터를 가질 수 있다.
한편, 상기 반응 용기는 반응 챔버이며, 상기 반응 챔버의 일단에 상기 제1 인렛 채널과 제2 인렛 채널이 연결되고, 상기 반응 챔버의 타단에 상기 유체와 증폭산물을 배출시키기 위한 아웃렛 채널이 연결될 수 있다.
이 경우, 상기 반응 챔버, 상기 제1 인렛 채널, 상기 제2 인렛 채널 및 상기 아웃렛 채널은 각각 다수개가 형성될 수 있다.
그리고, 상기 가열 장치는, 상기 기판의 하부에 배치되어 상기 기판 전체를 소정 온도로 가열하는 하나의 히터를 가질 수 있다.
<실시예>
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 핵산 증폭 방법과 핵산 증폭 장치의 바람직한 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 도면들에서 동일한 참조 부호는 동일한 구성요소를 가리킨다.
<실시예 1 : 연속 흐름(Continuous-Flow) PCR>
도 1a는 본 발명의 바람직한 제1 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이고, 도 1b는 도 1a에 도시된 핵산 증폭 장치의 분리 사시도이다.
도 1a와 도 1b를 함께 참조하면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는, 기판(110)과, 상기 기판(110) 내부에 형성된 반응 채널(130) 및 적어도 두 개의 인렛 채널(inlet channel, 141, 151)과, 상기 기판(110)을 소정 온도로 가열하기 위한 가열 장치(120)를 구비한다.
상기 기판(110)은 PDMS(Poly Dimethyl Siloxane), 실리콘, 실리콘 다이옥사이드, 플라스틱 또는 글라스 등으로 이루어질 수 있다. 그리고, 상기 기판(110)은 소수성의 표면 성질을 가진 것이 바람직하다. 한편, 소수성의 표면 성질을 갖지 않는 물질로 이루어진 기판(110)의 경우에는, 소수성을 갖도록 그 표면을 개질하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 기판(110)은, 그 내부에 상기 반응 채널(130) 등을 형성하기 위해, 서로 본딩되는 하부 기판(111)과 상부 기판(112)으로 이루어질 수 있다. 이와 같은 기판(110)의 구성은 이하의 모든 실시예에서도 동일하게 적용될 수 있다.
상기 반응 채널(130)은, 상기 기판(110) 내부에 형성되어 핵산 증폭 반응이 일어나는 반응 용기(reaction vessel)로서의 역할을 한다. 구체적으로, 상기 반응 채널(130)은, 후술하는 바와 같이 서로 다른 온도로 가열되는 기판(110)의 두 개의 영역을 교대로 반복하여 통과할 수 있도록 꾸불꾸불하게 연장된 형상을 가질 수 있다.
상기 두 개의 인렛 채널(141, 151) 중 제1 인렛 채널(141)을 통해서는 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액이 주입되고, 제2 인렛 채널(151)을 통해서는 상기 수용액과 섞이지 않아서 서로 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 성질을 가진 유체가 주입된다.
상기 두 개의 인렛 채널(141, 151)은 각각 상기 반응 채널(130)의 시작단에 연결된다. 구체적으로, 상기 제2 인렛 채널(151)은 반응 채널(130)의 시작단으로부터 직선상으로 연장되도록 형성될 수 있으며, 상기 제1 인렛 채널(141)은 반응 채널(130)과 제2 인렛 채널(151)의 연결부위에 제2 인렛 채널(151)에 대해 직교하도록 연결될 수 있다. 즉, 반응 채널(130)과 제1 및 제2 인렛 채널(141, 151)은 실질적으로 "T" 자 형상으로 연결될 수 있다.
상기한 반응 채널(130)과 제1 및 제2 인렛 채널(141, 151)은 하부 기판(111)과 상부 기판(112)의 사이에 형성된다. 즉, 상기 채널들(130, 141, 151)은, 도 1b에 도시된 바와 같이 하부 기판(111)의 상면으로부터 소정 깊이로 형성될 수 있다. 한편, 상기 채널들(130, 141, 151)은 상부 기판(112)에 형성될 수도 있고, 하부 기판(111)과 상부 기판(112)에 나뉘어져 형성될 수도 있다. 그리고, 상기 채널들(130, 141, 151)은, 도 1b에 도시된 바와 같이 사각형의 단면 형상을 가지는 것이 그 형성이 용이하여 바람직하다고 할 수 있으나, 이 외에도 다각형이나 원형의 단면 형상을 가질 수도 있다.
그리고, 상기 제1 및 제2 인렛 채널(141, 151)에는 각각 외부로부터 상기 반응물 수용액과 유체를 주입하기 위한 주입구(inlet port, 142, 152)가 연결되고, 상기 반응 채널(130)의 말단에는 핵산 증폭 반응에 의해 생성된 증폭산물과 상기 유체를 외부로 배출하기 위한 배출구(outlet port, 162)가 연결된다. 상기 주입구(141, 142)와 배출구(162)는 도 1b에 도시된 바와 같이 상기 상부 기판(112)을 수직으로 관통하여 형성될 수 있으나, 이와는 다른 형태로 형성될 수도 있다.
상기 가열 장치(120)는 상기 기판(110)의 하부에 배치되어 상기 기판(110)을 소정 온도로 가열한다. 이러한 가열 장치(120)는 서로 다른 온도로 제어되는 두 개의 히터(121, 122)로 구성될 수 있다. 상기 히터(121, 122)는 하부 기판(111)의 저면에 열적으로 접촉되어 상기 기판(110)을 서로 다른 두 개의 온도로 가열하는 역할을 하게 된다. 따라서, 상기 기판(110)은 서로 다른 두 개의 온도 영역, 예컨대 대략 65℃로 가열되는 영역과 대략 95℃로 가열되는 영역으로 나뉘어진다. 한편, 상기 가열 장치(120)는 서로 다른 온도로 제어되는 세 개 이상의 히터로 구성될 수도 있다.
이하에서는, 상기한 바와 같이 구성된 본 발명의 제1 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 이용한 핵산 증폭 방법을 설명하기로 한다.
먼저, 상기한 바와 같이 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액과, 상기 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 각각 상기 제1 인렛 채널(141)과 제2 인렛 채널(151)을 통해 상기 반응 채널(130) 내에 주입한다. 이 때, 상기 반응물은 타겟 DNA, 프라이머, dNTP, 중합효소 및 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 이러한 반응물이 증류수에 용해되어 수용액을 형성하게 된다. 그리고, 상기 유체로는, 예컨대 실리콘 오일, 광물성 오일, 과불화(perfluorinated) 오일, 탄화수소 오일 또는 식물성 오일 등이 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 상기 반응물 수용액과 유체, 예컨대 오일(131)을 서로 다른 인렛 채널(141, 151)을 통해 일정한 흐름 속도로 반응 채널(130) 내에 주입하게 되면, 상기 반응물 수용액이 오일(131)과 만나면서 오일(131)에 의해 둘러싸여 수용액 방울(132)을 형성하게 된다. 이 때, 상기 기판(110)은 전술한 바와 같이 소수성의 표면 성질을 가지므로, 반응물 수용액은 반응 채널(130)의 내면에 흡착되지 않고 오일(131)에 의해 둘러싸여 수용액 방울(132)을 형성하게 된다.
그리고, 상기 제1 인렛 채널(141)을 통과하는 반응물 수용액의 흐름 속도를 조절하면, 반응 채널(130) 내에 일정한 부피를 가진 수용액 방울(132)이 일정한 시간 간격을 두고 다수개가 형성될 수 있다.
여기에서, 반응 채널(130) 내에 오일(131)에 의해 둘러싸인 수용액 방울(132)을 형성하는 방법은 Lamagilov 등에 의해 제안된 방법(Rustem F. Lamagilov 등, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, No.7, 768-771)을 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이 형성된 다수의 수용액 방울(132)은 각각 핵산 증폭 반응의 반응기(reactor)로서의 역할을 하게 된다. 즉, 상기 다수의 수용액 방울(132) 내에서 핵산의 증폭 반응이 일어나게 된다. 다시 설명하면, 상기 다수의 수용액 방울(132)은 반응 채널(130)을 따라 흐르면서 상기 히터(121, 122)에 의해 가열된 기판(110)의 두 개의 온도 영역을 번갈아 반복적으로 통과하게 된다. 이 과정에서, 상기 다수의 수용액 방울(132) 내의 핵산 증폭 반응물도 가열과 냉각을 반복적으로 경험하게 되므로, 수용액 방울(132) 내에서 PCR의 세가지 단계, 즉 변성, 어닐링 및 신장 반응 단계가 다수의 사이클로 반복하여 일어나게 된다. 이에 따라, 수용액 방울(132) 내에는 상기한 바와 같은 연속 흐름(Continuous-Flow) PCR 방법에 의해 생성된 증폭산물의 농도가 점차 높아지게 되는 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면 반응물 수용액이 일정한 단면적을 가진 제1 인렛 채널(141)을 일정한 속도로 통과하게 되므로, 반응 채널(130) 내에 형성되는 수용액 방울(132)의 크기가 균일하게 된다. 그리고, 본 발명에 의하면 나노 리터(nℓ) 단위의 미세한 부피를 가진 수용액 방울(132)을 용이하게 만들 수 있으며, 비교적 작은 크기를 가진 장치 내에 수십 내지 수백 개의 수용액 방울(132)을 만들어 반복 실험을 할 수 있으므로, 대략 40 사이클의 PCR을 매우 빠른 시간, 예컨대 10분 이내에 수행할 수 있는 장점이 있다. 또한, 수용액 방울(132)이 오일(131)에 의해 둘러싸여 있으므로, 핵산 증폭 반응물이 반응 채널(130)의 내면에 흡착되어 오염을 유발하는 문제점이 발생하지 않을 뿐만 아니라, 반응물의 부피가 매우 작더라도 증발의 위험성이 없는 장점이 있다.
한편, 위에서 본 발명의 제1 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는 연속 흐름(Continuous-Flow) PCR 방법을 수행하기 위해 기판(110)을 두 개의 온도 영역으로 가열하는 두 개의 히터(121, 122)를 가지고 있는 것으로 도시되고 설명되었다. 그러나, 본 발명의 제1 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는 하나의 히터만 구비할 수도 있으며, 이 경우에는 기판(110) 전체를 동일한 온도로 가열 및 냉각하는 PCR 방법이 수행될 수 있다. 또한, 이 경우에는 PCR 방법이 아니라 LCR, SDA, NASBA, TMA 및 RAMP와 같은 전통적인 등온 증폭(isothermal amplification) 방법이 수행될 수도 있다. 즉, 본 발명은 PCR 방법에 한정되는 것이 아니라 다양한 핵산 증폭 방법에 적용될 수 있는 것이다.
<실시예 2 : 실시간(Real Time) PCR>
도 2는 본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이고, 도 3과 도 4는 본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치와 방법을 사용하여 PCR을 수행한 경우, 각 수용액 방울에서 발산되는 형광 시그널에 대한 CCD 이미지를 보여주는 도면과, 도 4는 사이클 수에 따른 형광 시그널의 세기를 보여주는 그래프이다.
먼저 도 2를 참조하면, 본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는, 기판(110)과, 상기 기판(110) 내부에 형성된 반응 채널(130) 및 다수의 인렛 채널(inlet channel, 241, 243, 245a, 245b, 247, 249, 151)과, 상기 기판(110)을 소정 온도로 가열하기 위한 가열 장치(120)를 구비한다.
여기에서, 상기 기판(110), 반응 채널(130) 및 가열 장치(120)의 구성은 전술한 제1 실시예에서와 동일하므로 이들에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는 실시간 PCR이 가능한 구성을 가진다. 이를 위해, 상기 기판(110) 내부에는 다수의 인렛 채널(inlet channel, 241, 243, 245a, 245b, 247, 249, 151)이 형성된다. 상세하게 설명하면, 상기 반응 채널(130)의 시작단에는, 상기 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액을 주입하기 위한 제1 인렛 채널(241)과, 상기 유체, 예컨대 오일을 주입하기 위한 제2 인렛 채널(151) 뿐만 아니라, 네거티브 컨트롤러(NTC ; Negative Controller) 수용액을 주입하기 위한 제3 인렛 채널(243)과, 표준 샘플 수용액을 주입하기 위한 제4 인렛 채널(249)이 연결된다. 구체적으로, 상기 제2 인렛 채널(151)은 반응 채널(130)의 시작단으로부터 직선상으로 연장되도록 형성될 수 있으며, 상기 제1, 제3 및 제4 인렛 채널(241, 243, 249)은 서로 소정 간격을 두고 상기 반응 채널(130)에 대해 직교하도록 연결될 수 있다. 그리고, 제1 인렛 채널(241)과 제3 인렛 채널(243)에는 각각 외부와 연결되는 주입구(inlet port, 242, 244)가 연결될 수 있다.
한편, 상기 제3 인렛 채널(243)을 통해서 네거티브 컨트롤러 대신에 포지티브 컨트롤러(positive controller)가 주입될 수도 있으며, 포지티브 컨트롤러를 주입하기 위한 인렛 채널이 부가로 마련될 수도 있다.
상기 제4 인렛 채널(249)에는, 두 가지 표준 샘플이 각각 주입되는 두 개의 표준 샘플 인렛 채널(245a, 245b)과, 상기 표준 샘플을 소정 농도로 희석하기 위한 증류수가 주입되는 증류수 인렛 채널(247)이 연결될 수 있다. 또한, 두 개의 표준 샘플 인렛 채널(245a, 245b)과 증류수 인렛 채널(247)에는 각각 외부와 연결되는 주입구(inlet port, 246a, 246b, 248)가 연결될 수 있다. 이와 같은 구성에 의하면, 상기 제4 인렛 채널(249)에서 상기 표준 샘플과 증류수가 만나 소정 농도의 표준 샘플 수용액이 생성된다. 따라서, 표준 샘플과 증류수의 흐름 속도를 조절하면, 서로 다른 농도를 가진 표준 샘플 수용액을 다양하고 용이하게 만들 수 있다. 이 때, 표준 샘플과 증류수가 충분히 혼합될 수 있도록, 상기 제4 인렛 채널(249)은 꾸불꾸불하게 형성된 것이 바람직하다.
상기한 바와 같은 구성을 가진 본 발명의 제2 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서, 상기 제2 인렛 채널(151)을 통해 오일(131)을 주입하면서 상기 제1, 제3 및 제4 인렛 채널(241, 243, 249) 각각을 통해 반응물 수용액, NTC 수용액 및 표준 샘플 수용액을 주입하면, 전술한 제1 실시예에서 설명한 바와 마찬가지로 반응 채널(130) 내부에 각각 오일(131)에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울(232), 다수의 NTC 수용액 방울(233) 및 다수의 표준 샘플 수용액 방울(234)이 형성된다. 이 때, 상기 수용액들을 소정의 시간 간격을 두고 교대로 주입하게 되면, 도 2에 도시된 바와 같이 반응 채널(130) 내에 상기 수용액 방울들(232, 233, 234)이 각각 몇개씩 교대로 형성될 수 있다. 이와 같이, 형성된 수용액 방울들(232, 233, 234)이 반응 채널(130)을 따라 흐르면서 두 개의 히터(121, 122)에 의해 가열된 기판(110)의 두 개의 온도 영역을 번갈아 반복적으로 통과하게 되면, 상기 수용액 방울들(232, 233, 234) 내에서 연속 흐름 PCR이 이루어지게 된다.
그리고, 형광 염료(fluorescent dye)를 각 수용액 내에 넣어준 뒤, 광학적 검출시스템을 이용하여 각 수용액 방울(232, 233, 234)로부터 발산되는 형광 시그널을 검출하게 되면, 핵산의 정량분석이 가능하게 된다. 다시 설명하면, 초기의 반응물 수용액 방울(232)이 반응 채널(130)의 말단부에 도달하였을 때, CCD 카메라를 사용하여 도 3에 도시된 바와 같은 형광 시그널에 대한 CCD 이미지를 얻을 수 있다. 도 3을 참조하면, 반응 채널을 따라 소정 간격을 두고 흐르고 있는 다수의 수 용액 방울 각각으로부터 형광 시그널이 발산되므로, 반응 채널 전체로부터 형광 시스널이 발산되는 종래의 경우에 비해 훨씬 간단하고 명확하게 형광 시그널의 정량 분석이 가능하게 된다. 그리고, 이와 같이 얻어진 상기 CCD 이미지를 분석하면 도 4에 도시된 바와 같은 실시간 PCR 곡선을 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 제2 실시예에 의하면 하나의 장치에서 한 번의 이미지 분석으로 실시간 PCR 곡선을 얻을 수 있으며, 이를 사용하여 핵산의 정량 분석을 할 수 있는 장점이 있다. 그리고, 하나의 반응 채널(130) 내에 반응물 수용액 뿐만 아니라 NTC 수용액 및 표준 샘플 수용액을 함께 주입하여 동시에 실험할 수 있으므로, PCR 장치의 크기가 종래에 비해 작아질 수 있으며 실시간 PCR에 필요한 시간도 훨씬 단축되는 장점이 있다. 또한, 표준 샘플과 증류수의 흐름 속도를 조절하면, 서로 다른 농도를 가진 표준 샘플 수용액을 다양하고 용이하게 만들 수 있으므로, 보다 정확한 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
<실시예 3 : 다중(Multiplex) PCR>
도 5는 본 발명의 제3 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 제3 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서, 기판(110), 반응 채널(130) 및 가열 장치(120)의 구성은 전술한 제1 실시예에서와 동일하므로 이들에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 제3 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는, 하나의 장치 내에서 여러가지 유전자를 한 번에 분석하는 다중(Multiplex) PCR이 가능한 구성을 가진다. 이를 위해, 상기 기판(110) 내부에는 반응물 수용액을 주입하기 위한 복수개, 예컨대 세 개의 제1 인렛 채널(341)과, 상기 복수의 제1 인렛 채널(341)에 서로 다른 종류의 프라이머 A, B 및 C를 각각 주입하기 위한 복수의 프라이머 인렛 채널(343)과, 오일을 주입하기 위한 하나의 제2 인렛 채널(151)이 형성된다. 상기 제2 인렛 채널(151)은 반응 채널(130)의 시작단으로부터 직선상으로 연장되도록 형성될 수 있으며, 상기 복수의 제1 인렛 채널(341)은 서로 소정 간격을 두고 상기 반응 채널(130)에 대해 직교하도록 연결될 수 있다. 그리고, 상기 복수의 프라이머 인렛 채널(343)은 복수의 제1 인렛 채널(341)에 각각 연결된다. 또한, 복수의 제1 인렛 채널(341)과 복수의 프라이머 인렛 채널(343)에는 각각 외부와 연결되는 주입구(342, 344)가 연결될 수 있다.
상기한 바와 같은 구성을 가진 본 발명의 제3 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서, 상기 복수의 프라이머 인렛 채널(343)을 통해 서로 다른 종류의 프라이머 A, B 및 C를 복수의 제1 인렛 채널(341) 내에 각각 주입하면, 복수의 제1 인렛 채널(341) 내부의 반응물 수용액에는 서로 다른 종류의 프라이머가 각각 함유된다. 이 과정에서 반응물 수용액과 프라이머가 충분히 혼합될 수 있도록, 상기 복수의 제1 인렛 채널(341) 각각은 꾸불꾸불하게 형성되는 것이 바람직하다.
이어서, 제2 인렛 채널(151)을 통해 오일(131)을 주입하면서 상기 복수의 제1 인렛 채널(341) 각각을 통해 반응물 수용액을 반응 채널(130) 내부로 주입하면, 반응 채널(130) 내부에는 각각 오일(131)에 의해 둘러싸이며 서로 다른 프라이머가 함유된 수용액 방울들(332a, 332b, 332c)이 형성된다. 이 때, 복수의 제1 인 렛 채널(341) 각각을 통해 상기 수용액들을 소정의 시간 간격을 두고 교대로 주입하게 되면, 도 5에 도시된 바와 같이 반응 채널(130) 내에 상기 수용액 방울들(332a, 332b, 332c)이 하나씩 교대로 형성될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 제3 실시예에 의하면 작은 크기를 가진 하나의 장치 내에서 여러가지 유전자를 한 번에 분석하는 다중(Multiplex) PCR이 가능한 장점이 있다. 또한, 서로 다른 프라이머를 가진 수용액 방울들(332a, 332b, 332c)이 각각 오일(131)에 둘러싸여 서로 접촉하지 않으므로 반응물 수용액 사이의 상호 오염이 방지되는 장점이 있다.
<실시예 4 : 핫 스타트(Hot Start) PCR>
도 6은 본 발명의 제4 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 제4 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서, 기판(110), 반응 채널(130) 및 가열 장치(120)의 구성은 전술한 제1 실시예에서와 동일하므로 이들에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 제4 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는, 핫 스타트(Hot Start) PCR이 가능한 구성을 가진다. 이를 위해, 상기 기판(110) 내부에는 반응물 수용액을 주입하기 위한 제1 인렛 채널(441)과, 상기 제1 인렛 채널(441)에 프라이머를 주입하기 위한 프라이머 인렛 채널(443)과, 상기 제1 인렛 채널(441)에 반응의 공통 성분, 예컨대 중합효소, dNTP, 버퍼 등을 주입하기 위한 공통 성분 인렛 채널(445)과, 오일을 주입하기 위한 제2 인렛 채널(151)이 형성된다. 상기 제2 인렛 채널(151)은 반응 채널(130)의 시작단으로부터 직선상으로 연장되도록 형성될 수 있으며, 상기 제1 인렛 채널(441)은 상기 반응 채널(130)에 대해 직교하도록 연결될 수 있다. 그리고, 상기 프라이머 인렛 채널(443)과 공통 성분 인렛 채널(445)은 각각 상기 제1 인렛 채널(441)의 대략 중간 부위에 연결된다. 또한, 상기 제1 인렛 채널(441), 프라이머 인렛 채널(443) 및 공통 성분 인렛 채널(445)에는 각각 외부와 연결되는 주입구(442, 444, 446)가 연결될 수 있다.
상기한 바와 같은 구성을 가진 본 발명의 제4 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서, 상기 제1 인렛 채널(441)에 타겟 DNA 수용액을 주입하면서, 프라이머 인렛 채널(443)과 공통 성분 인렛 채널(445)에 프라이머와 반응의 공통 성분을 각각 주입하게 되면, 상기 제1 인렛 채널(441)의 대략 중간 부위에서 타겟 DNA 수용액과 프라이머와 공통 성분이 혼합되어 핵산 증폭용 반응물 수용액이 생성된다. 이와 같이 생성된 반응물 수용액은 상기 제1 인렛 채널(441)을 통해 반응 채널(130) 내에 주입되고, 이에 따라 반응 채널(130) 내부에는 오일(131)에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울(432)이 형성된다. 이어서, 상기 수용액 방울들(432)이 반응 채널(130)을 따라 흐르면서 두 개의 히터(121, 122)에 의해 가열된 기판(110)의 두 개의 온도 영역을 번갈아 반복적으로 통과하게 되면, 상기 수용액 방울들(432) 내에서 연속 흐름 PCR이 이루어지게 된다.
이 과정에서, 수용액 방울들(432)이 첫번째 사이클의 융해 온도에 도달하기 전에 수용액 방울(432) 내의 반응물이 균일한 온도로 충분히 가열될 수 있도록, 상기 반응 채널(130)의 시작단 가까이의 일부분은 꾸불꾸불하게 형성된 것이 바람직 하다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 제4 실시예에 의하면, PCR의 첫번째 사이클 직전에 타겟 DNA 수용액과 프라이머와 공통 성분이 혼합되어 핵산 증폭용 반응물 수용액이 생성되므로, 핫 스타트 PCR이 가능하게 된다. 따라서, PCR이 시작되기 전의 낮은 온도에서 발생할 수 있는 프라이머-다이머의 형성 등의 비특이적인 반응을 방지할 수 있다.
<실시예 5 : 온도 프로그램 가능한 연속 흐름 PCR>
도 7은 본 발명의 제5 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 제5 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서, 기판(110), 반응 채널(130) 및 인렛 채널들(441, 443, 445, 151)의 구성은 전술한 제4 실시예에서와 동일하므로 이들에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 제5 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에는, 독립적으로 제어되는 다수의 히터(5211~521n)를 가진 가열 장치(520)가 구비된다. 구체적으로, 상기 히터들(5211~521n)은 서로 평행하게 배치되며 상기 기판(110)의 저면에 열적으로 접촉된다. 이와 같이 배치된 상기 히터들(5211~521n)은 각각 기판(110)의 일부분을 소정 온도로 가열하는 역할을 하게 된다.
이와 같은 구성에 의하면, 각 개별 히터(5211~521n)의 온도 조건을 필요에 따라 변경하여서 기판(110)의 온도 영역을 다양하게 프로그램할 수 있다. 예컨대, 상기 히터들(5211~521n)을 세 그룹으로 나누어 각 그룹마다 다른 온도로 제어하게 되면, 기판(110)에 세가지 온도(T1, T2, T3) 영역이 형성될 수 있다. 따라서, 본 실시예에 의하면, 하나의 장치를 사용하면서도 다양한 온도 조건에서 핵산 증폭 실험을 할 수 있는 장점이 있다.
그리고, 상기한 바와 같은 구성을 가진 가열 장치(520)는 전술한 제1 실시예 내지 제4 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에도 적용될 수 있다.
<실시예 6 : 단일 분자(Single Molecule) PCR>
도 8은 본 발명의 제6 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 8을 참조하면, 본 발명의 제6 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는, 단일 분자(Single Molecule) PCR이 가능한 구성을 가진다. 이를 위해, 기판(110) 내부에는 1단계 PCR을 위한 두 개의 1차 반응 채널(631, 632) 및 2단계 PCR을 위한 하나의 2차 반응 채널(633)과, 상기 두 개의 1차 반응 채널(631, 632) 각각에 반응물 수용액을 주입하기 위한 제1 인렛 채널(641)과, 상기 1차 반응 채널(631, 632) 각각에 오일을 주입하기 위한 두 개의 제2 인렛 채널(651, 653)이 형성된다.
상기 두 개의 제2 인렛 채널(651, 653)은 두 개의 1차 반응 채널(631, 632)의 시작단에 각각 연결되고, 상기 제1 인렛 채널(641)은 두 개의 1차 반응 채널(631, 632)의 시작단에 공통적으로 연결된다. 그리고, 제1 인렛 채널(641)과 두 개의 제2 인렛 채널(651, 653)에는 각각 외부와 연결되는 주입구(642, 652, 654)가 연결될 수 있다.
한편, 상기 두 개의 1차 반응 채널(631, 632)에 대해 공통적인 하나의 제2 인렛 채널이 마련될 수 있다. 그리고, 상기 두 개의 1차 반응 채널(631, 632) 각각에 대해 하나씩의 제1 인렛 채널이 마련될 수도 있다.
상기 두 개의 1차 반응 채널(631, 632) 각각의 말단은 상기 2차 반응 채널(633)의 시작단에 함께 연결되며, 2차 반응 채널(633)의 말단에는 외부와 연결되는 주입구(634)가 마련된다.
그리고, 상기 기판(110)의 하부에는 상기 기판을 가열하기 위한 가열 장치가 배치된다. 상기 가열 장치는, 도 8에 도시된 바와 같이, 상기 기판(110)의 저면에 열적으로 접촉되며 독립적으로 제어되는 다수의 히터(621 ~ 625)로 구성될 수 있다. 상기 다수의 히터(621 ~ 625) 각각은 기판(110)의 저면에 열적으로 접촉되어, 상기 기판(110)을 다수의 온도 영역으로 가열하게 된다. 예를 들어, 도 8에 도시된 바와 같이, 상기 히터(621 ~ 625)는 두 개의 1차 반응 채널(631, 632)과 한 개의 2차 반응 채널(633) 각각에 두 개의 온도 영역을 제공하도록 다섯 개로 구성될 수 있다.
상기한 바와 같은 구성을 가진 본 발명의 제6 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에 따르면, 두 개의 1차 반응 채널(631, 632) 각각의 내부에 오일(661)에 의해 둘러싸인 수용액 방울들(662a, 662b)이 형성된다. 이 때, 반응물 수용액에 함유된 핵산의 농도가 매우 낮은 경우에는, 1차 반응 채널(631, 632) 내에는 핵산이 상대적으로 낮은 농도로 함유되거나 핵산이 함유되지 않은 제1 수용액 방울(662a)과 핵산이 상대적으로 높은 농도로 함유된 제2 수용액 방울(662b)이 형성될 수 있다. 이와 같이 형성된 수용액 방울들(662a, 662b)이 1차 반응 채널(631, 632)을 따라 흐르면 서 1단계의 PCR이 이루어지게 된다. 이 과정에서, 핵산이 상대적으로 높은 농도로 함유된 제2 수용액 방울(662b) 내의 프라이머는 거의 소비되는데 반하여, 제1 수용액 방울(662a) 내의 프라이머는 거의 그대로 남아있게 된다.
이와 같이 1단계의 PCR이 완료된 수용액 방울들(662a, 662b)은 상기 2차 반응 채널(633)에서 만나 합쳐지게 된다. 이 때, 제1 수용액 방울(662a)끼리 또는 제2 수용액 방울(662b)끼리 합쳐질 수도 있으나. 제1 수용액 방울(662a)과 제2 수용액 방울(662b)이 서로 합쳐져 제3 수용액 방울(662c)를 형성할 수도 있다. 이 때, 제2 수용액 방울(662b) 내의 핵산이 제1 수용액 방울(662a) 내의 프라이머와 만나게 되므로, 제3 수용액 방울(662c) 내에는 핵산과 프라이머가 모두 존재하게 된다. 따라서, 제3 수용액 방울(662c)이 2차 반응 채널(633)을 따라 흐르면서 2단계의 PCR이 이루어질 수 있게 된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면 하나의 장치 내에서 두 단계의 PCR이 이루어지게 되며, 이에 따라 PCR의 민감도(sensitivity)가 획기적으로 향상될 수 있다. 그리고, 하나의 장치 내에 수십 내지 수백개의 수용액 방울들(662a, 662b)을 계속적으로 만들 수 있으므로, 한 번의 실험에 의해서도 저농도의 핵산을 충분하게 증폭할 수 있게 된다. 또한, 반응기(reactor)로서의 역할을 하는 수용액 방울들(662a, 662b, 662c)의 체적이 매우 작으므로, 저농도의 핵산을 증폭하는데 있어서 그 민감도가 훨씬 높아지게 된다.
한편, 상기한 바와 같은 두 단계의 PCR에 의한 단일 분자(Single Molecule) PCR 방법은 채널 형태의 반응 용기를 가진 핵산 증폭 장치 뿐만 아니라, 이하에서 설명되는 챔버 형태의 반응 용기응 가진 핵산 증폭 장치에도 적용될 수 있다.
<실시예 7 : 단일 분자(Single Molecule) PCR>
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 제7 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 개략적으로 도시한 평면도로서, 도 9a는 1단계 PCR을 설명하기 위한 도면이고, 도 9b는 2단계 PCR을 설명하기 위한 도면이다.
먼저 도 9a를 참조하면, 본 발명의 제7 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는, 기판(110)과, 상기 기판(110) 내부에 형성된 반응 챔버(130), 인렛 채널(741, 751) 및 아웃렛 채널(outlet channel, 761)과, 상기 기판(110)을 소정 온도로 가열하기 위한 가열 장치를 구비한다.
상기 기판(110)의 구성은 전술한 제1 실시예에서와 동일하다.
상기 반응 챔버(730)는, 상기 기판(110) 내부에 형성되어 핵산 증폭 반응이 일어나는 반응 용기(reaction vessel)로서의 역할을 하며, 다각형 또는 원형의 형상을 가질 수 있다. 그리고, 상기 반응 챔버(730)는 하나의 기판(110) 상에 다수개가 형성될 수 있다.
상기 반응 챔버(730)의 일단에는 반응물 수용액이 주입되는 제1 인렛 채널(741)과, 유체, 예컨대 오일이 주입되는 제2 인렛 채널(751)이 연결된다. 그리고, 상기 반응 챔버(730)의 타단에는 반응 챔버(730)로부터 증폭산물과 오일이 배출되는 아웃렛 채널(761)이 연결된다. 또한, 상기 제1 및 제2 인렛 채널(741, 751)에는 각각 외부와 연결되는 주입구(742, 752)가 마련되고, 상기 아웃렛 채널(761)에는 외부와 연결되는 배출구(762)가 마련된다.
상기 가열 장치는 상기 기판(110)의 하부에 배치되어 상기 기판(110)을 소정 온도로 가열하는 히터(721)로 구성된다.
이하에서는, 상기한 바와 같이 구성된 본 발명의 제7 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 이용한 핵산 증폭 방법을 설명하기로 한다.
먼저, 상기한 바와 같이 반응물 수용액과, 유체, 예컨대 오일(731)을 각각 상기 제1 인렛 채널(741)과 제2 인렛 채널(751)을 통해 상기 반응 챔버(730) 내에 주입하여, 상기 반응 챔버(730) 내에 오일(731)에 의해 둘러싸인 다수의 수용액 방울(732a, 732b)을 형성한다. 이 때, 상기 제1 인렛 채널(741)을 통과하는 반응물 수용액의 흐름 속도를 일정하게 조절하면, 반응 챔버(730) 내에 형성되는 다수의 수용액 방울(732a, 732b)은 균일한 체적을 가지게 된다. 이 과정에서, 반응물 수용액에 함유된 핵산의 농도가 매우 낮은 경우에는, 반응 챔버(730) 내에는 핵산이 상대적으로 낮은 농도로 함유되거나 핵산이 함유되지 않은 제1 수용액 방울(732a)과 핵산이 상대적으로 높은 농도로 함유된 제2 수용액 방울(732b)이 형성될 수 있다.
이어서, 상기 히터(721)를 이용하여 일정한 사이클로 상기 기판(110)을 가열 및 냉각을 반복하게 되면, 상기 수용액 방울(732a, 732b) 내에서 1 단계 PCR이 이루어지게 된다. 이 과정에서, 핵산이 상대적으로 높은 농도로 함유된 제2 수용액 방울(732b) 내의 프라이머는 거의 소비되는데 반하여, 제1 수용액 방울(732a) 내의 프라이머는 거의 그대로 남아있게 된다.
다음으로 도 9b를 참조하면, 상기한 바와 같이 1단계 PCR이 완료된 후, 원심분리를 통하여 제1 수용액 방울(732a)과 제2 수용액 방울(732b)이 서로 합쳐지게 하여 보다 큰 부피를 가진 제3 수용액 방울(732c)을 형성한다. 그러면, 제2 수용액 방울(732b) 내의 핵산이 제1 수용액 방울(732a) 내의 프라이머와 만나게 되므로, 제3 수용액 방울(732c) 내에는 핵산과 프라이머가 모두 존재하게 된다.
이어서, 상기 히터(721)를 이용하여 일정한 사이클로 상기 기판(110)을 가열 및 냉각을 반복하게 되면, 상기 제3 수용액 방울(732c) 내에서 2단계 PCR이 이루어질 수 있게 된다.
한편, 위에서 본 발명의 제7 실시예에 따른 핵산 증폭 장치는 PCR 방법을 수행하기 위한 것으로 설명되었다. 그러나, 상기한 핵산 증폭 장치를 사용하여 PCR 방법 뿐만 아니라, LCR, SDA, NASBA, TMA 및 RAMP와 같은 전통적인 등온 증폭(isothermal amplification) 방법도 수행할 수 있다.
<실험예>
상기한 본 발명의 제1 실시예 내지 제6 실시예에 있어서, 연속-흐름 PCR을 실시하는 경우에, 반응 채널 내에는 열전도율이 서로 다른 반응물 수용액과 오일이 흐르고 있으므로, 그 각각의 유속과, 기판의 두께, 히터와 반응 채널 사이의 간격 등 설계 변수의 설정이 필요하다.
따라서, 이하에서는 기판과, 반응 채널 내부를 흐르는 반응물 수용액 및 오일에 대한 열적 특성을 고려한 시뮬레이션들을 통해 핵산 증폭 장치의 설계에 필요한 변수가 제공된다.
아래 표 1에는, 몇가지 물질에 대한 열적 특성들이 나타나 있다.
구 분 thermal conductivity (W/m·K) density (kg/m3) specific heat (J/kg·k) thermal diffusivity (㎡/s) Rank kinematic viscosity (㎡/s)
Si 157 2329 700 9.630E-05 1
Glass 1.13 2520 753 5.955E-07 5
Polycarbonate 0.2 1200 1250 1.333E-07 7
Thermally Conductive LCP 20 1700 900 1.307E-05 3
Water 0.613 997 4179 1.471E-07 6 1.000E-06
SiO2 10.4 2650 745 5.268E-06 4
Pt 71.6 21500 133 2.504E-05 2
Perfluorodecalin (C10F18) 0.0677 1930 970 3.613E-08 9 2.94-E-06
PDMS 0.17 1050 1315 1.231E-07 8
위 표 1을 보면, PDMS와 퍼플루오로데카린(perfluorodecalin ; C10F18)의 열적 특성이 가장 나쁜 것으로 나타나 있다.
따라서, 이하의 시뮬레이션들에 있어서는, 최악의 조건에서 시뮬레이션을 수행하기 위해 기판으로서 PDMS를 선정하였고 오일로서 퍼플루오로데카린을 선정하였다.
<실험예 1 : 2차원 시뮬레이션>
도 10a와 도 10b는 2차원 시뮬레이션 조건을 설명하기 위한 개략적인 증폭 장치 단면도들이다.
먼저 도 10a를 참조하면, 기판은 PDMS로 이루어졌고, 기판의 저면에는 히터가 배치되었으며, 기판의 내부에는 폭(WC)과 높이(HC)가 각각 100㎛인 반응 채널이 형성되었다. 그리고, 반응 채널과 히터 사이의 기판의 두께(GP)는 10㎛로 설정되었으며, 반응 채널 내의 물의 높이(HW)는 90㎛로 설정되었다.
이상과 같은 조건에서 첫번째 2차원 시뮬레이션이 실시되었다.
그리고, 반응 채널의 종횡비(aspect ratio : 폭(WC)/높이(HC))와 반응 채널의 높이(HC)에 대한 물의 높이(HW)의 비를 각각 몇가지로 변경시키면서 두번째 2차원 시뮬레이션들이 실시되었다.
다음으로 도 10b를 참조하면, 세번째 2차원 시뮬레이션을 위해, 반응 채널과 히터 사이의 기판의 두께(GP)가 100㎛로 변경되었으며, 나머지 조건들은 도 10a 도시된 것과 동일하게 설정되었다.
한편, 반응 채널 내의 물의 단면 형상은 표면장력에 의해 실제로는 원형에 가까울 것이지만, 시뮬레이션을 보다 용이하게 하기 위하여, 도 10a와 도 10b에 도시된 바와 같이 반응 채널 내의 물의 단면 형상을 사각형으로 가정하였다.
그리고, 아래 표 2에는 상기한 2차원 시뮬레이션의 구체적인 조건들이 정리되어 있다.
구 분 채널과 히터 사이 기판의 두께 (GP) 채널의 종횡비 (폭(WC)/높이(HC)) 채널 높이에 대한 물 높이의 비 (HW)/(HC) 온도 조건
냉 각 가 열
① 10㎛ 1(100/100) 0.5 95℃ => 60℃ 30℃ => 95℃
② 0.8
③ 0.9
④ 2(140/70) 0.8
⑤ 0.9
⑥ 4(200/50) 0.8
⑦ 0.9
⑧ 100㎛ 1(100/100) 0.9
도 11 내지 도 15에는 상기한 2차원 시뮬레이션의 결과들이 도시되어 있다.
도 11은 도 10a에 도시된 조건에 따라 실시된 2차원 시뮬레이션 결과, 95℃ 에서 60℃로 냉각시 시간에 따른 온도 분포를 보여주는 도면이다.
도 11을 보면, 0.5초 이내에 핵산 증폭 장치의 모든 영역, 즉 기판과 반응 채널 내부의 오일 및 물이 균일하게 목표 온도에 도달함을 알 수 있다.
도 12는 위 표 2의 조건에 따라 2차원 시뮬레이션을 실시한 결과, 시간에 따른 물의 온도 변화를 보여주는 그래프이다. 도 12에서 각 온도 곡선은 물이 존재하는 영역의 한 단면에 대한 6군데의 온도를 평균한 값을 시간에 대해 표시한 것이다.
도 12의 그래프를 보면, 반응 채널과 히터 사이의 기판의 두께(GP)가 10㎛인 경우에는, 온도 하강 및 상승시 반응 채널의 종횡비에 상관 없이 0.5초 정도면 목표 온도에 도달함을 알 수 있다.
도 12에서, 온도 상승시와 온도 하강시에 온도 변화의 크기가 차이가 있으므로, 온도 변화를 총 온도 변화값에 대해 정규화하여 그 값을 시간에 대해 표시한 것이 도 13의 그래프이다.
도 13의 그래프를 보면, 온도 상승시의 시간에 따른 온도 변화와 온도 하강시의 시간에 따른 온도 변화가 거의 유사함을 알 수 있다.
상기한 시뮬레이션 결과를 종합해 보면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 방법과 장치에 의하면 온도 변화에 대한 응답 속도가 상당히 빨라서 신속한 PCR이 이루어 질 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 있어서, 오일에 의해 둘러싸인 물 방울내의 온도 변화시 온도의 균일성이 중요한 항목이 되는데, 전술한 시뮬레이션을 통해 이를 검증하였다.
도 14는 표 2의 조건에 따라 2차원 시뮬레이션을 실시한 결과, 시간에 따른 물의 온도의 표준편차를 보여주는 그래프이다. 도 14에서 각 표준편차 곡선은 물이 존재하는 영역의 한 단면에 대한 6군데의 온도의 표준편차를 평균한 값을 시간에 대해 표시한 것이다.
도 14의 그래프를 보면, 반응 채널과 히터 사이의 기판의 두께(GP)가 10㎛인 경우에는, 표준편차가 1℃ 이내로 균일해지는 시간이 반응 채널의 종횡비에 상관 없이 0.3초 이내임을 알 수 있다. 그리고, 반응 채널과 히터 사이의 기판의 두께(GP)가 100㎛인 경우에도, 0.4초 이내에 온도 표준편차가 1℃ 이내로 균일하게 된다는 것을 알 수 있다.
도 14의 그래프에 나타난 온도의 표준편차가 총 온도 변화량에서 차지하는 비율을 나타낸 것이 도 15의 그래프이다.
도 15의 그래프를 보면, 총 온도 변화량의 2%내의 온도 균일성을 갖는 안정화에 필요한 시간이 0.5초 이내임을 확인할 수 있다. 이는 50℃의 온도변화가 일어날 때, 1℃ 이내의 온도 균일성을 갖는데 0.5초면 충분함을 의미한다.
<실험예 2 : 3차원 시뮬레이션>
실험예 2는, 앞에서 살펴본 2차원적인 상태의 시뮬레이션을 수행한 이후, 실 제 구조에 근접한 3차원 구조에 대한 열적 특성을 해석하기 위한 것이다.
도 16은 3차원 시뮬레이션을 위한 증폭 장치의 구조를 도시한 개략도이다.
도 16을 보면, PDMS로 이루어진 기판의 하부에 두 개의 히터가 배치되어 있으며, 기판의 내부에는 반응 채널이 형성되어 있다. 그리고, 반응 채널의 내부에는 오일에 의해 둘러싸인 물이 방울 형태로 존재하고 있다.
이러한 구조에 있어서, 3차원 시뮬레이션 수행을 위한 구체적인 조건은 도 10a에 도시된 조건과 동일하게 설정되었다. 즉, 반응 채널의 폭(WC)과 높이(HC)는 각각 100㎛로 설정되었고, 반응 채널과 히터 사이의 기판의 두께(GP)는 10㎛로 설정되었다. 물 방울의 크기는 그 높이, 폭 및 길이가 각각 90㎛로 설정되었으며, 제1 히터의 길이는 3000㎛, 제2 히터의 길이는 1000㎛로 설정되었다.
그리고, 3차원 시뮬레이션의 초기 조건은 아래와 같다. 도 16에서 오른쪽의 제1 히터의 온도는 60℃이고, 제1 히터가 설치된 영역의 오일과 물의 초기 온도는 95℃이며, 왼쪽의 제2 히터의 온도는 95℃이고, 제2 히터가 설치된 영역의 오일과 물의 초기 온도는 60℃이다. 따라서, 제1 히터가 설치된 영역은 오일과 물이 95℃에서 60℃로 냉각되는 영역이 되고, 제2 히터가 설치된 영역은 오일과 물이 60℃에서 95℃로 가열되는 영역이 된다.
도 17 내지 도 21에는 상기한 3차원 시뮬레이션의 결과들이 도시되어 있다.
도 17은 도 16에 도시된 조건에 따라 실시된 3차원 시뮬레이션 결과, 시간에 따른 각 영역의 온도 분포를 보여주는 도면이다.
도 17을 보면, 0.5초 이내에 핵산 증폭 장치의 모든 영역이 균일하게 목표 온도에 도달함을 알 수 있다.
도 19는 도 16에 도시된 조건에 따라 3차원 시뮬레이션을 실시한 결과, 시간에 따른 물의 온도 변화를 보여주는 그래프이다. 도 19에서 각 온도 곡선은 물이 존재하는 영역에서 18군데의 온도를 평균한 값을 시간에 대해 표시한 것이다. 그리고, 도 20은 도 19의 그래프에 나타난 온도 변화를 총 온도 변화값으로 정규화하여 그 값을 시간에 대해 표시한 그래프이다.
상기 도 19와 도 20의 그래프에는, 3차원 시뮬레이션 결과를 2차원 시뮬레이션 결과와 비교하기 위해 3차원 및 2차원 시뮬레이션 결과가 함께 표시되어 있으며, 3차원 시뮬레이션에서 가열 영역에 대한 온도 곡선은 ⑪로 표시되어 있고, 냉각 영역에 대한 온도 곡선은 ⑫로 표시되어 있다.
도 19의 그래프와 도 20의 그래프를 보면, 3차원 시뮬레이션 결과는 2차원 시뮬레이션 결과와 큰 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있다.
한편, 신속한 PCR을 위해서는, 오일과 물 방울이 반응 채널을 따라 흘러가면서 그 아래에 배치된 히터의 온도까지 빠른 시간내에 도달해야 한다. 따라서, 서로 다른 온도를 가진 두 개의 영역이 근접해 있을 경우, 채널 내부의 공간적 온도 분포를 살펴 보았다.
도 18은 채널의 길이 방향을 따른 채널 내부의 온도 분포룰 도시한 그래프이다. 도 18에서, 왼쪽의 1mm는 온도가 95℃인 영역이고 오른쪽의 3mm는 온도가 60℃인 영역이다.
도 18을 보면, 어느 하나의 온도 영역이 다른 온도 영역에 영향을 미치는 거리는 양 방향으로 각각 0.5mm 정도이므로, 서로 다른 온도를 가진 두 개의 영역이 상호간의 영향을 완전하게 벗어나는 거리는 대략 1mm 정도가 필요한 것을 확인할 수 있다.
전술한 2차원 시뮬레이션에서와 마찬가지로 3차원 시뮬레이션을 통해 오일에 의해 둘러싸인 물 방울내의 온도의 균일성을 확인하기 위해, 물 방울 내의 18개 지점에 대해 온도의 표준편차를 구하였다.
도 21은 3차원 시뮬레이션 결과, 온도의 표준편차가 총 온도 변화량에서 차지하는 비율을 나타낸 그래프이다. 상기 도 21의 그래프에는, 3차원 시뮬레이션 결과를 2차원 시뮬레이션 결과와 비교하기 위해 3차원 및 2차원 시뮬레이션 결과가 함께 표시되어 있으며, 3차원 시뮬레이션에 대한 곡선은 ⑪로 표시되어 있다.
도 21의 그래프를 보면, 총 온도 변화량의 2%내의 온도 균일성을 갖는 안정화에 필요한 시간이 0.5초 이내임을 확인할 수 있다. 이는 50℃의 온도변화가 일어날 때, 1℃ 이내의 온도 균일성을 갖는데 0.5초면 충분함을 의미한다.
이상의 시뮬레이션 결과, 온도와 균일도에 대한 응답 특성은 아래 표 3에 정리되어 있다.
시뮬레이션 구 분 채널과 히터 사이의 기판의 두께 (GP) 채널의 종횡비 (폭(WC) /높이(HC)) 채널높이에 대한 물높이의 비 (HW)/(HC) 냉 각 가 열
90% Target (msec) NorStdev = 2% (msec) 90% Target (msec) NorStdev = 2% (msec)
3차원 10㎛ 1(100/100) 0.9 287 384 262 703
2차원 10㎛ 1(100/100) 0.5 320 212 316 238
0.8 271 284 268 325
0.9 239 292 236 337
2(140/70) 0.8 186 185 184 201
0.9 155 190 154 208
4(200/50) 0.8 133 142 132 152
0.9 113 143 112 153
100㎛ 1(100/100) 0.9 620 440 618 556
표 3을 보면, 열적 특성의 중요한 지표인 시간에 따른 온도의 응답 특성과 온도의 균일도 모두 1초 이내에 원하는 수준에 도달함을 확인할 수 있다. 특히, 히터와 반응 채널 사이의 PDMS 기판의 두께가 10um 정도인 경우에, 0.5초 이내에 균일한 온도분포를 가지며 원하는 목표 온도에 도달할 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명은 개시된 실시예들과 실험예들을 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 분야에서 통상적 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.
이상에서 설명된 바와 같이 본 발명에 의하면, 반응물 수용액이 일정한 단면적을 가진 인렛 채널을 일정한 속도로 통과하게 되므로, 반응 채널 또는 반응 챔버 내에 오일에 의해 둘러싸이며 미세하고 균일한 크기를 가진 다수의 수용액 방울을 용이하게 형성할 수 있게 된다. 따라서, 비교적 작은 크기를 가진 장치 내에 수십 내지 수백 개의 수용액 방울을 만들어 반복 실험을 할 수 있으므로, PCR을 매우 빠른 시간 이내에 수행할 수 있는 장점이 있다. 또한, 수용액 방울이 오일에 의해 둘러싸여 있으므로, 핵산 증폭 반응물이 반응 채널의 내면에 흡착되어 오염을 유발하는 문제점이 발생하지 않을 뿐만 아니라, 반응물의 부피가 매우 작더라도 증발의 위험성이 없는 장점이 있다.
그리고, 하나의 반응 채널 내에 반응물 수용액 뿐만 아니라 NTC 수용액 및 표준 샘플 수용액을 함께 주입하여 동시에 실험할 수 있으므로, PCR 장치의 크기가 종래에 비해 작아질 수 있으며 실시간 PCR에 필요한 시간도 훨씬 단축되는 장점이 있다. 또한, 반응 채널을 따라 소정 간격을 두고 흐르고 있는 다수의 수용액 방울 각각으로부터 형광 시그널이 발산되므로, 반응 채널 전체로부터 형광 시스널이 발산되는 종래의 경우에 비해 훨씬 간단하고 명확하게 형광 시그널의 정량 분석이 가능하게 된다. 또한, 하나의 장치에서 한 번의 이미지 분석으로 실시간 PCR 곡선을 얻을 수 있으며, 이를 사용하여 핵산의 정량 분석을 할 수 있는 장점이 있다.
그리고, 본 발명에 의하면, 인렛 채널의 구조를 변경함으로써 작은 크기를 가진 하나의 장치 내에서 여러가지 유전자를 한 번에 분석하는 다중(Multiplex) PCR이 가능할 뿐만 아니라 핫 스타트 PCR도 가능하게 된다.
그리고, 독립적으로 제어되는 다수의 히터를 가진 가열 장치를 구비하게 되면, 기판의 온도 영역을 다양하게 프로그램할 수 있으므로, 하나의 장치를 사용하면서도 다양한 온도 조건에서 핵산 증폭 실험을 할 수 있는 장점이 있다.
그리고, 본 발명에 의하면 하나의 장치 내에서 두 단계의 PCR에 의한 단일 분자(Single Molecule) PCR이 가능하게 되며, PCR의 민감도(sensitivity)도 향상되는 장점이 있다.

Claims (38)

  1. 핵산 증폭용 반응물이 함유된 반응물 수용액과, 상기 반응물 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 서로 다른 인렛 채널을 통해 반응 용기 내에 주입시키는 제1 단계;
    상기 반응물 수용액이 상기 유체와 만나 상기 반응 용기 내에 상기 유체에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울을 형성하는 제2 단계; 및
    상기 다수의 반응물 수용액 방울 내에서 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제3 단계;를 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유체는 실리콘 오일, 광물성 오일, 과불화(perfluorinated) 오일, 탄화수소 오일 및 식물성 오일로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 오일인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제3 단계에서, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산 증폭 반응은 PCR, LCR, SDA, NASBA, TMA 및 RAMP로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 방 법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 제3 단계에서, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산 증폭 반응은 PCR 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제3 단계에서, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산의 증폭 반응은, 상기 기판 전체를 일정한 온도로 가열 및 냉각을 반복함으로써 핵산의 증폭 반응이 이루어지게 하는 PCR 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 제3 단계에서, 상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산의 증폭 반응은, 상기 기판을 서로 다른 온도를 가진 적어도 두 개의 영역으로 가열한 상태에서, 상기 다수의 반응물 수용액 방울을 상기 두 개의 영역을 번갈아 반복적으로 통과하게 함으로써 핵산의 증폭 반응이 이루어지게 하는 연속 흐름 PCR 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    독립적으로 제어되는 다수의 히터를 사용하여 상기 기판을 변경 가능한 적어 도 두 개의 온도 영역으로 가열하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 제1 단계에서, 정량 분석을 위한 네거티브 컨트롤러 및 포지티브 컨트롤러 중 적어도 하나의 수용액과 표준 샘플 수용액을 상기 인렛 채널들과는 또 다른 각각의 인렛 채널을 통해 상기 반응 용기 내에 주입시키고,
    상기 제2 단계에서, 상기 네거티브 컨트롤러 및 포지티브 컨트롤러 중 적어도 하나의 수용액과 상기 표준 샘플 수용액이 상기 유체와 만나 상기 반응 용기 내에 상기 다수의 반응물 수용액 방울과 함께 다수의 컨트롤러 수용액 방울과 다수의 표준 샘플 수용액 방울을 형성하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 제1 단계에서, 상기 표준 샘플 수용액은 적어도 두 가지의 농도로 조절되어 상기 반응 용기 내에 주입되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  10. 제 4항에 있어서,
    상기 제1 단계에서, 적어도 두 종류의 프라이머가 각각 함유된 적어도 두 종류의 반응물 수용액이 서로 다른 인렛 채널을 통해 상기 반응 용기 내에 주입되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  11. 제 4항에 있어서,
    상기 제1 단계에서, 핵산 수용액, 중합효소와 dNTP를 포함하는 공통 성분 및 프라이머를 각각의 인렛 채널에 주입하고, 이들이 상기 반응 용기에 주입되기 직전에 혼합되어 상기 반응물 수용액을 형성하도록 하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 반응 용기는, 두 개의 1차 반응 채널과, 상기 두 개의 1차 반응 채널 각각의 말단에 연결되는 하나의 2차 반응 채널로 이루어지고, 상기 제1 단계, 제2 단계 및 제3 단계는 상기 두 개의 1차 반응 채널 각각에 대해 수행되며,
    상기 제3 단계에 이후에,
    상기 2차 반응 채널의 시작단에서 상기 다수의 반응물 수용액 방울이 합쳐져 상기 2차 반응 채널 내에 다수의 합쳐진 반응물 수용액 방울을 형성하는 제4 단계; 및
    상기 다수의 합쳐진 반응물 수용액 방울 내에서 다시 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제5 단계;를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 반응 용기는, 적어도 하나의 반응 챔버로 이루어지며,
    상기 제3 단계 이후에,
    상기 반응 챔버 내의 상기 다수의 반응물 수용액 방울을 합쳐지게 하는 제4 단계; 및
    상기 합쳐진 반응물 수용액 방울 내에서 다시 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 하는 제5 단계;를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 제4 단계에서, 상기 다수의 반응물 수용액 방울은 원심 분리에 의해 합쳐지는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  15. 기판;
    상기 기판의 내부에 형성된 반응 용기;
    상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 핵산 증폭용 반응물이 함유된 수용액을 상기 반응 용기 내부로 주입하기 위한 적어도 하나의 제1 인렛 채널;
    상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 상기 수용액과 분리되며 증폭 반응에 관여하지 않는 유체를 상기 반응 용기 내부로 주입하기 위한 제2 인렛 채널; 및
    상기 기판에 설치되어 상기 기판을 가열하는 가열 장치;를 구비하며,
    상기 반응물 수용액이 상기 유체와 만나 상기 반응 용기 내에 상기 유체에 의해 둘러싸인 다수의 반응물 수용액 방울을 형성하고, 상기 다수의 반응물 수용액 방울 내에서 핵산의 증폭 반응이 일어나도록 된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 유체는 실리콘 오일, 광물성 오일, 과불화(perfluorinated) 오일, 탄화수소 오일 및 식물성 오일로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 오일인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 기판은 소수성의 표면 성질을 가진 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 기판은 PDMS(Poly Dimethyl Siloxane), 실리콘, 실리콘 다이옥사이드, 플라스틱 및 글라스로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  19. 제 15항에 있어서,
    상기 기판은 하부 기판과 상부 기판으로 이루어지며, 상기 하부 기판과 상부 기판 사이에 상기 반응 용기, 제1 인렛 채널 및 제2 인렛 채널이 형성되는 것을 특 징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  20. 제 15항에 있어서,
    상기 수용액 방울 내에서의 핵산 증폭 반응은 PCR, LCR, SDA, NASBA, TMA 및 RAMP로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 반응물 수용액 방울 내에서의 핵산 증폭 반응은 PCR 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 반응 용기는 꾸불꾸불하게 형성된 반응 채널이며, 상기 반응 채널의 시작단에 상기 제1 인렛 채널과 제2 인렛 채널이 연결되고, 상기 반응 채널의 말단에 상기 유체와 증폭산물을 배출시키기 위한 배출구가 마련된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 가열 장치는, 상기 기판의 하부에 배치되어 상기 기판을 서로 다른 온도를 가진 적어도 두 개의 영역으로 가열하는 적어도 두 개의 히터를 가진 것을 특 징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 가열 장치는, 상기 기판을 변경 가능한 적어도 두 개의 온도 영역으로 가열할 수 있도록, 상기 기판의 하부에 서로 평행하게 배치되며 독립적으로 제어되는 다수의 히터를 가진 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서,
    상기 반응 채널은 상기 두 개의 온도 영역을 번갈아 반복적으로 통과하도록 형성되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  26. 제 22항에 있어서,
    상기 제2 인렛 채널은 상기 반응 채널의 시작단으로부터 직선상으로 연장되도록 형성되며, 상기 제1 인렛 채널은 상기 제2 인렛 채널에 대해 직교하도록 형성되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  27. 제 22항에 있어서,
    상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 정량 분석을 위한 네거티브 컨트롤러 및 포지티브 컨트롤러 중 적어도 하나의 수용액을 상기 반응 채널 내부로 주입하기 위한 제3 인렛 채널과,
    상기 기판의 내부에 형성되며 상기 반응 용기의 일단에 연결되어, 정량 분석을 위한 표준 샘플 수용액을 상기 반응 채널 내부로 주입하기 위한 제4 인렛 채널을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 제4 인렛 채널에는, 표준 샘플이 각각 주입되는 적어도 두 개의 표준 샘플 인렛 채널과, 상기 표준 샘플을 소정 농도로 희석하기 위한 증류수가 주입되는 증류수 인렛 채널이 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 제4 인렛 채널은 꾸불꾸불하게 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  30. 제 22항에 있어서,
    상기 제1 인렛 채널은 적어도 두개가 형성되고, 상기 적어도 두 개의 제1 인렛 채널에 서로 다른 종류의 프라이머를 주입하기 위한 적어도 두 개의 프라이머 인렛 채널이 상기 적어도 두 개의 제1 인렛 채널에 각각 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 적어도 두 개의 제1 인렛 채널 각각은 꾸불꾸불하게 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  32. 제 22항에 있어서,
    상기 제1 인렛 채널에는, 상기 제1 인렛 채널에 프라이머를 주입하기 위한 프라이머 인렛 채널과, 상기 제1 인렛 채널에 중합효소와 dNTP를 포함하는 공통 성분을 주입하기 위한 공통 성분 인렛 채널이 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 반응 채널의 시작단 가까이의 일부분은 꾸불꾸불하게 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  34. 제 15항에 있어서,
    상기 반응 용기는, 꾸불꾸불하게 형성된 두 개의 1차 반응 채널과, 상기 두 개의 1차 반응 채널 각각의 말단에 함께 연결되며 꾸불꾸불하게 형성된 하나의 2차 반응 채널로 이루어지며, 상기 제1 인렛 채널과 제2 인렛 채널은 상기 두 개의 1차 반응 채널의 시작단에 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 가열 장치는, 상기 두 개의 1차 반응 채널과 한 개의 2차 반응 채널 각각에 두 개의 온도 영역을 제공할 수 있도록, 상기 기판의 저면에 배치되며 독립적으로 제어되는 다수의 히터를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  36. 제 15항에 있어서,
    상기 반응 용기는 반응 챔버이며, 상기 반응 챔버의 일단에 상기 제1 인렛 채널과 제2 인렛 채널이 연결되고, 상기 반응 챔버의 타단에 상기 유체와 증폭산물을 배출시키기 위한 아웃렛 채널이 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 반응 챔버, 상기 제1 인렛 채널, 상기 제2 인렛 채널 및 상기 아웃렛 채널은 각각 다수개가 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  38. 제 36항에 있어서,
    상기 가열 장치는, 상기 기판의 하부에 배치되어 상기 기판 전체를 소정 온도로 가열하는 하나의 히터를 가진 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
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