CN102224170A - 抑制与fgfr4相关的癌细胞侵袭的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合并抑制癌细胞侵袭的分离的抗体或其抗体片段。任选地，所述抗体或其片段与FGFR4被单克隆抗体F90-10C5所结合的表位结合，或包含与单克隆抗体F90-10C5相同的互补决定区。还提供了使用所述抗体或其片段调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移以及在对象中治疗癌症的方法。本发明还提供了抑制侵袭力的抗体或抗体片段的鉴定方法。

Description

抑制与FGFR4相关的癌细胞侵袭的材料和方法

与相关申请的交叉参考

本申请要求2008年9月3日提交的美国临时专利申请No.61/093,925和2009年3月2日提交的美国临时专利申请No.61/156,634的优先权。

技术领域

总的来说，本发明涉及癌症治疗，还涉及与成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)结合的抗体和抗体片段及其使用，以及包含它们的组合疗法。

发明背景

肿瘤细胞侵袭在癌症病理发生中扮演重要角色。癌细胞穿过底层基底膜的侵入以及向远处器官的转移，被认为是癌发生和癌扩散中的限速步骤。在这些过程中，肿瘤细胞依靠细胞表面上的定向蛋白水解活性穿过基底膜屏障，并侵入富含胶原蛋白或纤维蛋白的间质和临时基质(temporary matrixes)并在其中生长。继发肿瘤在身体远处区域的形成使治疗选择复杂化，并经常在癌症患者中产生不良临床结果。

当前的癌症治疗策略聚焦于通过促凋亡、抗增殖和抗血管生成疗法阻断肿瘤生长。例如，已经提出生长因子受体例如成纤维细胞生长因子受体作为抑制增殖的可能的靶。参见例如St.Bernard等，Endocrinology，146(3)：1145-1153(2005)。生长因子受体信号传导的可能调节物包括例如小分子、失活配体和抗体。Kwabi-Addo等，Endocrine-Related Cancer，11：709-724(2004)。例如，Chen等，Hybridoma，24(3)：152-159(2005)，据称鉴定了与人类乳腺癌肿瘤细胞系上的FGFR4结合的抗体。但是，抑制肿瘤侵袭的尝试还没有成功。因此，开发靶向细胞侵袭的新的干预方法，对于更有效的癌症治疗来说是极为重要的。

发明概述

总的来说，本发明涉及可用于***性疾病例如癌症的的材料，包括抗体物质、核酸、多肽和组合物。本发明还涉及使用这些材料的方法，包括治疗方法、医疗应用和制造药物组合物的应用。本发明还涉及用于筛选新疗法和新组合疗法的工具。

本发明提供了分离的抗体或抗体片段，其(i)与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，并且(ii)抑制癌细胞侵袭。此外，本发明提供了单克隆抗体F90-10C5，以及包含单克隆抗体F90-10C5的一个或多个、优选所有互补决定区(CDR)并与哺乳动物细胞中表达的FGFR4的细胞外表位结合的分离的抗体、抗体片段或多肽。另一方面，本发明提供了与FGFR4被单克隆抗体F90-10C5结合的表位相结合的分离的抗体例如单克隆抗体或其片段。抗体所识别的FGFR4可以包含FGFR4 G388蛋白或FGFR4 R388变体的氨基酸序列。包含抗体、其片段或多肽并任选与其他治疗物和/或可药用载体、赋形剂、佐剂等组合的组合物，也包括在本发明中。

本发明还提供了用于制造所要求权利的抗体或其片段的材料和方法。例如，本发明提供了编码本发明的抗体或其片段的分离的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、包含该多核苷酸或载体的分离的宿主细胞以及杂交瘤。本发明还提供了分离的多核苷酸，其包含编码选自抗体重链可变区和抗体轻链可变区的至少一个氨基酸序列的核苷酸序列。重链可变区和轻链可变区包含与单克隆抗体F90-10C5的互补决定区(CDR)相同的CDR。本发明还提供了鉴定抗体或抗体片段的方法。方法包含获得与FGFR4结合的一个或多个抗体或抗体片段；在肿瘤细胞侵袭力分析中筛选抗体或抗体片段；以及鉴定在所述分析中将侵袭力抑制至少50％的抗体。

本发明还包括使用本发明的抗体或其片段的方法。例如，提供了调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移的方法。方法包含将癌细胞群体与含有本发明的抗体或其片段的组合物相接触，所述组合物的量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长(ingrowth)或转移。方法可以在体内进行，这种情况下癌细胞是在哺乳动物对象中，并且接触步骤包含向哺乳动物对象给药组合物。

另一方面，本发明包括通过给药包含本发明的抗体、其片段或多肽的组合物来治疗对象的方法。例如，在一个实施方案中，方法包含选择被诊断患有癌症或接受癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗；以及向对象给药本发明的组合物，其量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。还提供了治疗癌症的方法。方法包含向对象给药包含癌症治疗有效量的本发明抗体或其片段的组合物。任选地，(i)抗体或其片段与FGFR4被单克隆抗体F90-10C5结合的表位结合，并且(ii)方法还包含将癌细胞群体与抗体或其片段接触(或向对象给药所述抗体或其片段)，所述抗体或其片段所结合的FGFR4的表位与mAb F90-10C5识别的表位不同。供选地或此外，方法可以包含将癌细胞群体与MT1-MMP抑制剂接触(或向对象给药所述抑制剂)。

在本发明的某些变化形式中，对象所患癌症包含的细胞含有至少一个FGFR4等位基因，所述等位基因的特征是388位氨基酸为精氨酸(FGFR4 R388)。该特定等位基因与癌细胞侵袭增加和患者预后差相关，并可以从本发明的方法获得出人意料的益处。癌细胞可能由于癌症局域性突变或由于等位基因遗传而具有FGFR4 R288等位基因。作为本发明的一个方面，特别考虑到了选择在癌症中具有一个或多个FGFR4 R388等位基因的癌症患者进行治疗。

下面编号的段落各自简洁定义了本发明的一个或多个示例性变化形式：

1.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，并抑制癌细胞侵袭。

2.一种分离的多肽，所述多肽包含与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽抑制癌细胞侵袭。

3.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与表达FGFR4 R388(SEQ ID NO：2)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，并抑制细胞内成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR4磷酸化。

4.一种分离的多肽，所述多肽包含与表达FGFR4 R388(SEQ ID NO：2)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽抑制细胞中成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR4磷酸化。

5.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与共表达FGFR4 R388(SEQ ID NO：2)和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，其中所述抗体或片段增加细胞内成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR1降解。

6.一种分离的多肽，所述多肽包含与共表达FGFR4 R388(SEQ ID NO：2)和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽增加细胞内成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR1降解。

7.第5或6段的抗体、抗体片段或多肽，其还抑制细胞中FGF2诱导的FGFR4磷酸化。

8.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与共表达FGFR4 R388(SEQ ID NO：2)和膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，其中所述抗体或片段抑制细胞中FGFR4与MT1-MMP之间复合物形成。

9.一种分离的多肽，所述多肽包含与共表达FGFR4 R388(SEQ ID NO：2)和膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽抑制细胞中FGFR4与MT1-MMP之间复合物形成。

10.第3-9段任一段的抗体、抗体片段或多肽，其抑制癌细胞侵袭。

11.第1-10段任一段的抗体、抗体片段或多肽，其中抗体与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的FGFR4结合。

12.第1-10段任一段的抗体、抗体片段或多肽，其中抗体与包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的FGFR4结合。

13.第1-12段任一段的抗体、抗体片段或多肽，其中抗体与由选自SEQ ID NO：5-9的氨基酸序列构成的FGFR4肽结合。

14.第13段的抗体、抗体片段或多肽，其与由SEQ ID NO：7构成的FGFR4肽结合。

15.第13段的抗体、抗体片段或多肽，其中抗体或抗体片段与SEQ ID NO：1或2的包含79-81位氨基酸残基的表位结合。

16.一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段与FGFR4被单克隆抗体F90-10C5结合的表位结合。

17.第2、4、6和9段任一段的多肽，其中抗体是单克隆抗体F90-10C5。

18.第1-17段任一段的抗体片段或多肽，其中抗体片段是抗体的SeFv、Fv、Fab′、Fab、双抗体或F(ab′)2抗原结合片段。

19.一种包含单克隆抗体F90-10C5的所有互补决定区(CDR)的分离的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽与哺乳动物细胞表达的FGFR4的细胞外表位结合。

20.第19段的抗体、抗体片段或多肽，其包含单克隆抗体F90-10C5的可变区。

21.第1-20段任一段的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段在肿瘤细胞侵袭力分析中抑制表达FGFR4 R388蛋白的MDA-MB-231细胞的侵袭。

22.第21段的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段在肿瘤细胞侵袭力分析中使细胞侵袭降低至少25％。

23.第21段的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段在肿瘤细胞侵袭力分析中使细胞侵袭降低至少50％。

24.第20段的抗体，其是单克隆抗体F90-10C5。

25.一种包含单克隆抗体F85-6C5的所有互补决定区(CDR)的分离的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽与哺乳动物细胞表达的FGFR4的细胞外表位结合。

26.第25段的抗体、抗体片段或多肽，其包含单克隆抗体F85-6C5的可变区。

27.第26段的抗体，其是单克隆抗体F85-6C5。

28.一种包含单克隆抗体F90-3B6的所有互补决定区(CDR)的分离的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽与哺乳动物细胞表达的FGFR4的细胞外表位结合。

29.第28段的抗体、抗体片段或多肽，其包含单克隆抗体F90-3B6的可变区。

30.第29段的抗体，其是单克隆抗体F90-3B6。

31.第1、3、5、7、8、10-15和21-23段任一段的抗体或抗体片段，其中抗体是单克隆抗体。

32.第1、3、5、7、8、10-15和20-31段任一段的抗体或抗体片段，其中所述抗体是人源化抗体、人类抗体或嵌合抗体。

33.一种人源化抗体，所述人源化抗体包含mAb F90-10C5、F85-6C5或F90-3B6的可变区或mAb F90-10C5、F85-6C5(DSM ACC2966)或F90-3B6(DSM ACC2965)的可变区与FGFR4结合的任何片段。

34.第1-33段任一段的抗体、抗体片段或多肽，其还包含与其结合或连接的抗肿瘤或细胞毒性药剂。

35.第34段的抗体、抗体片段或多肽，其中抗肿瘤药剂包含放射性核苷酸。

36.一种组合物，所述组合物包含第1-35段任一段的抗体、抗体片段或多肽以及生理可接受载体(carrier)。

37.第36段的组合物，其还包含标准医护(standard of care)抗癌治疗化合物。

38.第36或37段的组合物，其还包含抑制VEGFR-3或VEGFR-2的VEGF-D或VEGF-C刺激的药剂。

39.第38段的组合物，其中药剂包含选自下列的成员：

与VEGF-C、VEGF-D、或VEGFR-3或VEGFR-2的细胞外结构域结合的抗体或抗体片段；

包含VEGFR-3的细胞外结构域或其与VEGF-C或VEGF-D有效结合的片段的可溶性蛋白；以及

包含VEGFR-2的细胞外结构域或其与VEGF-C或VEGF-D有效结合的片段的可溶性蛋白。

40.第36-38段任一段的组合物，其中抗体、抗体片段或多肽是单克隆抗体或其片段(“第一种单克隆抗体或其片段”)。

41.第40段的组合物，其还包含第二种单克隆抗体或其片段，所述第二种单克隆抗体或其片段与FGFR4的第二个表位结合，所述第二个表位与第一种单克隆抗体或其片段所识别的表位不同。

42.第41段的组合物，其中第二种单克隆抗体或其片段是人类或人源化抗体。

43.第36-42段任一段的组合物，其还包含膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)抑制剂。

44.第43段的组合物，其中MT1-MMP抑制剂是与MT1-MMP结合的抗体或其片段，或MT1-MMP的小分子抑制剂。

45.第43段的组合物，其中MT1-MMP抑制剂是与MT1-MMP基因组DNA或mRNA杂交并抑制MT1-MMP转录或翻译的抑制核酸。

46.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第1-33段任一段的抗体、抗体片段或多肽的核苷酸序列。

47.一种载体，所述载体包含第46段的多核苷酸。

48.第47段的载体，其是表达载体。

49.第48段的载体，其是复制缺陷型病毒载体。

50.一种组合物，所述组合物包含第49段的载体和生理可接受载体。

51.一种分离的细胞，所述细胞用第46-49段任一段的多核苷酸或载体转化或转染。

52.一种分离的细胞，所述细胞生产第1-33段任一段的抗体、抗体片段或多肽。

53.一种杂交瘤，所述杂交瘤生产第24、27和30-32段任一段的单克隆抗体或抗体片段。

54.一种调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移的方法，其中所述方法包含将癌细胞群体与其量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移的第1-50段任一段的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或组合物接触。

55.第54段的方法，其中癌细胞是在哺乳动物对象中，并且接触包含向哺乳动物对象给药所述组合物。

56.一种治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含：

选择被诊断患有癌症或接受过癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗；以及

向对象给药第36-45和50段任一段的组合物，所述组合物的量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

57.第55或56段的方法，其中(i)组合物包含第13-17段任一段的抗体、抗体片段或多肽，并且

其中方法还包含向哺乳动物对象给药抗体或其片段，所述抗体或其片段与FGFR4的第二个表位结合，所述第二个表位与所述组合物的抗体、抗体片段或多肽所识别的表位不同。

58.第57段的方法，其中与第二个表位结合的抗体或其片段是mAb F90-3B6或其片段。

59.第55或56段的方法，其中组合物是第36-42段任一段的组合物，并且其中方法还包含向哺乳动物对象给药含有膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)抑制剂的组合物。

60.第59段的方法，其中MT1-MMP抑制剂是与MT1-MMP结合的抗体或其片段，或MT1-MMP的小分子抑制剂。

61.第55或56段的方法，其中组合物是第36-37和40-42段任一段的组合物，并且其中方法还包含向哺乳动物对象给药含有抑制VEGR-3或VEGFR-2的VEGF-D或VEGF-C刺激的药剂的组合物。

62.第55-61段任一段的方法，其中方法还包含向哺乳动物对象实施标准医护抗癌治疗。

63.一种在对象中治疗癌症的方法，其中方法包含向对象给药治疗癌症有效量的第36-45和50段任一段的组合物。

64.第1-50段任一段的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或组合物在哺乳动物对象中抑制癌细胞的侵袭、向内生长或转移中的应用。

65.第64段的应用，其与MT1-MMP抑制剂或者VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-3或VEGFR-2结合的抑制剂相组合，用于在哺乳动物对象中抑制癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

66.第64或65段的应用，其中(i)组合物包含第13-17段任一段的抗体、抗体片段或多肽，与结合FGFR4的第二个表位的抗体或其片段组合使用，所述第二个表位与组合物的抗体、抗体片段或多肽所识别的表位不同。

67.第54-66段任一段的方法或应用，其中对象是人类。

68.第54-67段任一段的方法或应用，其中癌症选自乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤、***癌、间皮瘤、肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、子宫癌、结肠直肠癌和胰腺癌。

69.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码选自抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)的至少一个氨基酸序列的核苷酸序列，其中V_H和V_L包含与单克隆抗体F90-10C5的互补决定区(CDR)相同的CDR。

70.一种载体，所述载体包含第69段的多核苷酸。

71.一种细胞，所述细胞包含第69段的多核苷酸或第70段的载体，其中(a)细胞表达含有V_H和V_L的抗体或抗体片段，并且(b)所述抗体或抗体片段与FGFR4结合。

72.一种选择抗体或抗体片段的方法，其中所述方法包含：

(a)获得与FGFR4结合的一个或多个抗体或抗体片段；

(b)在肿瘤细胞侵袭力分析中筛选所述抗体或抗体片段；以及

(c)选择在分析中将侵袭力抑制至少50％的抗体。

73.第72段的方法，其中(b)包含在三维胶原蛋白侵袭分析中使用成纤维细胞生长因子-2作为化学吸引剂检测表达FGFR4的肿瘤细胞的侵袭。

74.一种分离的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段通过第72或73段的方法选择。

75.保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、保藏登记号为DSM ACC2967的杂交瘤细胞系。

76.在DSMZ保藏登记号DSM ACC2966下保藏的杂交瘤细胞系。

77.在DSMZ保藏登记号DSM ACC2965下保藏的杂交瘤细胞系。

78.一种分离的细胞，所述细胞能够生产抗体mAb F90-3B6。

79.第78段的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤F90-3B6(DSMZ保藏登记号为DSM ACC2965)。

80.一种分离的细胞，所述细胞能够生产抗体mAb F90-10C5。

81.第80段的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤F90-10C5(DSMZ保藏登记号为DSM ACC2967)。

82.一种分离的细胞，所述细胞能够生产抗体mAb F85-6C5。

83.第82段的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤F85-6C5(DSMZ保藏登记号为DSM ACC2966)。

84.一种分离的抗原肽，所述抗原肽由编码FGFR4的氨基酸序列的5-25个氨基酸构成，其中所述肽包含在SEQ ID NO：5-9任一个中提出的氨基酸序列或其片段。

85.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第84段的抗原肽。

86.一种载体，所述载体包含第85段的多核苷酸。

87.一种分离的细胞，所述细胞包含第86段的载体。

88.一种组合物，所述组合物包含第84段的肽和佐剂。

89.第56-63段任一段的方法，其包含确定癌症中存在或不存在编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因的步骤，其中如果癌症具有至少一个编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因，则实施治疗。

90.一种治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含：选择被诊断患有癌症或接受过癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗，其中癌症包括含有至少一个编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因的细胞；以及向对象给药权利要求36-45和50任一项的组合物，所述组合物的量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

91.第89或90段的方法，其中FGFR4 R388等位基因的存在或不存在通过使用差异结合FGFR4 R388和G388等位基因的抗体或抗体片段分析FGFR4蛋白来确定。

92.第89或90段的方法，其中FGFR4 R388等位基因的存在或不存在通过分析来自对象或来自癌症的核酸来确定。

93.一种治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含：选择被诊断患有癌症或接受过癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗；以及向对象给药第一种抗FGFR4抗体或其FGFR4结合片段和第二种抗FGFR4抗体或其FGFR4结合片段，其中第一种抗FGFR4抗体或片段抑制FGF2诱导的FGFR4 R388磷酸化，并且其中第二种抗FGFR4抗体或片段抑制不依赖配体的FGFR4磷酸化。

94.第93段的方法，其中第一和第二种抗体或其片段作为包含第一种抗体或片段的第一种组合物和包含第二种抗体或片段的第二种组合物同时或相继地分别给药。

95.第90-94段任一段的方法，其还包含向对象实施标准医护癌症化疗。

上面的概述不打算定义本发明的每个方面，其他方面描述在其他部分、例如详细描述中。整个文件打算作为统一的公开内容联系起来，并且应该理解，已考虑到本文所描述的特点的所有组合，即使没有在本文件的同一句子或段落或部分中发现这些特点组合在一起。当描述蛋白(例如抗体)治疗时，具体考虑到了涉及多核苷酸治疗(使用编码蛋白的多核苷酸/载体)的实施方案，反之亦然。当针对具体抗体例如FGFR4单克隆抗体对本发明的实施方案进行描述时，应该认识到，涉及抗体片段、变体等的类似实施方案也被具体考虑到了。

除了上述之外，另一方面，本发明包括以任何方式在范围上比上面具体提到的变化形式更窄的本发明的所有实施方案。对于以类属描述的本发明的方面来说，所有个体物种被单独视为本发明的独立方面。对于用无具体数量指代的术语描述或要求权利的本发明的方面来说，除非上下文明确要求更限定性的意义，否则应该理解为这些术语意味着“一个或多个”。对于以组内的一个或多个加以描述的要素来说，应该理解为考虑到了组内的所有组合。

尽管本申请人发明了在此所附的权利要求书的全部范围，但在此所附的权利要求书不打算在其范围内涵盖其他人的先有技术工作。因此，在权利要求书范围内的法定先有技术被专利局或其他实体或个人提请本申请人注意的情况下，本申请人保留在适用的专利法下行使修改权的权利，重新定义该权利要求书的主题内容以从该权利要求书的范围中具体排除该法定先有技术或法定先有技术的明显变化形式。由该修改的权利要求书所定义的本发明的变化形式也打算作为本发明的方面。对于本技术领域的专业人员来说，从本申请的全部内容可以明显看出本发明的其他特点和变化形式，并且所有这些特点都打算作为本发明的方面。

附图说明

图1是显示了各种激酶(列于X-轴上)的MMP2活化相对水平(活性/潜伏)(Y-轴)的图，证实了相对于模拟物转染的对照细胞来说高于2倍的诱导MMP2活化。

图2是由配体-受体结合引起的吸收(Y-轴)与潜在结合阻断物的浓度(nM)(X-轴)的比较图。

图3A-C是二聚化FGFR4的三维结构的供选视图，用珠状区域描绘了抗体F90-10C5所结合的表位区(SEQ ID NO：5-9)的位置。

图4A-4C是响应单位(Y-轴)与mAb 10C5(在本文中也称为AbF90-10C5)(图4A)、mAb 6C5(在本文中也称为Ab F85-6C5)(图4B)和mAb 3B6(在本文中也称为Ab F90-3B6)(图4C)的浓度(nM)(X-轴)的比较图。

图5是概括了使用对照抗体、mAb 10C5、mAb 6C5和mAb 3B6(X-轴)处理时胶原蛋白侵袭灶的数量(Y-轴)的图。

图6显示了从MDA-MB-231细胞制备的免疫印迹，所述细胞用编码带V5标签的FGFR4 R388(FGFR4 R)的表达载体转染。将细胞用mAb F90-3B6、mAb F90-10C5或mAb F90-3B6与mAb F90-10C5的组合预处理过夜，并且不进行刺激(-)或与FGF2温育(+)。将细胞提取物用针对FGFR4的抗体(IP：FGFR4)免疫沉淀，并使用针对V5标签的抗体(IB：V5)或针对磷酸酪氨酸残基的抗体(IB：pY)进行免疫印迹。

图7显示了从COS-1细胞制备的免疫印迹，所述细胞用编码带V5标签的FGFR4 G388(“FGFR4 G”或“FR4 G”)、带V5标签的FGFR4 R388(“FGFR4 R”或“FR4 R”)和FGFR1的表达载体单独或组合转染。将细胞用mAb F85-6C5或mAb F90-10C5预处理，并且与FGF2温育(+)或不进行刺激(-)。将细胞提取物用抗FGFR4抗体(IP：FGFR4)免疫沉淀，并使用抗磷酸酪氨酸抗体(IB：pY)、针对FGFR1的抗体(IB：FGFR1)或针对V5标签的抗体(IB：V5)进行免疫印迹。在FGF2刺激后，mAb F90-10C5处理抑制了FGF2诱导的FGFR4 R388磷酸化和FGFR1下调，而mAb F85-6C5降低了配体不依赖性FGFR4磷酸化和FGFR4/FGFR1的异源二聚化。

发明详述

本发明至少部分涉及出人意料地鉴定到某些抗成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)抗体抑制癌细胞侵袭到周围组织中。尽管不希望受到具体作用机制的限制，但本发明人令人吃惊地确定了FGFR4与在癌症和反应性细胞中表达的人类膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)在功能上相关联。MT1-MMP主要被隐蔽在组织微环境中，使其能够逃脱被许多已知的MMP抑制剂失活。FGFR4代表了MT1-MMP介导的转移事件的新靶。本发明提供了与FGFR4结合并抑制或下调癌细胞侵袭的分离的抗体或其片段，以及使用所述抗体或其片段调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移的方法。通过这种方式，本发明的抗体具有减慢癌症发展的治疗用途。

FGFR4

FGFR4是由FGF激活的四种跨膜受体酪氨酸激酶之一(Givol等，FASEB J.，6：3362-3369，1992)。受体由三个免疫球蛋白(Ig)样细胞外结构域、跨膜结构域、酪氨酸激酶和COOH端尾区构成(Givol等，同上)。已报道了至少两种已知的人类FGFR4的氨基酸序列，其差别由影响388位密码子的突变引起，在该位置处产生甘氨酸(FGFR4 G388，SEQ ID NO：1)或精氨酸(FGFR4 R388，SEQ ID NO：2)。带有R388突变的等位基因与侵袭性肿瘤发展相关，并被视为临床结果差的指标(参见例如Bange等，Cancer Res.，62(3)：840-7，2002)。突变导致蛋白的跨膜结构域中疏水氨基酸被亲水氨基酸取代。在这方面，野生型FGFR4的跨膜结构域大致包含氨基酸序列RYTDIILYASGSLALAVLLLLAGLY(SEQ ID NO：3)，而R388突变体包含的跨膜结构域大致包含氨基酸序列RYTDIILYASGSLALAVLLLLARLY(SEQ ID NO：4)。R388 FGFR4突变体进一步描述在例如Bange等，同上和美国专利6,770,742中，其在此引为参考。

抗体及其片段

本发明的某些实施方案或方面涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段与FGFR4(包含任何FGFR4多肽的氨基酸序列，包括FGFR4的任何天然存在的同工型或等位基因变体)的细胞外表位结合，并抑制癌细胞侵袭。例如，抗体或其片段与哺乳动物(例如人类)细胞表面上表达的FGFR4结合。抗体或其片段可以与包含SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列的FGFR4结合，所述FGFR4通常被称为FGFR4 G388等位基因。供选地或此外，抗体或其片段可以与其中野生型FGFR4的388位甘氨酸被精氨酸取代的FGFR4(FGFR4 R388等位基因)(SEQ ID NO：2)结合。

优选，抗体或其片段与FGFR4的细胞外表位结合。FGFR4的细胞外区域的三个免疫球蛋白(Ig)样结构域延伸到跨膜结构域之外并进入细胞外空间，并且参考SEQ ID NO：1和2，大致包含FGFR4氨基酸序列的25-369位氨基酸残基。在本发明的某些方面，所述抗体或其片段与位于跨越25-366位氨基酸残基的细胞外结构域的区域、例如FGFR4细胞外区域的第一个免疫球蛋白样结构域(大致跨越FGFR4氨基酸序列的50-107位氨基酸残基)中的细胞外表位结合。FGFR4的细胞外结构域进一步描述在Loo等，Int.J.Biochem.Cell Biol.，32：489-97，2000和Sorenson等，J.Cell.Sci.，117：1807-1819，2004中，其与FGFR4相关的公开内容在此引为参考。

任何类型的抗体都适合于本发明的情形，包括具有全长重链和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人类抗体。本发明还包括保留了本发明FGFR4抗体的FGFR4结合特性的抗体片段(和/或包含抗体片段的多肽)。抗体片段包括抗体的抗原结合区和/或效应区，例如F(ab′)₂、Fab、Fab′、Fd、Fc和Fv片段(由非共价连接的重链和轻链可变区构成的片段)或单域抗体(纳米抗体)。一般来说，可变(V)区结构域可以是免疫球蛋白重链可变区(V_H)和/或轻链可变区(V_L)的任何适合的排列。因此，例如，V区结构域可以是二聚的，并包含与FGFR4结合的V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。如果需要，V_H和V_L链可以直接或通过接头共价连接，以形成单链Fv(scFv)。为了易于指称，scFv蛋白在本文中作为包括在“抗体片段”门类中指称。同样，抗体片段可以合并到单域抗体、大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、内抗体(intrabody)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、新抗原受体的可变结构域(v-NAR)和双-单链Fv区(参见，例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology，23(9)：1126-1136，2005)中，以抑制癌细胞侵袭。此外，本发明提供了分离的多肽，其包含与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段。如果需要，将所述抗体片段与具有效应功能(例如细胞毒活性、免疫招募活性等)的部分、便于从混合物分离的部分(例如标签)、检测标记物等融合。应该理解，本文描述的本发明的抗体或其片段的特点也扩展到包含抗体片段的多肽。

抗体或抗体片段可以从免疫动物分离、合成或遗传工程生产。源自于抗体的抗体片段可以通过例如抗体的蛋白水解来获得。例如，完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化分别产生被称为F(ab’)₂的5S片段或两个单价Fab片段和Fc片段。F(ab)₂可以用巯基还原剂进一步切开，产生3.5SFab单价片段。产生抗体片段的方法进一步描述在例如下列文献中：Edelman等，Methods in Enzymology，1：422 Academic Press (1967)；Nisonoff等，Arch.Biochem.Biophys.，89：230-244，1960；Porter，Biochem.J.，73：119-127，1959；美国专利No.4,331,647；以及Andrews，S.M.和Titus，J.A.的《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology)(Coligan等主编)，John Wiley & Sons，New York(2003)，第2.8.1-2.8.10和2.10A.1-2.10A.5页。

抗体或其片段也可以进行遗传工程改造，以便所述抗体或抗体片段包含例如由重组DNA工程技术产生的可变区结构域。例如，可以通过对所述抗体的氨基酸序列进行***、缺失或改变或在抗体的氨基酸序列中进行***、缺失或改变来修饰特定的抗体可变区，以产生目标抗体。为此，例如通过使用抗体产生细胞的mRNA作为模板，使用聚合酶链反应合成可变区，来制备编码目标互补决定区(CDR)的多核苷酸(参见，例如Courtenay-Luck在《单克隆抗体：生产、工程和临床应用》(Monoclonal Antibody：Production，Engineering and Clinical Application)，Ritter等主编(Cambridge University Press 1995)，第166页中的“单克隆抗体的遗传操作”(Genetic Manipulation of Monoclonal Antibody)；Ward等在《单克隆抗体：原理和应用》(Monoclonal Antibody：Principles and Applications)，Birch等主编，(Wiley-Liss，Inc.1995)第137页中的“抗体的遗传操作和表达”(Genetic Manipulation and Expression of Antibody)；以及Larrick等，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，2：106-110，1991)。目前的抗体操作技术允许构建工程化的可变区结构域，其含有来自于第一个抗体的至少一个CDR和任选的一个或多个构架氨基酸，并且可变区结构域的剩余部分来自于第二个抗体。这样的技术被用于例如对抗体进行人源化以增加其对结合靶的亲和性。

“人源化抗体”是其中单克隆抗体的互补决定区已经从非人类免疫球蛋白的重和轻可变链转移到人类可变结构域中的重组蛋白。不需要存在恒定区，但是如果它们存在，它们任选与人类免疫球蛋白恒定区基本一致，即在某些实施方案中至少约85-90％、约95％或以上一致。因此，在某些情况下，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR部分之外，都与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分基本上一致。例如，在一个方面中，人源化抗体是其中宿主抗体的高变区残基被来自非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长动物的具有所需特异性、亲和性和能力的抗体(供体抗体)的高变区取代的人类免疫球蛋白(宿主抗体)。人源化抗体、例如本文所描述的，可以使用本技术领域的专业人员已知的技术来生产(Zhang等，Molecular Immunology，42(12)：1445-1451，2005；Hwang等，Methods，36(1)：35-42，2005；Dall′Acqua等，Methods，36(1)：43-60，2005；Clark，Immunology Today，21(8)：397-402，2000和美国专利No.6,180,370、6,054,927、5,869,619、5,861,155、5,712,120和4,816,567，所有文献全部在此明确引为参考)。

在一个实施方案中，抗体是人类抗体，例如但不限于可变区中构架区和CDR区两者都源自人类种系免疫球蛋白序列的抗体，如例如Kabat等(1991)在《免疫重要蛋白的序列》(Sequences of proteins of Immunological Interest)第五版，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号No.91-3242中所述。如果抗体含有恒定区，恒定区也优选源自于人类种系免疫球蛋白序列。人类抗体可以包含不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基以例如增加抗体活性，但是不包含源自于其他物种的CDR(即放置在人类可变区架构区中的小鼠CDR)。

抗体或其片段与FGFR4的任何区域结合，只要癌细胞侵袭被抑制(或减少)和/或保留一种或多种其他所需活性参数即可。在一个实施方案中，本发明还提供了与FGFR4被单克隆抗体(mAb)F90-10C5(在本文中也称为“10C5”)结合的表位结合的分离的抗体或抗体片段，其在下面的实施例中进一步描述。mAb F90-10C5的结合活性被定位于FGFR4的细胞外区域的第一个免疫球蛋白样结构域(参见图3A-3C)。令人吃惊的是，mAb F90-10C5识别FGFR4氨基酸序列的大致67-93位氨基酸中的线性表位，正如通过由跨越FGFR4细胞外结构域的67-93位氨基酸(不包含信号序列)的一系列15个氨基酸片段(其序列有三个氨基酸重叠)构成的免疫印记阵列所确定的。mAb F90-10C5与下列FGFR4片段结合：YKEGSRLAPAGRVRG(SEQ ID NO：5)；GSRLAPAGRVRGWRG(SEQ ID NO：6)；LAPAGRVRGWRGRLE(SEQ ID NO：7)；AGRVRGWRGRLEIAS(SEQ ID NO：8)和VRGWRGRLEIASFLP(SEQ ID NO：9)。分离的抗体或其片段优选与包含SEQ ID NO：5-9中提出的任一个或多个氨基酸序列的肽结合。更优选，分离的抗体或其片段与包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列(或由其构成)的肽结合。

与FGFR4结合并抑制癌细胞侵袭的其他抗体也适合于本发明的情况。例如，在各种实施方案中，本发明包括给药抗体或其片段，所述抗体或其片段(i)竞争与mAb F90-10C5的结合，(ii)与FGFR4被mAb F90-10C5识别的区域结合，或(iii)在FGFR4细胞外区域的67-93位氨基酸残基(例如73-78位氨基酸残基或79-81位氨基酸残基)处或附近结合，同时抑制癌细胞侵袭。如果需要，抗体片段包含抗体例如mAb F90-10C5的所有或部分抗原结合元件，包括mAb F90-10C5(或本发明的任何其他抗体)的可变区。抗体片段可以包含抗体的所有或部分抗原结合元件，同时缺乏抗体的所有或部分构架区。在这方面，分离的抗体或其片段包含抑制癌细胞侵袭的FGFR4结合抗体例如mAbF90-10C5的一个、两个、三个、四个、五个或六个(即所有)互补决定区(CDR)。鉴定互补决定区和特异性决定区的方法在本技术领域中是已知的，并进一步描述在例如Tamura等，J.Immunol.，164：1432-1441，2000中。在一个实施方案中，抗体或其片段是mAb F90-10C5或其FGFR4结合片段。

在本发明的情形中，抗体结合是指抗体的可变区与抗原之间的免疫反应，其与其他蛋白质-蛋白质相互作用(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A与免疫球蛋白的相互作用)截然不同。抗体或其片段优选倾向性结合FGFR4，意味着抗体或其片段与FGFR4的结合比它与无关对照蛋白的结合具有更高的亲和性。更优选，抗体或其片段特异性识别和结合FGFR4(或其部分)。“特异性结合”意味着基本上不存在与无关对照蛋白的交叉反应性。在本发明的某些变化形式中，抗体基本上专一与FGFR4结合(即利用结合亲和性的可测量差异能够辨别FGFR4与其他已知多肽(例如其他FGFR))。取决于实施方案，抗体或其片段与FGFR4结合的亲和性，比对无关对照蛋白的亲和性高至少5、10、15、20、25、50、100、250、500、1000或10,000倍。在其他变化形式中，抗体与其他FGFR序列交叉反应。用于测定抗体的结合特异性/亲和性以及鉴定竞争结合位点(即交叉阻断例如mAb F90-10C5与FGFR4的结合)的抗体的筛选分析法在本技术领域中是众所周知和常规实用的。例如，可以使用在实施例中描述的方法来测定结合亲和性或交叉阻断。利用Biacore机器的竞争结合分析法也是适合的，该分析法使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种适合的分析法使用基于ELISA的途径，根据抗体与FGFR4的结合来测量抗体之间的竞争。对于结合分析法的综合性讨论，参见Harlow等(主编)，《抗体实验室指南》(Antibodies A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988)，第6章。一般来说，与mAb F90-10C5“竞争”或“交叉阻断”mAb F90-10C5的抗体，将mAb F90-10C5与FGFR4的结合阻止了50％至100％(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)。

用于生产抗体及其片段的材料和方法

本发明的抗体可以通过任何适合的方法获得，例如本文中所述并且在本技术领域中公知的免疫接种和细胞融合程序，和/或使用本文所述的FGFR4细胞外结构域表位筛选抗体或抗体片段的文库。本发明的单克隆抗体使用各种已知技术产生(参见例如Coligan等主编，《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology)，1：2.5.12.6.7(John Wiley & Sons 1991)；《单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的新领域》(Monoclonal Antibody，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses)，Plenum Press，Kennett，McKearn和Bechtol主编，(1980)；《抗体：实验室指南》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Harlow和Lane主编，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；以及Picksley等的“针对大肠杆菌中表达的蛋白的单克隆抗体的生产”(Production of monoclonal antibody against proteins expressed in E.coli)，在《DNA克隆2：表达***》(DNA Cloning 2：Expression Systems)第二版中，Glover等主编，第93页(Oxford University Press 1995))。在一个实施方案中，本发明提供了能够生产抗体mAb F90-3B6、mAb F90-10C5或mAb F85-6C5的分离的细胞。典型地，单克隆抗体通过杂交瘤生产，并且本发明提供了生产本发明的单克隆抗体或抗体片段的杂交瘤。本发明提供了生产抗体F90-10C5、F85-6C5和F90-3B6的杂交瘤细胞系，并在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose ofPatent Procedure)(“布达佩斯条约”)的规定下将这些细胞系保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，Mascheroder Wep 1b.D-38124，德国，并分别指派保藏登记号DSM ACC2967、DSM ACC2966和DSM ACC2965。

同样，人类抗体通过多种技术中的任一种产生，所述技术包括但不限于人类外周血细胞(例如包含B淋巴细胞)的Epstein Barr病毒(EBV)转化、人类B细胞的体外免疫、来自携带***的人类免疫球蛋白基因的免疫过的转基因小鼠的脾细胞融合、从人类免疫球蛋白V区噬菌体文库分离，或本技术领域已知和基于本文公开内容的其他程序。用于从转基因动物获得人类抗体的方法进一步描述在例如下列文献中：Bruggemann等，Curr.Opin.Biotechnol.，8：455-58，1997；Jakobovits等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，764：525-35，1995；Green等，Nature Genet.，7：13-21，1994；Lonberg等，Nature，368：856-859，1994；Taylor等，Int.Immun.6：579-591，1994；以及美国专利No.5,877,397。

例如，人类抗体从已被工程化改造以对抗原激惹做出响应而生产特异性人类抗体的转基因动物获得。例如，国际专利公布No.WO 98/24893公开了具有人类Ig基因座的转基因动物，其中动物由于内源重链和轻链基因座的失活而不生产有功能的内源免疫球蛋白。也已经描述了能够对免疫原发动免疫应答的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中抗体具有灵长类恒定区和/或可变区，并且其中内源免疫球蛋白编码基因座被取代或失活。国际专利公布No.WO 96/30498公开了使用Cre/Lox***修改哺乳动物中的免疫球蛋白基因座，例如代替所有或一部分恒定或可变区以形成修改的抗体分子。国际专利公布No.WO 94/02602公开了具有失活的内源Ig基因座和有功能的人类Ig基因座的非人类哺乳动物宿主。美国专利No.5,939,598公开了制造转基因小鼠的方法，其中小鼠缺乏内源重链，并表达包含一个或多个异种恒定区的外源免疫球蛋白基因座。使用转基因动物例如本文描述的转基因动物，可以产生针对选定的抗原性分子的免疫应答，并可以从动物取出抗体生产细胞，并将其用于生产分泌人类来源的单克隆抗体的杂交瘤。免疫接种的方案、佐剂等在本技术领域中是已知的，并用在例如国际专利公布No.WO 96/33735中所述的转基因小鼠的免疫接种中。可以测试单克隆抗体抑制或中和相应蛋白的生物活性或生理效应的能力。

本发明提供了用于产生本发明的抗FGFR4抗体及其片段的材料。例如，本发明提供了生产本发明的抗体或抗体片段的分离的细胞(例如杂交瘤)，例如在本文中进一步描述的杂交瘤细胞系F90-10C5、F85-6C5和F90-3B6。本发明还涉及编码本发明的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。在本发明的一个方面，分离的多核苷酸包含编码抗体重链可变区(V_H)和/或抗体轻链可变区(V_L)的核苷酸序列，其中V_H和V_L包含与单克隆抗体F90-10C5的互补决定区(CDR)相同的CDR。

在相关实施方案中，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的载体(例如表达载体)，以指导多核苷酸在适合的宿主细胞中表达。使用重组技术，这样的载体可用于例如在宿主细胞中扩增多核苷酸以产生有用量的多核苷酸，并可用于表达肽，例如抗体或抗体片段。在优选实施方案中，载体是表达载体，其中本发明的多核苷酸与包含表达控制序列的多核苷酸可操作连接。特别考虑到合并了本发明的多核苷酸的自主复制重组表达构建物，例如质粒和病毒DNA载体。表达控制DNA序列包括启动子、增强子和操纵基因，并且一般根据将使用表达构建物的表达***来选择。优选的启动子和增强子序列一般根据增加基因表达的能力来选择，而操纵基因序列一般根据调节基因表达的能力来选择。本发明的表达构建物也可以包括编码一个或多个选择性标志物的序列，其允许鉴定带有构建物的宿主细胞。表达构建物也可以包括便于并优选促进宿主细胞中的同源重组的序列。本发明的优选表达构建物还包括在宿主细胞中复制所需的序列。

示例性表达控制序列包括启动子/增强子序列，例如巨细胞病毒启动子/增强子(Lehner等，J.Clin.Microbiol.，29：2494-2502，1991；Boshart等，Cell，41：521-530，1985)、Rous肉瘤病毒启动子启动子(Davis等，Hum.Gene Ther.，4：151，1993)、Tie启动子(Korhonen等，Blood，86(5)：1828-1835，1995)、猿猴病毒40启动子、DRA(在腺瘤中下调；Alrefai等，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.，293：G923-G934，2007)、MCT1(单羧酸转运蛋白1；Cuff等，Am.J.Physiol.Gastrointet.Liver Physiol.，G977-G979.2005)以及Math1(小鼠atonal类似物1；Shroyer等Gastroenterology，132：2477-2478，2007)，用于在靶哺乳动物细胞中表达，所述启动子可操作连接到多肽编码序列的上游(即5’)(所引用参考文献的公开内容，在此以其全文以及特别是关于表达控制序列的讨论方面引为参考)。在另一种变化形式中，启动子是上皮特异性启动子或内皮特异性启动子。本发明的多核苷酸还可以任选包括可操作连接在多肽编码序列的下游(即3’)的适合的聚腺苷化序列(例如SV40或人类生长激素基因聚腺苷化序列)。

如果需要，本发明的多核苷酸还任选包含编码与多肽序列同框(in frame)融合的分泌信号肽的核苷酸序列。分泌信号肽指导表达多核苷酸的细胞分泌本发明的多肽，并被细胞从分泌的多肽上切下。多核苷酸还可以任选包含其唯一目标功能是便于载体在例如细菌中大规模生产的序列，例如细菌复制原点和编码选择性标志物的序列。但是，如果将载体给药于动物，这样的外源序列优选被至少部分切开。人们可以使用在其它转基因文献中已经描述的程序制造和给药多核苷酸，用于基因治疗。参见，例如Isner等，Circulation，91：2687-2692，1995；以及Isner等，Human Gene Therapy，7：989-1011，1996；在此引为参考。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸还包含其他序列，以便于被宿主细胞的摄入和抗体或其片段(和/或任何其他肽)的表达。在一个实施方案中，使用了编码本文所述的抗体或其片段的“裸露”转基因(即不具有病毒、脂质体或其他促进转染的载体的转基因)。

载体也可用于“基因疗法”治疗方案，其中例如将编码抗体或其片段的多核苷酸以引起对象中的细胞体内表达抗体或其片段的形式导入患有侵袭性癌症或具有患侵袭性癌症风险的对象中。可以使用任何适合的载体将编码抗体或其片段的多核苷酸导入宿主。在文献中已经描述的示例性载体包括复制缺陷型反转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体(Kim等，J.Virol.，72(1)：811-816，1998；Kingsman & Johnson，Scrip Magazine，October，1998，pp.43-46)、细小病毒载体例如腺相关病毒(AAV)载体(美国专利No.5,474,9351、5,139,941、5,622,856、5,658,776、5,773,289、5,789,390、5,834,441、5,863,541、5,851,521、5,252,479，Gnatenko等，J.Invest.Med.，45：87-98，1997)、腺病毒(AV)载体(美国专利No.5,792,453、5,824,544、5,707,618、5,693,509、5,670,488、5,585,362，Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584，1992；Stratford Perricaudet等，J.Clin.Invest.，90：626-630，1992；和Rosenfeld等，Cell，68：143-155，1992)、腺病毒腺相关病毒嵌合体(美国专利No.5,856,152)或痘苗病毒或疱疹病毒载体(美国专利No.5,879,934、5,849,571、5,830,727、5,661,033、5,328,688)、Lipofectin介导的基因转移(BRL)、脂质体载体(美国专利No.5,631,237)，及其组合。所有前述文献在此以其全文以及特别是关于它们对表达载体的讨论方面引为参考。这些表达载体的任一种可以使用标准的重组DNA技术来制备，所述技术描述在例如Sambrook等《分子克隆，实验室指南》(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，和Ausubel等《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons，New York，N.Y.(1994)中。任选地，通过例如缺失或破坏选定的病毒复制所需基因，使病毒载体成为复制缺陷型。

其他考虑到的非病毒递送机制包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973；Chen和Okayama，Mol.Cell Biol.，7：2745-2752，1987；Rippe等，Mol.Cell Biol.，10：689-695，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.CellBiol.，5：1188-1190，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6：716-718，1986；Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：7161-7165，1984)、直接微注射(Harland和Weintraub，J.Cell Biol.，101：1094-1099，1985)、装载DNA的脂质体(Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979；Felgner，Sci Am.，276(6)：102-6，1997；Felgner，Hum Gene Ther.，7(15)：1791-3，1996)、细胞超声处理(Fechheimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987)、使用高速微粒的基因轰击(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，87：9568-9572，1990)以及受体介导的转染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，1987；Wu和Wu，Biochemistry，27：887-892，1988；Wu和Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12：159-167，1993)。

可以将表达载体(或本文讨论的抗体或其片段)截留在脂质体中。脂质体是囊泡状结构，其特征为磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。它们在将磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂质成分在形成闭合结构之前经历自身重排，并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh和Bachhawat，在Wu G，Wu C主编的《肝脏疾病，使用特异性受体和配体的定向诊断和治疗》(Liver diseases，targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands)中，New York：Marcel Dekker，pp.87-104(1991))。向阳离子脂质体添加DNA导致从脂质体向光学上双折射的液体-晶体凝聚球粒的拓扑学转变(Radler等，Science，275(5301)：810-814，1997)。这些DNA-脂质复合物是用于基因治疗和递送的潜在非病毒载体。

脂质体介导的核酸递送和外来DNA的体外表达已经成功。在本发明中，还考虑到了各种包含“脂转染”技术的商业化方法。在本发明的某些实施方案中，可以将脂质体与血凝病毒(HVJ)复合。这已经显示出利于与细胞膜融合并促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda等，Science，243：375-378，1989)。在其他实施方案中，将脂质体与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与其联合使用(Kato等，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991)。在其他实施方案中，将脂质体与HVJ和HMG-1两者复合或与其联合使用。这样的表达构建物已成功用于核酸的体外和体内转移和表达。在本发明的某些变化形式中，将FGFR4定向部分，例如FGFR4抗体或片段，包含在脂质体中，以将脂质体靶向在其表面上表达FGFR4的细胞(例如癌细胞)。

将裸露的DNA表达构建物转入细胞，可以使用粒子轰击来实现，所述粒子轰击依靠将DNA包被的微粒加速到高速的能力使微粒刺穿细胞膜并进入细胞，而不杀死这些细胞(Klein等，Nature，327：70-73，1987)。已经开发了几种用于加速小粒子的装置。一种这样的装置依靠高压放电产生电流，这进而提供运动力(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，87：9568-9572，1990)。所使用的微粒由生物惰性物质例如钨或金珠子构成。

在利用病毒载体的实施方案中，优选的多核苷酸仍包括上述适合的启动子和聚腺苷化序列。此外，很显然，在这些实施方案中，多核苷酸还包括与编码本发明多肽的序列可操作连接的载体多核苷酸序列(例如腺病毒多核苷酸序列)。

本发明还提供了包含多核苷酸或载体的细胞，例如用编码本发明抗体或其片段的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体转化或转染的细胞。在本发明的某些方面中，细胞表达抗FGFR4抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含的V_H和V_L含有与mAb F90-10C5相同的CDR。细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(Escherichia coli)(参见例如Pluckthun等，Methods Enzymol.，178：497-515，1989)，或真核宿主细胞例如动物细胞(例如骨髓瘤细胞、中华仓鼠卵巢细胞或杂交瘤细胞)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或植物细胞(例如烟草、玉米、大豆或水稻细胞)。预计使用哺乳动物宿主细胞能够提供这样的翻译修饰(例如糖基化、截短、脂化和磷酸化)，其对于赋予重组表达产物最适的生物活性可能是需要的。同样，本发明包含了糖基化或未糖基化的、和/或已进行共价修饰以包含一种或多种水溶性聚合物附着物例如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇的多肽。

本发明的多核苷酸可以作为环状质粒的一部分或作为包含分离的蛋白编码区或病毒载体的线状DNA导入到宿主细胞中。将DNA导入宿主细胞的方法在本技术领域中是众所周知和常规使用的，包括转化、转染、电穿孔、核注射或与载体例如脂质体、胶束、影细胞和原生质体融合。正如前面陈述的，这样的宿主细胞可用于扩增多核苷酸，也可用于表达由多核苷酸编码的本发明的多肽。宿主细胞可以被分离和/或纯化。宿主细胞也可以是体内转化的细胞，以引起体内多肽的瞬时或永久表达。宿主细胞也可以是离体转化的分离细胞，并在转化后导入以例如在体内产生用于治疗目的的多肽。宿主细胞的定义明确排除了转基因人类。

用于从多核苷酸产生抗体的具体方法一般是众所周知和常规使用的。例如，基本的分子生物学程序描述在Maniatis等《分子克隆，实验室指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989中(也参见Maniatis等，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)。此外，大量出版物描述了适合于通过DNA操作、表达载体的产生以及适当细胞的转化和培养来制备抗体的技术(参见例如Mountain和Adair，《生物技术和遗传工程回顾》(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews)第一章，Tombs主编，Intercept，Andover，UK，1992；以及《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel主编，Wiley Interscience，New York，1999)。

本发明还提供了包含FGFR4的67-93位氨基酸或FGFR4的67-93位氨基酸的子区域(或由其构成)的肽。在这方面，本发明提供了含有下列氨基酸序列(或由其构成)的肽：YKEGSRLAPAGRVRG(SEQ ID NO：5)；GSRLAPAGRVRGWRG(SEQ ID NO：6)；LAPAGRVRGWRGRLE(SEQ ID NO：7)；AGRVRGWRGRLEIAS(SEQ ID NO：8)或VRGWRGRLEIASFLP(SEQ ID NO：9)。本发明的肽可用于例如产生针对FGFR4的抗体和/或鉴定抗体的抗FGFR4活性。此外，本发明考虑到了使用肽作为免疫原，用于例如刺激免疫***对抗展示FGFR4的肿瘤细胞。在一个方面，本发明提供了由编码FGFR4的氨基酸序列的5-25个氨基酸构成的分离的抗原性肽，其中所述肽包含SEQ ID NO：5-9任一个中提出的氨基酸序列或其片段。本发明还提供了包含任何上述肽以及一种或多种赋形剂、佐剂、化疗药剂等的组合物。应该认识到，用于产生抗体或其片段的材料和方法也适用于本文描述的肽。例如，本发明提供了编码任何上述肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和包含所述多核苷酸(任选合并在载体中)的分离的细胞。

应该理解，本发明的多核苷酸、载体和细胞可用于体外和体内抑制癌细胞侵袭的方法中(例如在对象中治疗癌症的方法中)。

抑制癌细胞侵袭/治疗方法

所述抗体或抗体片段结合FGFR4并抑制癌细胞侵袭。当在本文中使用时，“癌细胞侵袭”是指癌细胞向内生长到周围组织或富含胶原蛋白或纤维蛋白的间质和临时基质中。在这方面，本发明还提供了调节癌细胞侵袭、向内生长或转移的方法，其中方法包含将癌细胞群体与其量能够有效调节癌细胞侵袭、向内生长或转移的本发明抗体或其片段(例如包含抗体或其片段的组合物)相接触。当癌细胞存在于哺乳动物对象中时，通过向哺乳动物对象给药包含本发明抗体或其片段的组合物，与癌细胞群体接触。在体内，癌细胞侵袭和转移是多方面的过程，其需要细胞外基质包括基底膜和富含胶原蛋白的间质基质的降解，以及活性细胞从原发肿瘤的迁移。所述抗体或其片段阻断与体内癌细胞侵袭相关的一个或多个过程，例如细胞外基质的降解。优选，所述抗体或其片段对细胞外基质(胶原蛋白和基底膜)的降解和细胞在三维组织环境中的迁移均有抑制(即下调或减缓)。

抗体抑制癌细胞侵袭的效力使用体外侵袭力分析来证实，并优选在癌症的动物模型中验证。在这方面，本发明提供了鉴定抗体或抗体片段的方法，其中方法包含(a)获得与FGFR4结合的一种或多种抗体或抗体片段；(b)在肿瘤细胞侵袭力分析中筛选抗体或抗体片段；以及(c)鉴定在分析中将侵袭力抑制例如至少50％的抗体。示例性的体外双室肿瘤细胞侵袭力分析法描述在实施例中。在某些变化形式中，在侵袭力分析中使用的细胞共表达FGFR4与其他受体，例如FGFR1。在某些变化形式中，目标受体被重组表达。在其他变化形式中，细胞从肿瘤(原发分离物)分离或来自于表达目标受体的肿瘤细胞系。

在示例性分析中，将表达FGFR4(例如FGFR4 R388蛋白)的癌细胞(例如MDA-MB-231细胞)施加到三维培养(例如胶原蛋白)凝胶。任选地，施加化学吸引剂例如FGF2(如果使用双室格式，施加到底部室)以激活细胞迁移。可以通过测量迁移到培养凝胶中的细胞数量或通过测量延伸到凝胶中的细胞臂的长度，来测定侵袭。与不存在抗体情况下的侵袭相比，由候选抗体介导的降低细胞侵入培养凝胶中，表明抗体或其片段抑制癌细胞侵袭。肿瘤细胞侵袭分析进一步描述在例如Puiffe等，Neoplasia，9(10)：820-829，2007；Alonso-Escolano等，J.Pharm.Exper.Ther.，318：373-380，2006；和Keese等，BioTechniques，33：842-850，2002中。提供了通过该方法鉴定的抗体或其片段。

应该认识到，抗体或其片段可以使用本技术领域已知的其他分析法、例如在实施例中描述的分析法来表征。例如，可以通过使用例如免疫沉淀和免疫印迹技术检测受体的磷酸化来检查FGFR4的活化。在某些方面中，本发明的抗体或其片段抑制或降低配体不依赖性或配体依赖性(例如成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导)的FGFR4磷酸化。类似的技术可用于检查抗体或其片段对细胞中FGFR4和MT1-MMP的共定位的效果。

此外，抗体或其片段在体内抑制癌细胞侵袭的能力，可以使用任何适合的动物模型来测定，例如骨侵袭模型(参见例如Kang，Cancer Cell，3：537-549，2003；和Pauli等，Cancer Research，40：4571-4580，1980)、膀胱癌侵袭的动物模型(Mohammed等，Mol.Cancer Ther.，2(2)：183-188，2003；和Kameyama等，Carcinogenesis.，14(8)：1531-1535，1993)、小鼠骨髓瘤转移模型(Lee等，Cancer Chemother.Pharmacol.，57(6)：761-71，2006)或利用改良的绒毛***的筛选分析法(参见例如Ossowski，J.Cell Biol.，107(6)：2437-2445，1988)。在人类患者中监测转移的方法是众所周知的，并包括例如进行组织活检检查以检测转移的细胞。

“抑制”、“阻断”或“阻碍”癌细胞侵袭不需要100％消除侵袭或转移。癌细胞侵袭的任何降低都在对象中构成了有益生物效应。在这方面，与不存在抗体或其片段的情况下(例如在未暴露于抗体或其片段的生物学匹配的对照对象、样品或细胞培养物中)观察到的癌细胞侵袭水平相比，抗体或其片段能够将细胞侵袭(例如3-D胶原蛋白肿瘤细胞侵袭力分析的MDA-MB-231细胞侵袭)抑制例如至少约5％(至少约10％、至少约20％或至少约25％)。在某些实施方案中，细胞侵袭被降低至少约50％，例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在体外或动物模型中或在包含重复的临床试验中，侵袭力的抑制可以使用标准的统计学分析来证实，以证实结果是统计学显著的(例如达到p＜0.05的显著性水平)。

此外，本发明提供了在对象(例如哺乳动物，例如人类)中治疗癌症的方法。方法包含向对象给药有效治疗癌症量的本发明的抗体或其片段。“治疗癌症”包括抑制或遏制以异常的细胞或组织生长或增殖为特征的疾病、特别是具有转移潜力的疾病的发生或发展。“治疗癌症”还包括阻碍在周围组织中侵袭性生长的发展，从而减缓癌细胞扩散到远处器官和继发肿瘤(转移肿瘤)的生长。“治疗癌症”还包括全面或部分减轻以过度增殖为特征的疾病。任何具有转移潜力或侵袭特点并表达FGFR4的癌症都适合本发明情形下的治疗。事实上，在某些实施方案中，方法包含向被诊断患有转移癌症的患者给药本发明的抗体或其片段。示例性癌症包括口腔和咽喉、消化***、呼吸***、骨和关节(例如骨转移肿瘤)、软组织、皮肤(例如黑素瘤)、乳腺、生殖***、泌尿***、眼和眼眶、脑和神经***(例如神经胶质瘤)或内分泌***(例如甲状腺)的癌症。在某些实施方案中，本发明方法的癌症是乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤、***癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、间皮瘤、肺癌、睾丸癌或胰腺癌。R388FGFR4突变体已经在源自于乳腺肿瘤、鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和子宫癌的细胞系中检测到(参见美国专利6,770,742)；因此，本发明的材料和方法特别适合于这些疾病的治疗。

本发明的方法在治疗癌症中的进展(例如阻碍癌细胞在周围组织中的侵袭)可以使用任何适合的方法来确定，例如本文中描述的以及目前在临床中用于追踪癌症进展的方法。如果需要，本发明方法的效力可以通过新肿瘤的检测、肿瘤抗原或标志物的检测、活组织检查、正电子发射断层(PET)扫描、存活、无疾病发展存活、到达疾病进展的时间、生命质量评估例如临床受益响应评估(Clinical Benefit Response Assessment)等来确定，所有这些都能指出人类中癌症的总体进展(或减退)。

在本发明的某些实施方案中，本发明的方法包含确定癌症中编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因的存在或不存在。取决于具体的实施方案，如果癌症具有至少一个编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因，则实施治疗。因此，在一个方面，本发明提供了治疗哺乳动物对象的方法，其中方法包含选择被诊断患有癌症或治疗过癌症的哺乳动物对象进行治疗，其中癌症包括含有至少一个编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因的细胞；以及向对象给药包含抗体或其片段(或编码所述抗体或其片段的核酸)的组合物，其量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

FGFR4 R388等位基因在生物样品中的存在或不存在，可以使用各种技术来确定。样品典型地从血液、血清、尿液或来自于例如肌肉、***、神经组织等的组织活检样品分离。一旦获得后，对来自于样品的细胞进行检查，以检测FGFR4 R388的存在或不存在。一种用于鉴定FGFR4 R388的方法包含从对象获取的生物样品(例如癌症样本或组织活检样品)上分析核酸(例如获得核酸序列数据)。从生物样品获得基因组DNA、RNA或cDNA，并任选地通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码FGFR4的核酸。然后对DNA、RNA或cDNA样品进行检查。FGFR4 R388的存在可以通过特异性针对R388等位基因的核酸探针的序列特异性杂交来确定。本技术领域的专业人员具有设计探针、使得只有当生物样品含有FGFR4 R388编码序列时才能发生序列特异性杂交的必需知识和技巧。供选地或此外，FGFR4 R388的存在或不存在通过对从对象获得的DNA或RNA进行直接测序来确定。

在一个方面，生物样品(例如细胞)中FGFR4 R388等位基因的存在或不存在，通过用差异结合FGFR4 R388和G388等位基因的抗体或抗体片段分析FGFR4蛋白来确定。术语“差异结合”是指抗体辨别R388和G388 FGFR4蛋白的能力。例如，差异结合FGFR4 R388的抗体或其片段结合该蛋白的亲和性高于它与FGFR4 G388结合的亲和性(例如亲和性高至少10、15、20、25、50或100倍)。用于检测FGFR4 R388蛋白的示例性方法包括但不限于免疫分析法例如免疫荧光免疫分析法、免疫沉淀法、放射免疫分析法、ELISA、Western印迹和荧光活化细胞分拣(FACS)。这些方法包含将生物样品与差异结合FGFR4 R388的抗体或其片段相接触，并检测与FGFR4 R388结合的抗体。

不基于抗体的抑制剂

本发明的某些变化形式包括使用针对FGFR4以及任选MT1-MMP的不基于抗体的抑制剂。基质金属蛋白酶(MMP)构成了在癌组织中负责细胞外基质降解的酶家族(Nagase等，J.Biol.Chem.，274：21491-21494，1999；Nelson et al.，J.Clin.Oncol.，18：1135-1149，2000)。MMP是锌依赖性多结构域内肽酶，其除了少数例外，均共有包含前肽、催化结构域、铰合结构域和C-端(血红素结合蛋白样)结构域的基本结构组织(Nagase等，同上；Massova等，FASEB J.，12：1075-1095，1998)。所有MMP以潜在形式(MMP前体)生产，其需要活化以获得催化活性，该活化过程通常通过蛋白水解除去前肽结构域来完成。

MT1-MMP(MMP-14)是多功能的酶，其降解各种细胞外基质成分，包括纤维状胶原蛋白和纤维蛋白(Pei等，J.Biol.Chem.，271：9135-9140，1996；d’Ortho等，FEBS Lett.，421：159-164，1998；Ohuchi等，J.Biol.Chem.，272：2446-2451，1997)。此外，MMP-2和MT1-MMP二者都与许多人类癌症中的转移潜力相关，并在实验***中增强肿瘤细胞侵袭。MT-MMP1在各种形式癌症的癌细胞和反应性基质细胞两者中经常上调，并且过表达MT1-MMP的癌细胞在裸鼠中的侵袭、增殖和转移的速率明显高于对照细胞。MT1-MMP的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：10中。

FGFR4或MT1-MMP抑制剂通过直接靶向FGFR4或MT1-MMP、即在蛋白质水平上靶向，靶向FGFR4或MT1-MMP的转录或翻译，或靶向实现FGFR4或MT1-MMP功能所需的下游分子来调节活性。在核酸水平上，抑制剂失活或破坏FGFR4或MT1-MMP编码序列。抑制也可以通过靶向基因组DNA或FGFR4 mRNA、FGFR4配体mRNA、MT1-MMP mRNA和/或下游靶编码序列的mRNA来阻断转录或翻译。在这方面，反义治疗是用于抑制表达的一种方法，在下文具体针对FGFR4和MT1-MMP进行了描述，并应该理解该描述同样适合于其他基因靶。

反义寡核苷酸通过与编码FGFR4(或MT1-MMP)的信使RNA(mRNA)杂交来负调控FGFR4(或MT1-MMP)表达。编码FGFR4 G388蛋白和FGFR4 R388蛋白的核酸序列是已知的，例如，如GenBank登记号X57205所报道的FGFR4 G388的核酸序列(SEQ ID NO：11)。FGFR4 R388的核酸序列提供在SEQ ID NO：12中。同样地，编码MT1-MMP的核酸序列在本技术领域中是已知的，例如，如GenBank登记号X90925所报道的(SEQ ID NO：13)。这些序列可用于利用本技术领域已知的任何方法制备和优化反义分子。在这方面，本发明包括使用与MT1-MMP(或FGFR4)基因组DNA或mRNA杂交并抑制MT1-MMP(或FGFR4)转录或翻译的抑制核酸。本文描述的所有类别的核酸抑制剂可以单独或与本文描述的其他抑制剂物值组合使用(参见下面关于组合疗法的部分)。

在一个方面，考虑到了在本发明的方法中使用长度为至少5至约50个核苷酸、包括其间的所有长度(以整数核苷酸计)的反义寡核苷酸，其与编码FGFR4或MT1-MMP的mRNA特异性杂交并抑制mRNA表达，并因此抑制FGFR4或MT1-MMP蛋白的表达。反义寡核苷酸包括含有修饰的核苷间连键的反义寡核苷酸和/或包含本技术领域已知能够提高寡核苷酸稳定性、即使寡核苷酸特别是在体内对核酸酶降解更有抗性的修饰核苷酸的反义寡核苷酸。在本技术领域中应该理解，尽管与靶多核苷酸中的区域完全互补的反义寡核苷酸具有最高程度的特异性抑制，但不完全互补的反义寡核苷酸，即对于靶多核苷酸中的区域来说包含有限数量的错配的反义寡核苷酸，也保留了高度杂交特异性，并因此抑制靶mRNA的表达。因此，本发明包括了使用与编码FGFR4或MT1-MMP的多核苷酸中的靶区域完全互补的反义寡核苷酸的方法，以及利用与靶多核苷酸中的靶区域不完全互补、即包含错配的反义寡核苷酸的方法，其中错配的程度不妨碍与靶多核苷酸中的靶区域的特异性杂交。反义化合物的制备和使用描述在美国专利No.6,277,981中，其公开内容在此以其全文引为参考。

本文中描述的用于抑制靶基因表达的另一类治疗剂是核酶。核酶抑制剂包括与靶多核苷酸特异性杂交的核苷酸区域以及消化靶多核苷酸的酶部分。核酶抑制的特异性与反义区的长度和反义区与靶多核苷酸中的靶区域的互补性程度相关。因此，本发明包括使用FGFR4或MT1-MMP的核酶抑制剂，其包含长度为5至约50个核苷酸、包括其间的所有核苷酸长度且完全互补的反义区，以及包含错配但错配程度不妨碍与靶FGFR4或MT1-MMP的编码多核苷酸中的靶区域特异性杂交的反义区。可用于本发明方法中的核酶包括含有修饰的核苷间连键的核酶和/或包含本技术领域已知能够提高寡核苷酸稳定性、即使寡核苷酸特别是在体内对核酸酶降解更有抗性的修饰核苷酸的核酶，所述修饰的程度不改变核酶与靶区域特异性杂交的能力或不消除分子的酶活性。因为核酶具有酶活性，单个分子就能指导多个靶分子的消化，从而提供了与非酶反义寡核苷酸相比在较低浓度下有效的优点。核酶技术的制备和使用描述在美国专利No.6,696,250、6,410,224和5,225,347中，其公开内容在此以其全文引为参考。

用于抑制本文描述的靶基因/途径的表达(以及进而活性)的另一类治疗剂是干扰RNA技术，也称为RNA干扰(RNAi)或短干扰RNA(siRNA)。使用靶基因序列例如FGFR4或MT1-MMP的知识，形成了干扰基因表达的siRNA分子。siRNA描述了通过直接导入双链RNA(dsRNA：正义和反义链两者的混合物)来诱导转录后基因沉默(PTGS)的技术(Fire等，Nature，391：806-811，1998)。当前的PTGS模型表明短段的干扰dsRNA(21-23个核苷酸；siRNA也被称为“指导RNA”)介导PTGS。siRNA显然由直接或通过转基因或病毒导入的dsRNA的切割产生。这些siRNA可以通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)扩增并掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，将复合物导向同源的内源mRNA，在那里复合物切开转录本。考虑到了RNAi可用于以组织特异性方式破坏基因表达。通过将编码所需dsRNA的基因片段置于诱导型或组织特异性启动子之后，应该能够使基因在生物体内特定位置处或在特定发育阶段中失活。

还考虑到了其中一条链与靶FGFR4或MT1-MMP的编码多核苷酸中的靶区域互补的双链RNA(dsRNA)。一般来说，这种类型的长度小于30个核苷酸的dsRNA分子在本技术领域中称为短干扰RNA(siRNA)。然而，本发明还包括使用长度长于30个核苷酸的dsRNA分子，并且在本发明的某些方面中，这些较长的dsRNA分子可以是长度约30个核苷酸直到长度200个核苷酸或更长，并包括其间所有长度的dsRNA分子。与其他RNA抑制剂相同，dsRNA分子中一条链的互补性可以是与靶多核苷酸中的靶区域完全匹配，或可以包含错配，其错配程度不妨碍与靶FGFR4或MT1-MMP的编码多核苷酸中的靶区域特异性杂交。与其他RNA抑制技术相同，dsRNA分子包括含有修饰的核苷间连键的dsRNA分子，和/或包含本技术领域已知能够提高寡核苷酸稳定性、即使寡核苷酸特别是在体内对核酸酶降解更有抗性的修饰核苷酸的dsRNA分子。靶向MT1-MMP的示例性慢病毒shRNA构建物包括来自于Open Biosystems(Huntsville，Alabama)的TRCN0000050854(GenBank登记号NM_004995)和TRCN0000050585 (GenBank登记号NM_006703)(目录号为目录RHS3979-9618053和RHS3979-9617784；进一步描述在Tatti等，Exp.Cell.Res.，314(13)：2501-14，2008中)。来自Qiagen(Hilden，德国)的HP验证的siRNASI03648841(SEQ ID NO：14)也有效下调MT1-MMP。示例性的靶向FGFR4的siRNA包括来自Qiagen(Hilden，德国)的HP验证的siRNA SI02659979(SEQ ID NO：15)、HP验证的siRNA SI02665306和HP GenomeWide siRNA SI00031360(SEQ ID NO：16)。RNAi化合物的制备和使用描述在美国专利申请No.20040023390中，其公开内容在此以其全文引为参考。

本发明还考虑到了使用RNA套索技术执行FGFR4或MT1-MMP的抑制的方法。环状RNA套索抑制剂是高度结构化的分子，其天然对降解有更高的抗性，因此一般不包含或需要修饰的核苷间连键或修饰的核苷酸。环状套索结构包括能够与靶多核苷酸中的靶区域杂交的区域，套索中的杂交区域具有用于其他RNA抑制技术的典型长度。与其他RNA抑制技术相同，套索中的杂交区域可以与靶多核苷酸中的靶区域完全匹配，或可以包含错配，其错配程度不妨碍与靶FGFR4或MT1-MMP编码多核苷酸中的靶区域特异性杂交。因为RNA套索是环状的并与靶区域形成紧密的拓扑学连接，因此这种类型的抑制剂与典型的反义寡核苷酸不同，一般不被解旋酶的作用而排除，因此其使用剂量可以低于典型的反义寡核苷酸。RNA套索的制备和使用描述在美国专利6,369,038中，其公开内容在此以其全文引为参考。

针对FGFR4或MT1-MMP的反义RNA和DNA分子、核酶、RNAi和三螺旋分子，可以通过本技术领域已知的用于合成DNA和RNA分子的任何方法来制备。这包括本技术领域公知的用于化学合成寡脱氧核糖核苷酸的技术，包括但不限于固相亚磷酰胺化学合成。供选地，RNA分子可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录来产生。这样的DNA序列可以合并到包含适合的RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子的多种多样的载体中。供选地，可以将取决于所使用的启动子来组成性或诱导性合成反义RNA的反义cDNA构建物稳定或临时导入到细胞中。

适配体(aptamer)是另一种基于核酸的方法，用于干扰FGFR4或MT1-MMP的相互作用是适配体的用途。适配体是从随机库中根据与其他分子结合的能力而选择的DNA或RNA分子。已经选择到了与核酸、蛋白质、小有机化合物或甚至完整生物体结合的适配体。用于鉴定和制造适配体的方法和组合物对于本技术领域的专业人员来说是已知的，并描述在例如美国专利No.5,840,867和美国专利No.5,582,981中，其每个在此引为参考。特别考虑到了结合FGFR4或MT1-MMP的适配体可用于本发明的治疗实施方案中。

组合科学领域的最新进展已鉴定到对于给定靶具有高亲和性和特异性的短聚合物序列。例如，SELEX技术已用于鉴定具有与哺乳动物抗体竞争的结合性质的DNA和RNA适配体，免疫学领域已产生和分离到与无数化合物结合的抗体或抗体片段，并且噬菌体展示已用于发现具有非常有利的结合性质的新的肽序列。在这些分子进化技术成功的基础上，必定能够产生与任何靶分子结合的分子。在提供所需的结合属性时，通常涉及环结构，就像在下述情况下：经常利用从没有互补碱基配对的短区域产生的发夹环的适配体，利用成环的高变区的组合排列的天然来源抗体，和利用环状肽的新的噬菌体展示文库，所述文库与线性肽噬菌体展示结果相比显示出改进的结果。因此，已产生足够的证据表明通过组合分子进化技术能够产生和鉴定高亲和性配体。对于本发明来说，可以使用分子进化技术分离对本文描述的配体特异的结合构建物。关于适配体的更多信息，一般参见Gold等，J.Biotechnol.，74：5-13，2000。用于产生适配体的相关技术可见于美国专利No.6,699,843，其在此以其全文引为参考。

在某些实施方案中，适配体可以如下产生：制备核酸文库；将核酸文库与靶例如FGFR4或MT1-MMP相接触，其中选择对靶具有较高结合亲和性(相对于其他文库核酸来说)的核酸并扩增，以产生富集了在结合靶的方面具有相对较高亲和性和特异性的核酸的核酸混合物。该过程可以重复，并将所选核酸进行突变和重新筛选，由此鉴定靶适配体。

其他抑制剂直接、即在蛋白质水平上靶向FGFR4或MT1-MMP。在这方面，考虑到了FGFR4或MT1-MMP的化学化合物抑制剂。小分子化合物(即分子量低于1000道尔顿、典型在300到700道尔顿之间的化合物)通常是优选的，因为尺寸减小使分子更易于被靶细胞摄取。FGFR4的合成抑制剂包括PD173074(Pfizer；Ezzat等，Clinical Cancer Res.，11：1336-1341，2005，以及Kwabi-Addo等，Endocrine-Related Cancer，11；709-724，2004)。能够阻断MT1-MMP活性的合成抑制剂包括Ro-28-2653，其描述在Maquoi等，Clin.Cancer Res.，15：4038-47(2004)中。合成的抑制剂进一步描述在Nisato等，Cancer Res.，65(20)：9377-9387，2005；和Galvez等，J.Biol.Chem.，276：37491-500，2001中。

其他抑制剂包括与FGFR4特异性结合以阻断或削弱人类FGFR4与一种或多种配体例如FGF2的结合的FGFR4结合剂。尽管这些试剂与受体结合，但它们不触发负责FGFR4活性的信号传导级联。供选地，可以使用可溶性FGFR4受体来螯合配体使其远离FGFR4。在这方面，可以将FGFR4的细胞外区域与增加血清半衰期的另一部分例如Fc抗体结构域融合以制造融合蛋白，或与PEG部分融合以产生可溶性FGFR4受体。

给药因素

在治疗癌症或体内调节癌细胞侵袭时，优选在确定对象具有癌症风险(例如检测到癌症标志物)后尽快、或在检测到癌症和/或周围组织侵袭后(例如肿瘤切除术后)尽快执行本发明的方法。为此，在检测到肿瘤侵袭之前给药抗体或其片段，以针对癌细胞侵袭、向内生长或转移进行完全或部分保护。也可以在肿瘤侵袭已经开始后给药抗体或其片段，以完全或部分阻止进一步侵袭或继发肿瘤的形成。在这方面，本发明提供了治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含(i)选择被诊断患有癌症或治疗过癌症的哺乳动物对象进行治疗；以及(ii)向对象给药本发明的抗体或其片段(例如配制在组合物中的本发明的抗体或其片段)，其量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

在优选实施方案中，将抗体或抗体片段(和/或本文描述的任何其他治疗剂)配制在组合物中，例如包含载质(即介质、佐剂或稀释剂)的生理可接受组合物。所使用的具体载体只受化学-物理因素例如溶解性和缺乏反应性以及给药途径的限制。生理可接受介质在本技术领域中是公知的。适合于注射使用的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散体，以及用于临场制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂(例如参见美国专利No.5,466,468)。注射制剂进一步描述在例如下列文献中：《制药学与配药实践》(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia.Pa.，Banker和Chalmers主编(1982)；以及《ASHP注射药物手册》(ASHP Handbook on Injectable Drugs)，Toissel，第四版(1986)。包含本文所述任何材料的药物组合物可以放置在容器中，并带有为这些药物组合物的使用提供说明书的包装材料。一般来说，这样的说明书包括有形的表现方式，其描述了试剂浓度，并且在某些实施方案中描述了为了复溶药物组合物而可能需要的赋形剂成分或稀释剂(例如水、盐水或PBS)的相对量。

用于具体对象的具体给药方案将部分取决于所使用的具体抗体、其他治疗剂的存在、给药量、给药途径、以及引起的任何副作用和程度。根据本发明，给药于对象(例如哺乳动物例如人类)的量应该足以在合理的时间框内实现所需响应。剂量大小也由给药途径、时间安排和频率决定。因此，临床医生可以滴定剂量并修改给药途径以获得最优疗效，并且常规的范围探查技术对本技术领域的普通专业人员来说是已知的。纯粹作为说明，取决于上面提到的因素，本发明的方法可以包含给药例如从约0.1μg/kg至高达约100mg/kg或以上。在其他实施方案中，剂量可以在1μg/kg直至约100mg/kg、或5μg/kg直至约100mg/kg、或10μg/kg直至约100mg/kg的范围内。由于癌症的过度增殖性质，单剂抗体或其片段可能不会实现完全的抗癌(抗侵袭)效应。事实上，与大部分慢性病相同，可以需要包含多剂治疗药剂的长期治疗。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包含在一段时间内递送多剂药物组合物。

给药生理可接受组合物、例如包含抗FGFR4抗体或其片段的药物组合物的适合方法，在本技术领域中是公知的。尽管可以使用一种以上的途径来给药药剂，但特定途径能够比其他途径提供更直接和更有效的反应。根据情况，包含药剂的药物组合物被施加或输注到体腔中、通过皮肤或黏膜吸收、摄入、吸入和/或导入到循环中。例如，在某些情况下，通过持续释放***或通过植入装置，通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、尿道、***或直肠方式注射，通过持续释放***或通过植入装置，来递送生理可接受(例如药物)组合物，将是理想的。如果需要，抗体或其片段通过供给目标区域的动脉内或静脉内给药进行区域性给药，例如通过肝动脉递送到肝脏。供选地，通过植入其上吸附或包裹有抗体的膜、海绵或其他适合材料，对组合物进行局部给药。当使用植入装置时，装置可以植入到任何适合的组织或器官中，并且抗体的递送可以通过扩散、定时释放丸或连续给药来进行。在其他方面，药剂在肿瘤切除术或其他外科程序期间直接给药于暴露的组织或通过定向注射(例如肿瘤内注射)给药。治疗递送手段对于专业技术人员来说是公知的，其中一些进一步描述在例如美国专利No.5,399,363中。

组合疗法

当适合时，药剂与其他物质(例如治疗物)和/或其他治疗形式组合施用，以实现附加(或增加)的生物效应。例如，在一个实施方案中，本发明的方法包含向对象给药两种或多种不同的抗FGFR4抗体(或其片段)。在这方面，当本发明的方法需要使用与mAb F90-10C5所识别的FGFR4表位结合的抗体时，方法可以进一步包含向对象给药(或将癌细胞群体接触)与FGFR4上同mAb F90-10C5所识别的表位不同的表位结合的抗体或其片段。示例性的第二种抗体及其片段包括(i)在实施例中描述的F85-6C5和F90-3B6(在本文中也分别称为“6C5”和“3B6”)，(ii)同F85-6C5和/或F90-3B6竞争与FGFR4的结合的抗体或其片段，以及(iii)与FGFR4中被F85-6C5和/或F90-3B6所识别的区域结合的抗体或其片段。令人吃惊的是，将癌细胞暴露于mAb F90-10C5与F85-6C5或F90-3B6的组合，与单独使用mAb F90-10C5的治疗相比，导致细胞中总MT1-MMP蛋白和活化的MT1-MMP蛋白的更大减少。使用两种或多种识别不同FGFR4表位(特别是不同的细胞外表位)的抗FGFR4抗体的组合治疗，能够增加mAb F90-10C5的抑制效应。

供选地(或此外)，向对象递送多种抗体以获得多种生物效应。在一个方面，本发明提供了治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含向被诊断患有癌症或治疗过癌症的对象给药第一和第二种抗FGFR4抗体或其FGFR4结合片段，其中第一种抗FGFR4抗体或片段抑制FGF2诱导的FGFR4 R388磷酸化，并且第二种抗FGFR4抗体或片段抑制配体不依赖性的FGFR4磷酸化。抗体或其片段可以配制在单一组合物中，或在同时或相继给药的分开的组合物中给药(即第一种组合物包含第一种抗体或片段，并且第二种组合物包含第二种抗体或片段)。本发明的方法还可能需要将抗FGFR4抗体与不基于抗体的FGFR4抑制剂、例如本文中进一步描述的抑制剂组合给药。例如，方法可以包含向对象给药标准医护的癌症化疗。

供选地或此外，本发明方法进一步包含向对象给药(或将癌细胞群体接触)MT1-MMP抑制剂。MT1-MMP的任何抑制剂都适合用于本发明的情形，并且不基于抗体的(例如小分子)MT1-MMP抑制剂如上文所述。在一个方面，抑制剂是与MT1-MMP结合以抑制酶活性(例如抑制细胞外基质降解)的抗体或其片段。在本技术领域中已知几种抗MT1-MMP抗体。例如，在Nisato等，Cancer Res.，65(20)：9377-9387，2005中进一步描述的抗体LEM-1和LEM-2，以剂量依赖性方式抑制三维胶原蛋白凝胶中细胞因子诱导的牛微血管内皮(BME)细胞侵袭。抗MT1-MMP抗体也描述在Galvez等，J.Biol.Chem.，276：37491-500，2001中。上面提供的关于FGFR4抗体的抗体及其片段的讨论也与抗MT1-MMP抗体相关。

已经鉴定了MT1-MMP的内源抑制剂，并考虑到将其使用在本发明的方法中。例如，一旦活化后，MMP被一组内源的结合到活性位点抑制催化的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)抑制(Nagase等，同上)。MT1-MMP被TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4抑制，但不被TIMP-1抑制(Will等，J.Biol.Chem.，271：17119-17123，1996；Bigg等，Cancer Res.，61：3610-3618，2001)。RECK(逆转诱导型具有Kazal基序的半胱氨酸丰富蛋白)，一种GPI锚定的糖蛋白，是MT1-MMP的另一种抑制剂(Oh等，Cell，107：789-800，2001)。含有突变RECK的小鼠在E10.5时是胚胎致死的，显示出胶原蛋白原纤维、基膜和血管发育的缺陷——一种可能与MMP活性过度相关的表型。软骨素/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、睾丸蛋白聚糖1、睾丸蛋白聚糖3、和睾丸蛋白聚糖3的剪接变体N-Tes，已显示出抑制MT1-MMP(Nakada等，Cancer Res.，61：8896-8902，2001)。

也考虑到了将血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)或血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的抑制剂与本发明的抗体、其片段、多肽或多核苷酸一起使用。本发明的方法可以包含给药抑制VEGFR-3或VEGFR-2的VEGF-D或VEGF-C刺激的药剂，例如与VEGF-C、VEGF-D、或VEGFR-3或VEGFR-2的细胞外结构域结合的抗体或抗体片段；包含VEGFR-3的细胞外结构域或其片段的有效结合VEGF-C或VEGF-D的可溶性蛋白；或包含VEGFR-2的细胞外结构域或其片段的有效结合VEGF-C或VEGF-D的可溶性蛋白。用于调节VEGFR-3和VEGFR-2活性的示例药剂和方法描述在例如美国专利7,034,105和6,824,777、美国专利公布No.2005/0282233和2006/0030000，以及国际专利公布No.WO 2005/087812(申请号PCT/US2005/007742)、WO 2005/087808(申请号PCT/US2005/007741)、WO 2002/060950(申请号PCT/US2002/001784)和WO 2000/021560(申请号PCT/US1999/023525)中。

在任何给定时间，医学从业人员具有一种或多种“标准医护”疗法，其对于例如特定癌症、发展阶段和患者类型被认为是适合的或优选的。作为另一种变化形式，本发明包括与本文描述的疗法相组合实施/使用标准医护疗法。

适合与本发明的方法联合使用的其他治疗/共同治疗包括，例如，放射治疗、高热治疗、外科切除、化疗、抗血管生成因子(例如可溶性生长因子受体(例如sflt)、生长因子拮抗剂(例如血管紧张素)等)、止痛药等。每种治疗因子根据适合于该药物的方案进行给药。这包括本发明的抗体或其片段和一种或多种其他适合药剂的同时给药(即基本上同时给药)和非同时给药(即在不同时间、以不论是否交叠的任何次序给药)。应该认识到，不同组分可以在同一个或分开的组合物中，并通过相同或不同的给药途径给药。在这方面，本发明的组合物可以包含与FGFR4上同mAb F90-10C5所识别的表位不同的表位结合的抗体或其片段，和/或MT1-MMP抑制剂。供选地或此外，本发明的抗体或其片段可以包含与其结合或连接的抗肿瘤药剂(例如放射性核苷酸)或细胞毒性药剂。关于放射性核苷酸-抗体结合物的进一步讨论，参见例如Appelbaum等，Blood，73(8)：2202，1989和美国专利No.6,743,411。

与本发明结合使用的化疗治疗使用了抗肿瘤药剂，包括但不限于烷基化药剂，包括：氮芥类，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基CCNU)；乙烯亚胺/甲基密胺，例如三亚乙基密胺(TEM)、三乙烯、硫代磷酰胺(塞替哌)和六甲基密胺(HMM，阿草特胺)；烷基磺酸酯例如白消安；三嗪类例如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物包括叶酸类似物例如氨甲蝶呤和三甲曲沙，嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶***糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、2，2′-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧助间型霉素(喷司他丁)、赤羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；天然产物包括抗有丝***药物例如紫杉醇，长春花生物碱类包括长春碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨、泰素帝、雌莫司汀和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素类例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素类例如放线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、依达比星、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素C和放线菌素；酶例如L-天冬酰胺酶；生物应答调节物例如α-干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；混杂的药剂包括铂配位络合物例如顺铂和卡铂、蒽醌类例如米托蒽醌、取代的脲例如羟基脲、甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼、肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(o，p′-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂例如强的松和等同物、***和氨鲁米特；孕酮例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；***例如己烯雌酚和炔雌醇等同物；抗***例如他莫昔芬；雄激素类包括丙酸***和氟羟***/等同物；抗雄激素类例如氟他胺、***释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾类抗雄激素例如氟他胺。

也考虑到了将有效抑制肿瘤转移的细胞因子用于组合疗法。这样的细胞因子、淋巴因子或其他造血因子包括但不限于M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNFα、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生成素。

实施例

参考下面的实施例，将更容易理解如此一般性描述的本发明，提供这些实施例是为了说明，而不打算限制本发明。

实施例1

本实施例使用对MT1-MMP活性的无偏功能获得激酶组筛选(unbiased gain of function kinome screen)，将FGFR4和其他激酶分子鉴定为肿瘤细胞侵袭的调节物。

为了鉴定调节肿瘤细胞侵袭的激酶分子，开发了使用明胶酶谱法对MT1-MMP活性的无偏功能获得激酶组筛选。因为MT1-MMP是最突出表达的MT-MMP并且是HT-1080细胞中的主要MMP-2活化剂(Lehti等，J.Biol.Chem.，27(10)：8440-48，2002)，因此MMP-2活化用作MT1-MMP活性的间接度量。将编码所有人类蛋白激酶的～93％的cDNA文库(564个cDNA，编码480个各种激酶)(Varjosalo等，Cell，133(3)：537-48，2008)用FuGENE6(Roche)瞬时转染到以1x10⁴个细胞/孔的密度铺于96孔板中的人类HT-1080纤维肉瘤细胞中。转染后，将细胞在完全培养基中温育24小时，并在无血清培养基中继续温育20小时。将调制过的培养基的等份试样溶解在非还原Laemmli样品缓冲液中，并使用含有1mg/ml明胶的不连续的3.5：10％聚丙烯酰胺凝胶，通过电泳进行分离。如Lohi等，Eur.J.Biochem.，239(2)：239-47，1996中所述除去SDS以使MMP重新折叠并自身活化。然后将凝胶在37℃下温育16小时，并用在10％乙酸、5％甲醇中的考马斯亮蓝进行染色。

通过明胶酶谱法使凝胶显色，从酶谱图对proMMP-2和proMMP-9的相对蛋白水平和活化水平进行定量。选择诱导proMMP-2相对水平最大的激酶亚组用于第二次筛选。因为MT1-MMP和MMP-9二者都是通常参与重塑过程(包括侵袭)的生物重要的MMP，因此这些MMP可能共有相同的调控途径。但是，只能作为酶原检测到的增加MMP-9相对水平的激酶，与增强MT1-MMP活性和MMP-2活化的激酶有很大差异。

在第二次MT1-MMP/MMP-2级联筛选中，22种激酶的表达促使pro-MMP-2活化与对照相比增加2倍以上(图1)。这些激酶包括新的MT1-MMP/MMP-2级联调节物和诱导MT1-MMP的已知刺激物下游的途径组分两类。在该后一类中包括TGF-β家族成员的受体和由IL-1或TNF-α激活的与炎性信号传导途径相关的激酶。未预料到的显著增加MMP-2活化的击中物(hits)包括受体酪氨酸激酶FGFR4和EphA2。

FGFR4显著增加MMP-2的活化，其是MT1-MMP活性的间接度量。该结果表明FGFR4的功能是作为肿瘤细胞侵袭的调节物。

实施例2

本实施例证明了FGFR4对MT1-MMP活性的调节发生在转录后。

因为在恶性肿瘤中与正常组织相比MT1-MMP基因表达经常上调，因此考查了所选激酶对MT1-MMP表达的可能贡献。将HT-1080细胞用编码FGFR4、EphA2或在TGFβ、IL-1和TNFα途径中最有力激酶的表达载体转染。通过定量实时PCR测定MT1-MMP mRNA的水平。IRAK1、MAP3K13、ACVRIC和EphA2适度但明显地增加MT1-MMP mRNA水平(1.5至2.5倍，n＝3，p＜0.005)。与体外数据一致，来自包含8478个恶性肿瘤样品的归一化表达数据的计算机模拟转录组学(In Silico Transcriptomics)(IST)数据库的关联性点，表明在来自几种类型癌症的组织样品中，在MT1-MMP表达与IRAK1、EphA2或ACVR1L之间存在显著的正相关性。有趣的是，属于MT1-MMP/MMP-2筛选中的最强击中物的FGFR4，在HT-1080细胞中对MT1-MMP mRNA水平的影响可忽略不计。同样，在来自不同类型肿瘤的组织样品中，在FGFR4与MT1-MMP表达水平之间只观察到弱相关性。这与这两个基因独立的转录调控相一致，并产生了FGFR4通过更直接的机制调控MT1-MMP的可能性。

为了评估激酶对MT1-MMP水平和亚细胞分布的转录后影响，将MT1-MMP与FGFR4、EphA2或IRAK1共表达在不表达可检测到的内源MT1-MMP的COS-1细胞中。使用抗MT1-MMP抗体对细胞进行免疫荧光染色。在观察后，在只用MT1-MMP转染的细胞中，MT1-MMP显得主要定位在细胞内核周区室中。有趣的是，共表达FGFR4导致加强了MT1-MMP在细胞质和细胞表面膜结构两者中的定位。这些变化与表达FGFR4的细胞中细胞伸展的增加相符，在EphA2转染的细胞中也观察到这种现象。IRAK增加细胞表面上MT1-MMP染色的强度。催化性激酶活性对于MT1-MMP调节是必需的，因为在表达在活性位点基序中具有失活性点突变的突变型激酶的细胞中，MT1-MMP主要仍位于核周(Varjosalo等，同上)。

还研究了被转染的细胞中MT1-MMP蛋白的量。将MDA-MB-231人类乳腺癌细胞用编码各种激酶的表达载体瞬时转染，并通过免疫印记评估MT1-MMP蛋白的表达。MT1-MMP蛋白的细胞表面水平通过Sulfo-NHS-生物素标记和使用抗MT1-MMP抗体的免疫沉淀来评估。FGFR4、IRAK1和EphA2都显著增加MT1-MMP的总水平和细胞表面水平，但是正如通过实时PCR所评估的，只有IRAK1略微增加MT1-MMP mRNA的表达。在表达IRAK1和FGFR4B的细胞中，检测到了活化的MT1-MMP和自身催化加工的43kDa形式两者，后者往往与高细胞表面MT1-MMP活性相关联(Lehti等，Biochem.J.，334：345-53，1998；Lehti等，J.Biol.Chem.，275：15006-13，2000)。相反，MT1-MMP水平不受大多数非功能性激酶的显著影响。

这些结果表明，有活性的FGFR4在转录后增加MT1-MMP蛋白水平并改变其分布。

实施例3

本实施例证明了FGFR4和MT1-MMP物理相互作用，并突出了FGFR4调控MT1-MMP的可能机制。

为了研究FGFR4调控MT1-MMP的可能机制，在用编码相应激酶的表达载体转染的MDA-MB-231细胞中进行了针对FGFR4或IRAK1和MT1-MMP的双重免疫荧光染色。将FGFR4转染的细胞在存在或不存在FGF2(25ng/ml)下温育30分钟，然后用抗MT1-MMP和FGFR4的免疫荧光抗体染色。将IRAK1转染的细胞在存在或不存在IL-1β(5ng/ml)下温育30分钟，并针对MT1-MMP和IRAK1进行免疫荧光染色。有趣的是，FGFR4大部分与MT1-MMP共定位在未处理细胞的液泡膜结构中，并且FGF2刺激进一步增强了这种共定位。在表达IRAK1的细胞中，在具有或没有IL-1β刺激的情况下，MT1-MMP主要定位在细胞表面上。与FGFR4不同，细胞质IRAK染色没有与MT1-MMP特异性共定位，尽管两种蛋白倾向于积累在细胞的相同区域中。

为了确定位于同样的膜小泡中的MT1-MMP和FGFR4是否在同样的膜受体复合物中物理相互作用，将细胞进行共转染以产生带HA标签的MT1-MMP和带V5标签的FGFR4。然后进行免疫沉淀和免疫印迹分析。对于免疫印记实验来说，将合生的细胞培养物清洗，并在无血清DMEM中温育24小时。在转染后转移到无血清培养基之前，将瞬时转染的细胞温育16小时。然后按照描述收获调制的培养基并制备细胞裂解物(Lehti等，1998，同上)。使用4-20％梯度Laemmli聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)进行SDS-PAGE。将蛋白转移到硝酸纤维素膜，并按照描述进行它们的免疫检测(Lohi等，Eur.J.Biochem.，239：239-47，1996)。免疫印记分析使用针对蛋白标签HA和V5的抗体进行。

通过用抗V5抗体进行免疫印迹，可以清楚地在已经用抗HA抗体免疫沉淀的MT1-MMP复合物中检测到FGFR4。同样，在用抗V5抗体免疫沉淀的FGFR4复合物中检测到带HA标签的MT1-MMP。FGFR4与MT1-MMP之间的相互作用是特异性的，因为在同样实验条件下没有检测到带V5标签的IRAK1与带HA标签的MT1-MMP之间的相互作用。

因为已报道FGFR4在胞吞作用后大部分被再循环，因此评估了FGFR4对MT1-MMP的内体定位的影响。使用针对内体标志物蛋白(网格蛋白和EEA1)的抗体进行的免疫荧光分析显示，MT1-MMP与FGFR4的相互作用与细胞内网格蛋白和EEA1阳性内体小泡中MT1-MMP水平的增加相符。相反，在表达IRAK1的细胞表面上检测到显著的MT1-MMP染色。这些结果与通过同FGFR4的相互作用可能增强被内吞的MT1-MMP的稳定性相符。

为了确定溶酶体降解对IRAK1和FGFR4调控MT1-MMP活性和蛋白表达的贡献，将表达这些激酶的MDA-MB-231细胞与溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A(Calbiochem)和蛋白体抑制剂MG132(MG-132，Z-Leu-Leu-CHO；Peptide Institute Inc.，Osaka，日本)温育。将MDA-MB-231细胞用空的pCR3.1表达载体(模拟物)和编码IRAK1或FGFR4的相应载体转染。将细胞用抗MT1-MMP和抗网格蛋白的抗体免疫染色，并通过共聚焦成像进行评估。将FGFR4转染的细胞用抗MT1-MMP和抗LAMP1抗体进行免疫染色。MG132对MT1-MMP水平的影响不明显。相反，通过巴弗洛霉素A抑制溶酶体降解在对照细胞中增加了MT1-MMP蛋白水平，这与报道过的MT1-MMP的快速和组成性溶酶体降解相一致。重要的是，FGFR4特异性增加未处理细胞中MT1-MMP的水平，从而减少了未处理的和巴弗洛霉素A处理的细胞之间MT1-MMP蛋白水平的差异。因此，在表达FGFR4的细胞中，与对照细胞相比，位于LAMP-1阳性溶酶体结构中的MT1-MMP显著减少。

本实施例的结果表明FGFR4抑制MT1-MMP的溶酶体分拣和降解，从而增加了活性MT1-MMP的细胞水平。FGFR4介导的MT1-MMP的增加，通过扩展，调节肿瘤细胞侵袭力。

实施例4

本实施例使用三维胶原蛋白侵袭分析法，即肿瘤细胞侵袭分析法，显示了激酶介导的MT1-MMP调控的功能重要性。

细胞外周胶原蛋白降解是已确定的MT1-MMP的主要生物功能。在三维胶原蛋白侵袭分析中确定了激酶介导的MT1-MMP活性的调节。将MDA-MB-231人类乳腺癌细胞用编码FGFR4、EPHA2和IRAK1或具有相应的失活激酶的表达载体转染。将细胞接种在I型胶原蛋白凝胶的顶部，并允许其侵袭5天。将凝胶在石蜡中固定并包埋。从苏木精和曙红染色的切片观察并计数侵入到胶原蛋白基质中的细胞。

每种活性激酶的过表达显著增加了未刺激的MDA-MB-231细胞原本相对慢的侵袭。IRAK1、FGFR4或EphA2的表达与模拟物转染的细胞相比，各导致侵袭速率增加4倍以上。正如所预期的，失活的激酶对细胞侵袭的影响可忽略不计。值得注意的是，只有FGFR4和EphA2显著增加侵袭超过20μm的细胞的数量(分别为12.1和9.8倍)。FGFR4使侵袭大于100μm的MDA-MB-231细胞的数量增加20倍。MT1-MMP和FGFR4共定位于快速侵袭细胞的前缘和细胞内小泡中两处。

除了研究细胞侵袭之外，还检查了基质降解。将转染的细胞接种在Alexa 488明胶包被的盖玻片上，并使其在GM6001(10μM)存在下附着和伸展三小时。在洗掉MMP抑制剂后，在完全培养基中进行20分钟细胞介导的明胶降解。将固定和通透化的细胞用抗MT1-MMP抗体免疫染色。通过共聚焦纤维术观察降解，并将其定量为低放大倍数图像中的降解面积与细胞数之间的比率(平均值±1SD，n＝3)。此外，将转染的细胞在交联的胶原蛋白基质上温育3小时，并针对MT1-MMP和FGFR4进行免疫染色。

与较高的胶原蛋白侵袭速率相一致，表达IRAK1、FGFR4和EphA2的细胞与对照细胞或用KD激酶转染的细胞相比，也能更有效地降解荧光明胶底物。有趣的是，FGFR4在细胞中的表达产生明显极化的细胞外周基质的蛋白水解灶，其与MT1-MMP簇共定位于细胞的一边。表达FGFR4的细胞也能在3小时内降解并横穿交联的胶原蛋白基质。相反，在细胞基质黏附处有效增加明胶降解和MT1-MMP水平的IRAK1，不能在同样的时间段内在交联的3-D胶原蛋白层中增加降解孔洞的数量。

这些结果显示了FGFR4在诱导高侵袭性癌细胞表型中的特定作用，其中MT1-MMP与细胞运动机制协调作用，以驱动在交联的3-D胶原蛋白中的侵袭。

实施例5

本实施例比较了两种FGFR4等位基因对MT1-MMP功能和细胞侵袭的影响，并确立了FGFR4作为抑制癌细胞侵袭的新靶。

FGFR4基因中的单核苷酸多态性已与患有几种类型的肿瘤例如乳腺、***和结肠腺癌以及头颈部鳞状细胞癌、黑素瘤和软组织肉瘤的患者预后差相关联。在相应的FGFR4变体中，跨膜结构域中的388位甘氨酸变成精氨酸(R388)。有趣的是，序列分析表明，包含在实施例1中所述的激酶组文库中的FGFR4 cDNA编码Arg388变体。为了比较G388 FGFR4等位基因和R388 FGFR4等位基因对MT1-MMP功能和细胞侵袭的影响，对激酶组文库的编码R388 FGFR的cDNA进行修饰，以编码野生型G388 FGFR4。将MDA-MB-231细胞用编码FGFR4等位基因(FGFR4G388-V5-His和FGFR4R388-V5-His)和相应的无功能激酶的表达载体、以及编码带HA标签的MT1-MMP的表达载体进行瞬时转染。将细胞与巴弗洛霉素A或GM6001温育16小时，并通过免疫印记评估MT1-MMP和FGFR4的水平。按照描述收获细胞培养基并制备细胞裂解物(Lehti等，1998，同上)。使用4-20％梯度Laemmli聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)进行SDS-PAGE。然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜，并按照描述进行它们的免疫检测(Lohi等，同上)。

在对照MDA-MB-231细胞中通过巴弗洛霉素A抑制溶酶体降解增加了MT1-MMP蛋白水平。FGFR4 R388变体的表达通过在未处理细胞中增加MT1-MMP的水平相对降低了这种效应。相反，MT1-MMP水平没有被FGFR4 G388的表达所显著增加。在表达FGFR4 G388的细胞中，巴弗洛霉素处理后MT1-MMP水平的增加与FGFR4的显著下调相偶联。在表达R388或任一种失活激酶的细胞中，这种效应不那么明显。一种合成的MMP抑制剂GM6001对MT1-MMP活性的抑制，与在不能通过免疫印记检测到的水平下正常表达FGFR4 G388的对照细胞中内源FGFR4的检测相关连。

在共转染实验中，也获得了FGFR4 G388和FGFR4 R388所介导的对MT1-MMP蛋白表达的对立效应的证据。FGFR4 Gly388表达与MT1-MMP蛋白水平降低相偶联，而FGFR4 Arg388变体增加了MT1-MMP的相对水平。FGFR4 Arg388主要与MT1-MMP共沉淀。然而，等位基因和失活的激酶突变体两者在MT1-MMP免疫沉淀物中都可以检测到。

同样使用与实施例4中描述的相似的方法，考查了两种FGFR4等位基因对细胞侵袭的影响。将编码G388等位基因的cDNA在MDA-MB-231细胞中稳定表达，所述细胞铺在1型胶原蛋白凝胶顶部。尽管表达FGFR4 R388的细胞与模拟物转染的细胞相比侵袭胶原蛋白的速率增加，但表达FGFR4 G388的细胞与模拟物转染的细胞相比，侵袭速率相同或甚至更慢。胶原蛋白侵袭被慢病毒MT1-MMP沉默RNA所消除，证实了在驱动侵袭方面MT1-MMP与FGFR4 R388之间的功能关联。

本实施例证明了FGFR4 Gly388和MT1-MMP通过依赖于相应的激酶和金属蛋白酶活性的机制相互下调。因此，Gly388和/或Arg388FGFR4变体是用于抑制肿瘤细胞侵袭的靶。

实施例6

本实施例的结果确立了FGFR4和MT1-MMP在体内侵袭性癌细胞中共表达，进一步支持了分子之间的功能关联。

MT1-MMP和FGFR4的mRNA经常在来自不同类型的人类癌症的样品中共表达。尽管在各个组织样品中的表达关联性不好，但在不同肿瘤类型包括结肠、睾丸、子宫和乳腺癌中MT1-MMP和FGFR4二者的平均表达水平经常上调。这些结果表明，当两种蛋白在体内表达在同样细胞中时，它们的相互作用在功能上对人类肿瘤的侵袭力有贡献。为了进一步考查MT1-MMP和FGFR4在不同肿瘤和基质细胞群体中的共定位，获得了包含40个恶性和正常乳腺组织样品的冷冻组织阵列，并用抗MT1-MMP和抗FGFR4抗体免疫染色。抗FGFR4抗体是沿用

已久的多克隆抗体，不与培养细胞中其他FGFR交叉反应。使用通过免疫MT1-MMP-/-小鼠而产生的单克隆抗MT1-MMP抗体(Ingvarsen等，Biol.Chem.，389：943-53，2008)。当在MDA-MB-231乳腺癌细胞的免疫荧光染色中测试时，抗MT1-MMP抗体容易检测到内源MT1-MMP，而在siRNA介导的MT1-MMP击倒(knock-down)后，染色被完全阻断。

观察到FGFR4主要定位于乳腺上皮和癌细胞中。在所分析的所有4例正常乳腺中，在导管上皮细胞中检测到了FGFR4，并且在导管癌细胞中相对水平经常增加(在20/36的病例中强染色)。在乳腺癌中的反应性基质中(28/36病例)，特别是在癌细胞附近的肌上皮中，MT1-MMP显著上调。这在癌的侵袭性和非侵袭性区域两者中都观察到了。重要的是，在位于肿瘤的侵袭前沿的癌细胞中和分化差的乳腺癌细胞中(10/36病例)特异性检测到MT1-MMP，在那里MT1-MMP主要与FGFR4共定位。多个冷冻组织阵列与来自14种不同肿瘤类型和相应的正常组织的样品的免疫组织化学显示，在大多数其他恶性组织中(10/14病例)MT1-MMP染色的相对水平也增加。在反应性基质中MT1-MMP经常上调(6/14病例)，并且在肿瘤细胞中与FGFR4共表达(8/14病例)。与乳腺癌相同，在其他类型的癌例如结肠腺癌中，MT1-MMP主要在侵袭前沿的肿瘤细胞中表达。

使用qPCR阵列与从48个人类乳腺癌cDNA样品获得的FGFR4序列相偶联，检测了FGFR4等位基因(FGFR4 G388和FGFR4 R388)和MT1-MMP的体内表达。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取RNA，然后用随机六聚体引物(Invitrogen)和Superscript II反转录酶(Life Technologies)进行反转录。mRNA表达按照描述(Tatti等，Exp.Cell Res.，314：2501-2514，2008)，使用TaqMan Universal PCR Master Mix和经验证的引物(MT1-MMP；Hs 01037006_gH，MT2-MMP；Hs 00233997_ml，MT3-MMP；Hs 00234676_m1，MT4-MMP；Hs 00211754m1，MT5-MMP；Hs 00198580m1，MT6-MMP；Hs 00360861_m1；MMP-9；Hs00957555_ml；FGFR1；Hs00915140_m1，FGFR4；Hs00242558_m1(Applied Biosystems))进行定量。将表达用TATA结合蛋白(TBP)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的表达进行归一化。含有Gly388到Arg388位点(1329-1331碱基对)的FGFR4 cDNA的片段通过PCR(引物：TACCAGTCTGCCTGGCTC(SEQ ID NO：17)和AGTACGTGCAGAGGCCTT(SEQ ID NO：18))进行扩增，并用BstN1(New England BioLabs)进行消化。通过特异性126碱基对片段来鉴定R388等位基因。通过两个片段(97和29碱基对)鉴定G388等位基因。

在48个人类乳腺癌cDNA样品中，22个具有纯合的FGFR4 G/G(46％)、22个具有杂合的G/R(46％)、4个具有纯合的R/R(8％)等位基因。与癌症患者中报道的预后差相一致，具有纯合R388等位基因的所有四个样品来自于最高级别(3)的乳腺癌。MT1-MMP mRNA在所有这些肿瘤中优势表达，同时伴有较低的FGFR4 R388表达。

在本实施例中描述的观察强烈表明，FGFR4与MT1-MMP对肿瘤侵袭力具有协同效应，并证实了FGFR4 R388等位基因与高侵袭性癌症强烈相关。

实施例7

本实施例说明了FGFR4 R388活化和FGFR4 G388抑制在***癌细胞的胶原蛋白侵袭中的功能重要性。

因为MT1-MMP和FGFR4最经常在人类***癌中共表达，因此评估了相应细胞系的内源MT1-MMP和FGFR4表达。PC3和DU145***腺癌细胞表达显著水平的FGFR1、MT1-MMP、和FGFR4的R388(PC3细胞)或G388(DU145细胞)变体。值得注意的是，只有表达纯合FGFR4 R388等位基因的PC3细胞有效地侵袭胶原蛋白凝胶，而相应的FGFR4 G388等位基因纯合的DU145细胞不能。FGFR4 siRNA抑制87％的PC3细胞侵袭，该侵袭也被TIMP-2介导的MT1-MMP抑制基本阻断。与所报道的通过FGFR1和FGFR4两者诱导增殖和运动性相一致(Sahadevan等，J.Pathol.，213：82-90，2007)，瞬时靶向这些FGFR任一种的siRNA降低了FGF2诱导的ERK磷酸化。然而，当FGFR1 mRNA表达被沉默时，胶原蛋白侵袭增加，表明FGFR1具有截然不同的功能。值得注意的是，尽管DU145细胞表达较少的MT1-MMP mRNA，但这些细胞在用FGFR4 R388转染后也侵袭胶原蛋白。

也考查了细胞生长。通过慢病毒shRNA稳定击倒MT1-MMP或FGFR4，不显著改变PC3或DU145细胞的正常单层生长。然而，当将细胞铺于由交联的I型胶原蛋白构成的限制生长的3-D基质之内时，MT1-MMP沉默显著降低PC3和DU145细胞生长和侵袭。同样，FGFR4 R388击倒抑制了PC3细胞的生长和侵袭，并降低MT1-MMP含量和成纤维细胞受体底物-2(FRS2)的磷酸化。相反，DU145细胞中FGFR4 G388的击倒，增加了那些细胞在胶原蛋白中的侵袭性质，与内源MT1-MMP水平增加相一致。在稳定的FGFR4 G388和MT1-MMP击倒的细胞中，FRS2和ERK的磷酸化也增加。PC3细胞中FRS2磷酸化的更强的抑制与ERK活化无关，表明有FGFR4活化之外的途径参与促有丝***FGF信号传导。

合在一起，上面描述的结果将FGFR4 R388鉴定为MT1-MMP驱动的PC3肿瘤细胞在3-D胶原蛋白中的侵袭和生长的新辅助因子，并表明G388和R388等位基因对MT1-MMP依赖性的侵袭具有相反效应。

实施例8

本实施例证实了FGFR4 R388诱导MT1-MMP磷酸化和内体稳定化，突出了FGFR4调控MT1-MMP的其他可能机制。

MT1-MMP胞质尾区含有单个酪氨酸残基，其可以被Src磷酸化(Nyalendo等，J.Biol.Chem.，282：15690-15699，2007)。为了确定FGFR4是否能够诱导MT1-MMP磷酸化，将FGFR4 G388和FGFR4 R388与带有HA标签的MT1-MMP共表达，然后进行MT1-MMP免疫沉淀。在共表达MT1-MMP与任一种FGFR4等位基因的COS1细胞中重复地检测到MT1-MMP的酪氨酸磷酸化，但是在表达具有无功能激酶结构域的FGFR4蛋白或仅仅MT1-MMP的细胞中则不能。FGFR4 R388和MT1-MMP主要共定位在细胞内小泡中。FGF2-处理增加了FGFR4 R388自身磷酸化，以及MT1-MMP的磷酸化和内体积累，表明活化的FGFR4 R388诱导了复合物中MT1-MMP的磷酸化。这种相互作用增加了被内吞的MT1-MMP的稳定性，正如通过与早期内体抗原-1(EEA1)和网格蛋白的共定位增加、以及与溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)的共定位减少所表明的。相反，MT1-MMP与细胞内小泡中弱/暂时活化的FGFR4 G388或激酶缺陷型KD蛋白的共定位的程度，明显低于使用FGFR4 R388所观察到的。

将MT1-MMP的唯一细胞内酪氨酸残基突变成苯丙氨酸(MT1-Y/F)，以评估MT1-MMP磷酸化的重要性。Y573F突变在表达极少量内源FGFR4的HT-1080细胞中显得不改变MT1-MMP活性。然而，突变废除了野生型MT1-MMP与内源FGFR4 R388在MDA-MB-231细胞的细胞-细胞接触和细胞内小泡中的共定位。MT1-Y/F主要定位在细胞表面，而FGFR4 R388移位到细胞内小泡中。与细胞表面MT1-MMP的增加相一致，突变增加了细胞在3-D胶原蛋白中的生长和侵袭。因此，在转染的MDA-MB-231细胞中，与FGFR4 R388/MTI-MMP复合物相比，观察到较少的FGFR4 R388/MT1-Y/F复合物。尽管FGFR4 R388水平略微降低，但FGFR4 G388蛋白和FGFR4 G388/MT1-Y/F复合物被充分抑制，使其在具有高MT1-Y/F含量的细胞中不能检测到。与MT1-MMP抑制后检测到增加的内源FGFR4 G388相一致，过表达的FGFR4 G388也被野生型MT1-MMP抑制，但不被其中蛋白酶活性被废除的突变体MT1-E/A抑制。

上面描述的观察表明，FGFR4被未磷酸化的MT1-MMP所抑制，为含有FGFR4 G388的细胞提供了维持促侵袭(proinvasive)MT1-MMP活性的反馈机制。尽管MT1-MMP不改变FGFR4 G388的磷酸化，但FGFR4 R388的磷酸化被MT1-MMP而不是无活性MT1-MMP突变体显著增加。因此，MT1-MMP/FGFR4 R388复合物的相互作用、磷酸化和运输，看来支持了它们在细胞侵袭中的协同功能。

实施例9

本实施例证实了内源FGFR4/MT1-MMP活性在体内控制肿瘤生长和侵袭。

为了确定靶向FGFR4/MT1-MMP轴是否调控体内肿瘤细胞的行为，在将PC3和DU145细胞皮下注射到SCID小鼠中后，分析了肿瘤生长、形态和细胞外基质(ECM)组成。将PC3和DU145细胞通过慢病毒用海肾萤光素酶-绿色荧光蛋白(GFP)融合报告蛋白转导。通过慢病毒转导然后通过嘌呤霉素(Sigma)筛选，产生了表达杂混的、靶向MT1-MMP和FGFR4的短发夹RNA的稳定的细胞合并物。通过qPCR证实击倒效率超过90％。将细胞(2x 10⁶)植入ICR-SCID雄性小鼠(5-7周龄；Taconic)的腹部皮下组织，并使其生长6-8周。使用卡尺和非侵入性生物发光法测量肿瘤尺寸，生物发光在腹膜内注射35μg/100μl腔肠素(coelentrazine)后使用Xenogen IVIS***(Xenogen)可视化。

MT1-MMP或FGFR4 R388的稳定沉默极大降低了PC3肿瘤的生长速度和含有渗入的肿瘤细胞的基质血管的数量。纤维状囊泡积累在肿瘤周围，并且肿瘤内细胞外基质(ECM)将MT1-MMP和FGFR4 R388击倒的肿瘤细胞分成小的区室，其显示出降低的增殖速度。肿瘤的有丝***指数、生长、侵袭和转移与胶原蛋白和其他ECM蛋白含量反相关。同时，细胞表现出朝向胶原蛋白IV、纤粘连蛋白和层粘连蛋白的极化增加，并且检测到腺泡腔形成的增加。

与体外分析的观察相一致，MT1-MMP沉默也降低DU145肿瘤的生长，同时增加胶原蛋白含量。在MT1-MMP击倒的DU145肿瘤中，FGFR4 G388 mRNA的表达增加2至4倍，表明转录反馈机制参与到MT1-MMP对FGFR4 G388的抑制中。相反，FGFR4 G388沉默产生DU145肿瘤细胞更明显的侵袭和外渗，同时减少肿瘤内部和肿瘤边缘处胶原蛋白的积累。通过qPCR没有检测到胶原蛋白mRNA表达的显著变化。

上面描述的结果证实，沉默MT1-MMP/FGFR4 R388复合物的任何组分均抑制肿瘤生长、侵袭和转移。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，但抑制似乎由阻断物理限制肿瘤扩散并促进内皮分化的ECM的蛋白水解降解所引起。沉默FGFR4 G388获得相反效应。

实施例10

本实施例提供了产生抗FGFR4单克隆抗体、例如本发明的抗体的示例方法。本实施例还提供了对于抗FGFR4抗体或其片段的结合亲和性进行表征的方法。

按照本技术领域的标准方法，构建了编码与His标签相连的FGFR4细胞外区域的杆状病毒表达载体。通过用编码FGFR4胞外结构域的重组载体和线性化BACULOGOLD^TM DNA(Pharmingen)共转染Sf9细胞，产生重组杆状病毒。用从Sf9细胞获得的病毒储用物感染High Five细胞，并使用镍柱纯化带His标签的重组FGFR4蛋白用于免疫接种。使用标准方法产生杂交瘤克隆，并根据需要进行亚克隆。使用重组FGFR4胞外结构域/Fc融合蛋白(R&D systems)，通过免疫印记法筛选腹水液或来自培养的杂交瘤细胞克隆的培养基。通过使用对照和FGFR4转染的COS-7细胞的裂解液的免疫印记，以及通过相应细胞的免疫荧光，对阳性克隆进行进一步评估。使用HiTrap蛋白G柱按照说明书(GE Life Sciences)进行单克隆抗体的纯化。对三种单克隆抗体F85-6C5、F90-3B6和F90-10C5进行功能阻断分析。

在酶联免疫吸附分析格式中使用受体结合分析法，比较了mAbs 3B6、6C5和10C5对FGFR4-Fc的亲和性(图2)。重组人类FGFR4-Fc，其包含通过多肽接头与人类IgG的羧基端区域(100-330位氨基酸)融合的FGFR4细胞外结构域(1-369位氨基酸残基，Partanen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：8913-8917，1990)，从R&D Systems获得(目录号685-FR)。将微量滴定板孔(ThermoElectron，目录号95029100)用pH 9.5的0.1M NaHCO3中的重组人类FGF2(R&D Systems，目录号233-FB)和肝素(Sigma-Aldrich，目录号H-3149)包被。清洗孔(100mM Tris，150mM NaCl，0.1％(v/v)吐温20，pH 7.5)，并将可用的非特异性蛋白结合位点用PBS，0.05％(v/v)吐温20，0.5％BSA阻断。第二次清洗孔。将FGFR4-Fc与每种mAb(3B6、6C5或10C5)在100mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20，1％BSA，0.1μg/ml肝素，pH 7.5中的连续稀释液预温育，然后与FGF2-肝素包被的孔竞争性结合。在加入预温育的FGFR4-Fc并进一步温育后，清洗FGF2包被的孔。使用山羊抗人类碱性磷酸酶结合物(Sigma-Aldrich。目录号A9544)检测结合的FGFR4-Fc。

如图2中所示，mAb 3B6、6C5和10C5阻断FGFR4-Fc与固定化FGF2结合的效力不同。使用低浓度阻断剂时观察到最大的FGFR4-FGF2相互作用，而在较高浓度下，相互作用(以吸光度单位度量)被抑制到背景吸光度水平。mAb 3B6和6C5阻断FGFR4与固定化FGF2结合的效力与可溶性FGF2或FGF1相近。此外，mAb 3B6和6C5的半最大抑制浓度(IC₅₀)与FGF2和FGF1接近(分别为1.077nM、0.3019nM、0.6914nM和0.7334nM)。与其他两种mAb相比，mAb 10C5阻断FGFR4-FGF2相互作用更弱，正如通过阻断曲线朝向阻断剂的更高浓度迁移和较高的半最大抑制浓度(6.217nM)所指示的。FGFR4与固定化FGF2的结合是特异性的，正如(在与可溶性FGF2或不与可溶性配体预温育后)从肝素包被的孔获得的非常低的吸光度水平所指示的。使用mAb而不预先加入FGFR4，提供了背景水平的吸光度值。因此，分析法特异性测量了FGFR4-FGF2结合的阻断。

在BIAcore分析法、即使用生物传感器的表面等离子体共振(BIAcore 2000

BIAcore AB)中，测量了mAb 3B6、6B5和10C5对固定化在生物传感器芯片上的FGFR4-Fc融合蛋白的差异结合。将FGFR4-Fc在pH 4.7的10mM乙酸钠缓冲液中稀释，并胺偶联到BIAcore传感器芯片。使用的固定化FGFR4-Fc的量，当用抗FGFR4单克隆抗体饱和时，产生1000响应单位的信号。使用未偶联的生物传感器芯片通道测量非特异性背景信号，将其从FGFR4-Fc偶联的通道获得的信号中减掉。将每种mAb的连续稀释液注射到生物传感器芯片上FGFR4-Fc上方，并以相对响应单位测量结合。每种mAb(3B6、6C5或10C5)以在PBS缓冲液中为10nM至240nM注射。流速维持在20μl/min，并使用5分钟的结合期。在mAb注射后，流动更换为PBS缓冲液，以确定解离速率。在循环之间，使用pH 2.2的10mM甘氨酸的30秒脉冲来再生传感器芯片。使用BIAcore评估软件3.1通过1∶1朗缪尔(Langmuir)拟合来分析动力学。为了比较，也通过对使用每种mAb的连续稀释液获得的最大相对响应单位作图，估算了Kd值。图4A-C在X-轴上显示了mAb浓度，在Y-轴上显示了获得的响应单位。在曲线拟合后，通过获得的最大和最小响应单位之间的浓度半值估算每种mAb的解离平衡常数(Kd)。根据这些Kd值，mAb 6C5与固定化的FGFR4-Fc的亲和性(Kd 1.8x10^-8M)明显高于mAb 3B6或mAb 10C5的亲和性，后两者的亲和性相近(Kd分别为2.17x 10^-7和1.33x 10^-7M)。

此外，鉴定了被F90-10C5识别的FGFR4表位。获得了由涵盖FGFR4细胞外结构域的氨基酸序列(不包括信号序列)的一系列肽构成的PepSpot阵列。肽的长度为15个氨基酸，并包含重叠3个氨基酸的序列。使用上述的单克抗FGFR4抗体进行免疫印记分析。mAb 6C5和3B6不识别线性表位，其中10C5检测下列肽：YKEGSRLAPAGRVRG(SEQ ID NO：5)；GSRLAPAGRVRGWRG(SEQ ID NO：6)；LAPAGRVRGWRGRLE(SEQ ID NO：7)；AGRVRGWRGRLEIAS(SEQ ID NO：8)；以及VRGWRGRLEIASFLP(SEQ ID NO：9)。包含SEQ ID NO：7的肽促发最强的信号。SEQ ID NO：5-9在FGFR4的细胞外区域中的位置图示在图3A-3C中。

生产抗体F90-10C5的杂交瘤10C5，在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)(“布达佩斯条约”)的规定下，于2008年9月2日转移到德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，Mascheroder Wep 1b.D-38124，德国，并于2008年9月4日被指派保藏登记号DSM ACC2967。生产mAb F85-6C5和F90-3B6的杂交瘤F85-6C5和F90-3B6，也在布达佩斯公约的规定下保藏于DSMZ，并于2008年9月4日被指派保藏登记号DSM ACC2966(F85-6C5)和DSM ACC2965(F90-3B6)。

实施例11

本实施例研究了FGFR4 G388和FGFR4 R388对胶原蛋白侵袭的贡献，并描述了使用单克隆抗FGFR4抗体抑制MT1-MMP介导的癌细胞侵袭。

鉴于两种FGFR4变体对MT1-MMP水平的不同影响，确定了它们对胶原蛋白侵袭的贡献。将MDA-MB-231细胞用编码FGFR4 G388或FGFR4 R388变体的表达载体转染。将一部分转染的细胞用10μg/ml对照IgG或单克隆抗FGFR4抗体3B6、6C5和10C5处理。在双室装置中将转染的细胞铺于3-D胶原蛋白上。使用FGF2(25ng/ml)作为化学吸引剂刺激侵袭。使细胞侵袭5天，然后对侵袭性灶进行定量。

表达FGFR4 R388的MDA-MB-231细胞与模拟物转染的或表达FGFR4 G388的细胞相比以更高的速率侵袭。通过使用针对MT1-MMP的慢病毒shRNA(Open Biosystems，Huntsville，AL)减少MT1-MMP mRNA(减少85％)，完全阻断了对照细胞、表达FGFR4 G388的细胞和表达FGFR4 R388的细胞的侵袭。这些结果进一步支持了鉴定到的FGFR4与MT1-MMP之间在癌细胞侵袭中的功能关联。

将与FGFR4竞争配体结合的单克隆抗体F85-6C5、F90-3B6和F90-10C5加入到双室胶原蛋白分析的上室和下室中。FGFR4 R388诱导的侵袭被10C5单克隆抗FGFR4抗体有效抑制(图5)。相反，3B6和6C5抗体倾向于增强表达FGFR4 G388和R388的细胞二者的侵袭(图5)。

为了阐明抑制细胞侵袭背后的可能机制，研究了在抗FGFR4抗体存在下的FGFR4活化。将血清饥饿的表达FGFR4 R388或FGFR4 G388(二者都带有V5标签)的MDA-MB-231细胞用F85-6C5、F90-3B6和F90-10C5抗体(10μg/ml)预处理过夜，并保持不刺激或与FGF2(10ng/ml)温育15分钟。将细胞提取物使用针对FGFR4的抗体进行免疫沉淀，然后使用针对V5、磷酸酪氨酸残基、FGFR1或ERK1/2的磷酸化形式的抗体进行免疫印记。免疫印记图示在图6中。另外，将COS-1细胞转染表达单独或组合的带V5标签的FGFR4 G388、带V5标签的FGFR4 R388和FGFR1。在血清饥饿后，将细胞用抗FGFR4抗体(10μg/ml)预处理30分钟。将一部分转染的细胞保持不刺激，而将其余部分与FGF2(10ng/ml)温育15分钟。将FGFR4蛋白免疫沉淀，并用抗磷酸酪氨酸和抗V5抗体进行免疫印记。免疫印记图示在图7中。

有趣的是，在存在或不存在配体刺激的情况下，FGFR4 G388都显著自身磷酸化，而FGFR4 R388变体的磷酸化在与FGF2温育后大量增加。用促进侵袭的F85-6C5抗体处理表达FGFR4 G388的细胞，(i)抑制了配体不依赖性FGFR4自身磷酸化，但是(ii)增强了FGF2诱导的磷酸化。F85-6C5抗体适度抑制FGFR4 R388的配体不依赖性自身磷酸化，但是配体刺激的磷酸化不受显著影响。值得注意的是，mAb 6C5处理的表达任一种FGFR4变体的细胞的磷酸化样式是类似的。用mAb F90-10C5处理表达FGFR4 R388的细胞降低了配体不依赖性和配体诱导的蛋白磷酸化。当细胞暴露于与mAb 10C5相比结合不同FGFR4表位的mAb 10C5和mAb 3B6两者时，磷酸化进一步降低(图6)。

因为MDA-MB-231细胞表达高水平的内源FGFR1，因此分析了FGFR4表达对总FGFR1水平和下游ERK途径活化的潜在影响。在对照和表达FGFR4 R388的细胞两者中，FGF2均略微增加ERK1/2的磷酸化，但是对FGFR1水平没有显著影响。相反，在表达FGFR4 G388的细胞中FGFR1水平显著降低，与FGF2诱导的ERK1/2磷酸化的抑制相符。有趣的是，用mAb 6C5而不是阻断侵袭的10C5抗体处理表达FGFR4 G388的细胞，在FGF2刺激后挽救了FGFR1水平和ERK活化两者。这与FGFR1和FGFR4之间的功能协作相一致，所述功能协作可能有助于肿瘤细胞侵袭并受调节侵袭的抗FGFR4抗体的影响。

使用不天然表达FGFR的转染的COS-1细胞验证了这些结果。在不存在配体刺激的情况下FGFR4 G388显著自身磷酸化，而R388变体的磷酸化在与FGF2温育15分钟后大量增加。用促进侵袭的mAb 6C5处理表达FGFR4 G388的细胞导致配体不依赖性FGFR4自身磷酸化的抑制，并增加了FGF2诱导的磷酸化。FGFR4 R388的适度配体不依赖性自身磷酸化也被mAb 6C5抑制，而配体刺激的磷酸化不受显著影响。抗体6C5在FGF2刺激后也降低FGFR4/FGFR1异源二聚化。值得注意的是，mAb 6C5处理的表达任一种FGFR4变体的细胞的磷酸化样式是类似的。与预测的功能性FGFR1/FGFR4相互作用相一致，这些受体的共表达导致FGFR4 G388和R388的配体不依赖性磷酸化的显著增加。其不受mAb 6C5的显著影响。mAb 6C5可以通过抑制组成性FGFR4自身磷酸化，并留下更多的FGFR4可用于与FGFR1的异型相互作用或配体诱导的同型FGFR4信号传导，来行使其对细胞侵袭的作用。用mAb 10C5处理导致对FGF2诱导的FGFR4 R388磷酸化和FGFR1下调的抑制(图7)。

本实施例确立了某些抗FGFR4抗体阻断表达MT1-MMP和FGFR4 R388二者的癌细胞的侵袭。

在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请在此引为参考，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指明引为参考。尽管出于清楚理解的目的，已经利用图示和实例对上述发明以一定的详细程度进行了描述，但对于本技术领域的普通专业人员来说，很显然可以根据本发明的教授对其做出某些改变和修改，而不背离所附的权利要求书的精神或范围。

Claims (95)

1.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，其中所述抗体或抗体片段抑制癌细胞侵袭。

2.一种分离的多肽，所述多肽包含与哺乳动物细胞表达的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽抑制癌细胞侵袭。

3.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与表达FGFR4 R388的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，其中所述抗体或抗体片段抑制细胞内成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR4磷酸化。

4.一种分离的多肽，所述多肽包含与表达FGFR4 R388的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽抑制细胞中成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR4磷酸化。

5.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与共表达FGFR4 R388和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，其中所述抗体或片段增加细胞内成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR1降解。

6.一种分离的多肽，所述多肽包含与共表达FGFR4 R388和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽增加细胞内成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导的FGFR1降解。

7.权利要求1、2、5或6任一项的抗体、抗体片段或多肽，其还抑制细胞中FGF2诱导的FGFR4磷酸化。

8.一种分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段与共表达FGFR4 R388和膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合，其中所述抗体或片段抑制细胞中FGFR4与MT1-MMP之间形成复合物。

9.一种分离的多肽，所述多肽包含与共表达FGFR4 R388和膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)的哺乳动物细胞上的成纤维细胞生长因子受体-4(FGFR4)的细胞外表位结合的抗体的片段，其中所述抗体和多肽抑制细胞中FGFR4与MT1-MMP之间形成复合物。

10.权利要求3-9任一项的抗体、抗体片段或多肽，其抑制癌细胞侵袭。

11.权利要求1-10任一项的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的FGFR4结合。

12.权利要求1-11任一项的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体与包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的FGFR4结合。

13.权利要求1-12任一项的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体与由选自SEQ ID NO：5-9的氨基酸序列构成的至少一个FGFR4肽结合。

14.权利要求13的抗体、抗体片段或多肽，其与由SEQ ID NO：7构成的FGFR4肽结合。

15.权利要求13的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段与SEQ ID NO：1或2的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO：1或2的79-81位氨基酸残基。

16.一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段与FGFR4的表位结合，所述表位被单克隆抗体F90-10C5(DSM ACC2967)结合。

17.权利要求2、4、6和9任一项的多肽，其中所述抗体是单克隆抗体F90-10C5(DSM ACC2967)。

18.权利要求1-17任一项的抗体片段或多肽，其中所述抗体片段是抗体的ScFv、Fv、Fab′、Fab、双抗体或F(ab′)₂抗原结合片段。

19.一种包含单克隆抗体F90-10C5(DSM ACC2967)的所有互补决定区(CDR)的分离的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽与哺乳动物细胞表达的FGFR4的细胞外表位结合。

20.权利要求19的抗体、抗体片段或多肽，其包含单克隆抗体F90-10C5(DSM ACC2967)的可变区。

21.权利要求1-20任一项的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段在肿瘤细胞侵袭力分析中抑制表达FGFR4 R388蛋白的MDA-MB-231细胞的侵袭。

22.权利要求21的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段使所述细胞侵袭降低至少25％。

23.权利要求21的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体或抗体片段使所述细胞侵袭降低至少50％。

24.权利要求20的抗体，其是单克隆抗体F90-10C5(DSM ACC2967)。

25.一种包含单克隆抗体F85-6C5(DSM ACC2966)的所有互补决定区(CDR)的分离的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽与哺乳动物细胞表达的FGFR4的细胞外表位结合。

26.权利要求25的抗体、抗体片段或多肽，其包含单克隆抗体F85-6C5(DSM ACC2966)的可变区。

27.权利要求26的抗体，其是单克隆抗体F85-6C5(DSM ACC2966)。

28.一种包含单克隆抗体F90-3B6(DSM ACC2965)的所有互补决定区(CDR)的分离的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽与哺乳动物细胞表达的FGFR4的细胞外表位结合。

29.权利要求28的抗体、抗体片段或多肽，其包含单克隆抗体F90-3B6(DSM ACC2965)的可变区。

30.权利要求29的抗体，其是单克隆抗体F90-3B6(DSM ACC2965)。

31.权利要求1、3、5、7、8、10-15和21-23任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

32.权利要求1、3、5、7、8、10-15、20-23、25、26、28、29和31任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体是人源化抗体、人类抗体或嵌合抗体。

33.一种人源化抗体，所述人源化抗体包含mAb F90-10C5、F85-6C5(DSM ACC2966)或F90-3B6(DSM ACC2965)的可变区或任一所述可变区与FGFR4结合的片段。

34.权利要求1-33任一项的抗体、抗体片段或多肽，其还包含与其结合或连接的抗肿瘤或细胞毒性药剂。

35.权利要求34的抗体、抗体片段或多肽，其中抗肿瘤药剂包含放射性核苷酸。

36.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或多肽以及生理可接受的载体。

37.权利要求36的组合物，其还包含标准医护抗癌治疗化合物。

38.权利要求36或37的组合物，其还包含抑制VEGF-D或VEGF-C刺激VEGFR-3或VEGFR-2的药剂。

39.权利要求38的组合物，其中药剂包含选自下列的成员：

与VEGF-C、VEGF-D结合、或与VEGFR-3或VEGFR-2的细胞外结构域结合的抗体或抗体片段；

包含VEGFR-3的细胞外结构域或其片段的与VEGF-C或VEGF-D有效结合的可溶性蛋白；以及

包含VEGFR-2的细胞外结构域或其片段的与VEGF-C或VEGF-D有效结合的可溶性蛋白。

40.权利要求36-38任一项的组合物，其中所述抗体、抗体片段或多肽是单克隆抗体或其片段(“第一种单克隆抗体或其片段”)。

41.权利要求40的组合物，其还包含第二种单克隆抗体或其片段，所述第二种单克隆抗体或其片段与FGFR4的第二个表位结合，所述第二个表位与第一种单克隆抗体或其片段所识别的表位不同。

42.权利要求41的组合物，其中第二种单克隆抗体或其片段是人类抗体或人源化抗体。

43.权利要求36-42任一项的组合物，其还包含膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)抑制剂。

44.权利要求43的组合物，其中MT1-MMP抑制剂是与MT1-MMP结合的抗体或其片段，或MT1-MMP的小分子抑制剂。

45.权利要求43的组合物，其中MT1-MMP抑制剂是与MT1-MMP基因组DNA或mRNA杂交并抑制MT1-MMP转录或翻译的抑制剂核酸。

46.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-33任一项的抗体、抗体片段或多肽的核苷酸序列。

47.一种载体，所述载体包含权利要求46的多核苷酸。

48.权利要求47的载体，其是表达载体。

49.权利要求48的载体，其是复制缺陷型病毒载体。

50.一种组合物，所述组合物包含权利要求49的载体和生理可接受的载体。

51.一种分离的细胞，所述细胞用权利要求46-49任一项的多核苷酸或载体转化或转染。

52.一种分离的细胞，所述细胞生产权利要求1-33任一项的抗体、抗体片段或多肽。

53.一种杂交瘤，所述杂交瘤生产权利要求24、27和30-32任一项的单克隆抗体或抗体片段。

54.一种调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移的方法，其中方法包含将癌细胞群体与其量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移的权利要求1-50任一项的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸、载体或组合物接触。

55.权利要求54的方法，其中癌细胞是在哺乳动物对象中，并且所述接触包含向哺乳动物对象给药所述组合物。

56.一种治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含：

选择诊断患有癌症或接受过癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗；以及

向对象给药权利要求36-45和50任一项的组合物，其量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

57.权利要求55或56的方法，其中(i)组合物包含权利要求13-17任一项的抗体、抗体片段或多肽，并且

其中方法还包含向哺乳动物对象给药抗体或其片段，所述抗体或其片段与FGFR4的第二个表位结合，所述第二个表位与所述组合物的抗体、抗体片段或多肽所识别的表位不同。

58.权利要求57的方法，其中与第二个表位结合的抗体或其片段是mAb F90-3B6或其片段。

59.权利要求55或56的方法，其中组合物是权利要求36-42任一项的组合物，并且其中所述方法还包含向哺乳动物对象给药含有膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)抑制剂的组合物。

60.权利要求59的方法，其中MT1-MMP抑制剂是与MT1-MMP结合的抗体或其片段，或MT1-MMP的小分子抑制剂。

61.权利要求55或56的方法，其中组合物是权利要求36-37和40-42任一项的组合物，并且其中所述方法还包含向哺乳动物对象给药含有抑制VEGF-D或VEGF-C刺激VEGR-3或VEGFR-2的药剂的组合物。

62.权利要求55-61任一项的方法，其中方法还包含向哺乳动物对象实施标准医护抗癌治疗。

63.一种在对象中治疗癌症的方法，其中方法包含向对象给药治疗癌症有效量的权利要求36-45和50任一项的组合物。

64.权利要求1-50任一项的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或组合物在哺乳动物对象中抑制癌细胞的侵袭、向内生长或转移中的应用。

65.权利要求64的应用，其与MT1-MMP抑制剂相组合或者与VEGF-C或VEGF-D结合至VEGFR-3或VEGFR-2的抑制剂相组合，用于在哺乳动物对象中抑制癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

66.权利要求64或65的应用，其中(i)组合物包含权利要求13-17任一项的抗体、抗体片段或多肽，与结合FGFR4的第二个表位的抗体或其片段组合使用，所述第二个表位与所述组合物的抗体、抗体片段或多肽所识别的表位不同。

67.权利要求54-66任一项的方法或应用，其中对象是人类。

68.权利要求54-67任一项的方法或应用，其中癌症选自乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤、***癌、间皮瘤、肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、子宫癌、结肠直肠癌和胰腺癌。

69.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码选自抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)的至少一个氨基酸序列的核苷酸序列，其中V_H和V_L包含与单克隆抗体F90-10C5(DSM ACC2967)的互补决定区(CDR)相同的CDR。

70.一种载体，所述载体包含权利要求69的多核苷酸。

71.一种细胞，所述细胞包含权利要求69的多核苷酸或权利要求70的载体，其中(a)所述细胞表达含有V_H和V_L的抗体或抗体片段，并且(b)所述抗体或抗体片段与FGFR4结合。

72.一种选择抗体或抗体片段的方法，其中方法包含：

(a)获得与FGFR4结合的一个或多个抗体或抗体片段；

(b)在肿瘤细胞侵袭力分析中筛选所述抗体或抗体片段；以及

(c)选择在所述分析中将侵袭力抑制至少50％的抗体。

73.权利要求72的方法，其中(b)包含在三维胶原蛋白侵袭分析中使用成纤维细胞生长因子-2作为化学吸引剂检测表达FGFR4的肿瘤细胞的侵袭。

74.一种分离的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段通过权利要求72或权利要求73的方法选择。

75.在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)以保藏登记号DSM ACC2967保藏的杂交瘤细胞系。

76.以DSMZ保藏登记号DSM ACC2966保藏的杂交瘤细胞系。

77.以DSMZ保藏登记号DSM ACC2965保藏的杂交瘤细胞系。

78.一种分离的细胞，所述细胞能够生产抗体mAb F90-3B6。

79.权利要求78的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤F90-3B6(DSMZ保藏登记号为DSM ACC2965)。

80.一种分离的细胞，所述细胞能够生产抗体mAb F90-10C5。

81.权利要求80的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤F90-10C5(DSMZ保藏登记号为DSM ACC2967)。

82.一种分离的细胞，所述细胞能够生产抗体mAb F85-6C5。

83.权利要求82的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤F85-6C5(DSMZ保藏登记号为DSM ACC2966)。

84.一种分离的抗原肽，所述肽由编码FGFR4的氨基酸序列的5-25个氨基酸构成，其中所述肽包含SEQ ID NO：5-9任一个所示的氨基酸序列或其片段。

85.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求84的抗原肽。

86.一种载体，所述载体包含权利要求85的多核苷酸。

87.一种分离的细胞，所述细胞包含权利要求86的载体。

88.一种组合物，所述组合物包含权利要求84的肽和佐剂。

89.权利要求56-63任一项的方法，其包含确定癌症中存在或不存在编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因的步骤，其中如果癌症具有至少一个编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因，则实施治疗。

90.一种治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含：

选择诊断患有癌症或接受过癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗，其中所述癌症包括含有至少一个编码FGFR4 R388的FGFR4等位基因的细胞；以及

向对象给药权利要求36-45和50任一项的组合物，给药量能够有效调节癌细胞的侵袭、向内生长或转移。

91.权利要求89或90的方法，其中FGFR4 R388等位基因的存在或不存在，通过使用差异结合FGFR4 R388和G388等位基因的抗体或抗体片段分析FGFR4蛋白来确定。

92.权利要求89或90的方法，其中FGFR4 R388等位基因的存在或不存在，通过分析来自对象或来自癌症的核酸来确定。

93.一种治疗哺乳动物对象的方法，所述方法包含：

选择诊断患有癌症或接受过癌症治疗的哺乳动物对象进行治疗；以及

向对象给药第一种抗FGFR4抗体或其FGFR4结合片段和第二种抗FGFR4抗体或其FGFR4结合片段，其中第一种抗FGFR4抗体或片段抑制FGF2诱导的FGFR4 R388磷酸化，并且其中第二种抗FGFR4抗体或片段抑制不依赖配体的FGFR4磷酸化。

94.权利要求93的方法，其中第一和第二种抗体或其片段作为包含第一种抗体或片段的第一种组合物和包含第二种抗体或片段的第二种组合物同时或相继地分别给药。

95.权利要求90-94任一项的方法，其还包含向对象实施标准医护癌症化疗。

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