一种丹参丹酚酸A的制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种丹参丹酚酸A的制备方法。
背景技术
丹参是经典的活血化瘀的中药药味,其具有活血化瘀作用的化学成分主要为水溶性成分,丹参水溶性成分多具有酚酸性结构,即丹酚酸A、B、C、D、E等有效成分,丹参总酚酸中以丹酚酸B含量最高,因此,人们开发的重点集中于丹酚酸B,但是,丹参水溶性成分活性最好的是丹参酚酸A(杜冠华【基础医学与临床,2000,20(5):10~14】、胡义扬【中药药理学报,1997,18(5):478-480】),可丹参丹酚酸A在丹参中含量很低,因为无法进行工业化生产而被人们忽略。本院申请的专利(申请号为200610145453.9、200710099618.8等)采用调pH值、高温反应的方法将丹参多酚酸或丹参丹酚酸B转化成丹酚酸A,该方法成功的将丹酚酸A的提取率从万分之五提高到千分之三左右(以丹酚酸A计),使丹酚酸A具有成药研究的基础。
丹酚酸A将成为创制新药,得率再次提高和得到质量均一的丹酚酸A是科研工作的重点之一。
发明内容
基于上述原因,本院的科研人员通过多次研究,继续优化工艺方法发现,调pH值、高温反应后的反应液,在一定温度下离心不会导致沉淀裹挟丹酚酸A,大孔树脂纯化后,省去离心步骤,保持溶液的乙醇浓度,同样防止沉淀裹挟丹酚酸A,再经聚酰胺纯化等步骤,省略有机溶剂萃取的步骤(降低生产成本,减少环境污染),得到丹酚酸A提取物,该提取物丹酚酸A含量大于96%,以丹酚酸A计得率大于千分之五,该方法在保证丹酚酸A纯度的基础上,得率再度提高,节省了大量资源,降低了生产成本。
将上述方法得到丹酚酸A提取物或现有技术得到的丹酚酸A提取物,经中压液相分离纯化,采用正相硅胶或反相硅胶,以二相溶剂为洗脱剂,采用等度或梯度洗脱方法,得到纯度大于98%的丹酚酸A,其中相关物质丹酚酸F和丹酚酸C含量均在0.5%范围内,多批次实验确定该方法得到的丹酚酸A纯度较高,杂质含量均一,属于质量稳定的产品。
本发明通过下述技术方案实现的。
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参水提取或乙醇提取,提取液浓缩或回收乙醇浓缩,调pH值3.5-6.0,105℃-140℃加热1-6小时,得到反应液,反应液在20℃-50℃时离心,经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离,其中所述大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8;先用水洗,弃去洗脱液,再用10-30%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用30-70%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为5%-50%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用30-70%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用70-95%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
一种丹酚酸A的制备方法,取上述实验方法得到丹酚酸A或现有技术制备方法得到的丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;
洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂二相,其中a溶剂为正己烷、石油醚、***、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮或丁酮,b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈,洗脱分离时b溶剂的体积百分比大于0小于等于50%;或者,a溶剂为正己烷、石油醚、***、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮或丁酮,b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈,a或b溶剂中加入其体积百分比为大于0小于等于10%的甲酸、乙酸或磷酸,洗脱分离时b溶剂体积百分比大于0小于等于50%;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A;
或者,洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈,洗脱分离时b溶剂的体积百分比大于0小于等于50%,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
一、检测方法
实验方法:
色谱柱:C18反相色谱柱,NUCLEODUR,250*4.6mm,ODS;
色谱条件与***适用性实验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流速1.0ml/min;柱温35℃;检测波长286nm;理论板数按丹酚酸A计应不低于60000;以乙腈-0.2%醋酸水溶液为流动相,按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱,运行90分钟;
0-15分钟时,乙腈的比例由10%升至20%,0.2%醋酸水溶液的比例由90%降至80%;15-55分钟时,乙腈的比例由20%升至30%,0.2%醋酸水溶液的比例由80%降至70%;55-65分钟时,乙腈的比例由30%升至50%,0.2%醋酸水溶液的比例由70%降至50%;65-72分钟时,乙腈的比例由50%升至80%,0.2%醋酸水溶液的比例由50%降至20%;72-77分钟时,乙腈的比例80%,0.2%醋酸水溶液的比例20%;77-80分钟时,乙腈的比例由80%降至10%,0.2%醋酸水溶液的比例由20%升至90%;80-90分钟时,保持乙腈-0.2%醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱;
对照品溶液的配制:精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中,加甲醇溶解摇匀,并稀释至刻度;
样品溶液的配制:取样品,加入甲醇溶解摇匀;或精密量取或称取制剂,加甲醇溶解摇匀,并稀释至刻度;
测定法:精密吸取对照品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图;精密吸取样品溶液,注入液相色谱仪,计算峰面积比。
上述方法测定本发明丹酚酸A提取物丹酚酸A含量大于96%。
上述方法测定本发明丹酚酸A纯度大于98%,相关物质丹酚酸F和丹酚酸C含量均在0.5%范围内。
二、不同方法得到丹酚酸A提取物得率实验
实验方案1:按照专利申请号为200610145453.9的实施例1得到丹酚酸A提取物;
实验方案2:按照本发明丹酚酸A提取物制备方法得到丹酚酸A提取物:,丹参水乙醇提取,提取液回收乙醇浓缩,调pH值4.0,120℃加热3小时,得到反应液,反应液在25℃时离心,经AB-8大孔树脂柱层析分离,先用水洗,弃去洗脱液,再用20%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用40%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为10%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用40%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用80%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实验方法:按照上述实验方案得到丹酚酸A提取物,按照上述检测分析方法计算丹酚酸A的得量,计算得率。
实验结果:见表1。
表1不同方法得率比较结果
注:上述实验是在实验方案2多次实验基础上进行的论证实验。
实验结论:上述比较实验表明,新的工艺方法得率比对比方法得率进一步提高,充分说明本发明方法具有科学意义。
三、不同方法得到的丹酚酸A质量比较
实验方案1:按照专利申请号为200610145453.9的实施例2得到丹酚酸A;
实验方案2:按照本发明丹酚酸A制备方法得到丹酚酸A:取本发明丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为乙酸乙酯,b溶剂为甲醇,b溶剂中加入其体积百分比为2.5%的甲酸,洗脱分离时b溶剂体积百分比2%-4%梯度洗脱,运行90分钟;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实验方法:按照上述实验方案得到丹酚酸A,按照上述检测分析方法得到丹酚酸A含量及丹酚酸C、丹酚酸F含量。
实验结果:见表2。
表2不同方法得到丹酚酸A含量比较
注:上述实验是在实验方案2多次实验基础上进行的论证实验;按照本发明丹酚酸A的制备方法进行多批次实验,丹酚酸A含量均保持在98%以上,相关物质丹酚酸F和丹酚酸C含量均不超过0.5%,说明本发明的制备方法得到质量更加均一的丹酚酸A。
制备实施例
实施例1
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参水提取,提取液浓缩,调pH值3.5,105℃加热6小时,得到反应液,反应液在20℃时离心,经HPD-100大孔树脂柱层析分离;先用水洗,弃去洗脱液,再用10%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用30%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为5%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用30%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用70%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例2
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参水提取,提取液浓缩,调pH值6.0,140℃加热1小时,得到反应液,反应液在50℃时离心,经HPD-100A大孔树脂柱层析分离;先用水洗,弃去洗脱液,再用30%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用70%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为50%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用70%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用95%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例3
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参水提取,提取液浓缩,调pH值4.5,120℃加热3小时,得到反应液,反应液在30℃时离心,经HPD-300大孔树脂柱层析分离,先用水洗,弃去洗脱液,再用20%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用50%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为10%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用40%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用75%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例4
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参乙醇提取,回收乙醇浓缩,调pH值5.5,130℃加热1.5小时,得到反应液,反应液在25℃时离心,经HPD-400大孔树脂柱层析分离;先用水洗,弃去洗脱液,再用25%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用65%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为45%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用65%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用90%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例5
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参乙醇提取,回收乙醇浓缩,调pH值5.0,135℃加热2小时,得到反应液,反应液在45℃时离心,经HPD-400A大孔树脂柱层析分离;先用水洗,弃去洗脱液,再用15%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用40%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为35%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用35%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用80%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例6
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参水提取,提取液浓缩,调pH值4.0,125℃加热3.5小时,得到反应液,反应液在50℃时离心,经D101大孔树脂柱层析分离,先用水洗,弃去洗脱液,再用15%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用45%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为25%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用40%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用75%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例7
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参水提取,提取液浓缩,调pH值5.0,135℃加热1小时,得到反应液,反应液在25℃时离心,经1300-I大孔树脂柱层析分离;先用水洗,弃去洗脱液,再用25%乙醇沈脱,弃去洗脱液,再用40%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为10%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用60%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用90%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例8
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参乙醇提取,提取液回收乙醇浓缩,调pH值4.5,130℃加热3小时,得到反应液,反应液在45℃时离心,经1400大孔树脂柱层析分离,先用水洗,弃去洗脱液,再用20%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用45%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为40%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用60%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用90%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例9
一种丹酚酸A提取物的制备方法,丹参乙醇提取,提取液回收乙醇浓缩,调pH值5.5,110℃加热5.5小时,反应液在35℃时离心,经AB-8大孔树脂柱层析分离;先用水洗,弃去洗脱液,再用20%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用45%浓度的乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩至乙醇浓度为40%;浓缩液用聚酰胺层析柱分离,先用35%乙醇溶液洗脱,弃去洗脱液,再用95%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液浓缩乙醇至尽,干燥,得到丹参丹酚酸A提取物。
实施例10
取本发明丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为正己烷,b溶剂为乙腈,洗脱分离时b溶剂的体积百分比3%;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例11
取现有技术得到丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为石油醚,b溶剂为甲醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比50%;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例12
取本发明丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为二氯甲烷,b溶剂为乙醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比1%-10%梯度洗脱,运行90分钟,得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例13
取现有技术丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为乙酸乙酯,b溶剂为甲醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比20%-40%梯度洗脱,运行90分钟;或得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例14
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为丙酮,b溶剂为乙腈,洗脱分离时b溶剂的体积百分比45%;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例15
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,a溶剂为三氯甲烷,b溶剂为甲醇,b溶剂中加入其体积百分比为0.5%的甲酸,洗脱分离时b溶剂体积百分比5%;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例16
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,a溶剂为***,b溶剂为甲醇,a中加入其体积百分比10%的乙酸,洗脱分离时b溶剂体积百分比45%;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例17
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,a溶剂为三氯甲烷,b溶剂为乙醇,b溶剂中加入其体积百分比为大于3%的甲酸,洗脱分离时b溶剂体积百分比1%-5%梯度洗脱,运行90分钟;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例18
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为丁酮,b溶剂为乙腈,a溶剂中加入其体积百分比为大于4%的磷酸,洗脱分离时b溶剂体积百分0.5%-2%梯度洗脱,运行90分钟;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A;
实施例19
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为正相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为二氯甲烷,b溶剂为甲醇,b溶剂中加入其体积百分比为2.5%的甲酸,洗脱分离时b溶剂体积百分比2%-4%梯度洗脱;得到洗脱液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例20
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为甲醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比0.5%,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例21
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为乙醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比50%,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例22
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为乙腈,洗脱分离时b溶剂的体积百分比30%,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例23
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为甲醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比2%-25%梯度洗脱,运行90分钟,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例24
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为乙腈,洗脱分离时b溶剂的体积百分比10%-45%梯度洗脱,运行90分钟,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例25
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为乙醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比30%-40%梯度洗脱,运行90分钟,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
实施例26
取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离;洗脱柱填充剂为反相硅胶,洗脱溶剂为二相,其中a溶剂为水,b溶剂为甲醇,洗脱分离时b溶剂的体积百分比5%-25%梯度洗脱,运行90分钟,收集洗脱溶液,浓缩,干燥,得到丹酚酸A。
注:本发明所要求保护的具体技术方案,不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。