CN105859803B - 一种没食子酰基葡萄糖的制备方法 - Google Patents

一种没食子酰基葡萄糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种没食子酰基葡萄糖的制备方法。本发明没食子酰基葡萄糖的制备方法包括粉碎、粗提、萃取、高速逆流色谱富集、纯化精制、收集和干燥等步骤。本发明没食子酰基葡萄糖的制备方法比传统柱色谱省时、经济、快速、高效，根据实际需要，既可以获得没食子酰基葡萄糖的化学组分，又能进一步纯化得到4‑6种没食子酰基葡萄糖的单体化合物。本方法为没食子酰基葡萄糖类化合物的大量制备提供了新的植物来源，同时为相关药品开发提供了实验依据。

Description

一种没食子酰基葡萄糖的制备方法
技术领域
本发明涉及天然产物分离技术领域，具体而言，涉及一种没食子酰基葡萄糖的制备方法。
背景技术
没食子酰基葡萄糖是一类可水解鞣质单体化合物，广泛存在于植物中，具有多方面的生物活性。其中五没食子酰基葡萄糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂等活性[李惠晨,胡伟,丁井永.五没食子酰基葡萄糖抗肿瘤的作用研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,(9):1672-4992.]，[1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-B-D-葡萄糖作为制备抗流感药物的用途](授权公告号CN101618043B)报道了五没食子酰基葡萄糖在抗流感方面的应用价值。发明专利[没食子有效部位在制备抗溃疡性结肠炎的药物的用途](授权公告号CN101862351B)报道了没食子有效部位在抗溃疡性结肠炎方面的应用价值，其中的活性成分包括1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，[没食子酰葡萄糖苷类衍生物的应用及用于治疗高尿酸血症的药物组合物](申请号CN104940216A)报道了该类化合物在治疗高尿酸血症方面的应用价值，另外，[多羟基没食子酰基-β-D-葡萄糖衍生物的新用途](授权公告号CN101209254B)还报道了该类化合物对幽门螺杆菌的防治作用，并指出1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖为最优选化合物。这些研究均提示没食子酰基葡萄糖类化合物可能成为一种具有巨大开发潜力的天然产物，因而积极寻找和开发新的该类化合物资源成为科学家们的重要研究方向。
该类化合物的化学结构复杂，溶解性较差，且含有多个酚羟基，常规柱色谱分离纯化会在固体介质表面产生很强的吸附作用，不仅造成回收率很低、纯度不高，而且分离工艺繁琐、实验周期漫长。有文献报道(Ren Yulin,et al.J Med Chem.2006,49(9):2829)，可通过化学合成的方法制备该类化合物，但由于工艺复杂、成本昂贵等缺点使其应用受到很大限制。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，所述的没食子酰基葡萄糖的制备方法艺简单、快捷，分离周期短，目标产物收率高、样品无损失、分离效果好，单体制备量大。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，利用高速逆流色谱从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖化学组分和单体化合物。
本发明没食子酰基葡萄糖的制备方法利用高速逆流色谱从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖化学组分和单体化合物；与硅胶，高效液相等色谱技术不同的是高速逆流色谱不需任何固态载体，因此能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。同时也具有适用范围广、操作简单、分离速度快、重现性好、样品进样量大、费用低等优点，可以有效地解决传统分离方法的缺陷。本发明方法分离条件温和，分离效率高，既能快速富集没食子酰基葡萄糖的化学组分，又能进一步同时精制不少于4个没食子酰基葡萄糖单体化合物，为新药研发和临床应用提供技术指导和物质基础。
优选地，上述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将粉碎后的胡桃属植物粉末加入醇的水溶液，回流提取，所得提取液过滤，减压浓缩至无醇味，得胡桃属植物提取物；
(2)将所述步骤(1)所得胡桃属植物提取物加水溶解，用溶剂萃取以除去脂溶性成分，减压浓缩将有机溶剂挥发完全，剩余水层溶液再经冷冻干燥，得胡桃属植物粗分离物；
(3)将所述步骤(2)所得胡桃属植物粗分离物用高速逆流色谱富集没食子酰基葡萄糖化学组分；溶剂***由烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成，溶剂***的上相为固定相，下相为流动相；
(4)将所述步骤(3)所得没食子酰基葡萄糖化学组分用高速逆流色谱进一步纯化精制，得到没食子酰基葡萄糖单体化合物；溶剂***由烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成，溶剂***的上相为固定相，下相为流动相。
本发明没食子酰基葡萄糖的制备方法利用高速逆流色谱从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖化学组分和单体化合物，工艺简单、快捷，分离周期短，大大缩短了分离时间。本发明方法目标产物收率高、样品无损失、分离效果好，依据实际需要，既可以从胡桃属植物中分离制备没食子酰基葡萄糖的化学组份，又可以进一步同时纯化精制不少于4个没食子酰基葡萄糖单体化合物。本发明方法单体制备量大；根据所需没食子酰基葡萄糖的质量，可以调节被分离样品的进样量，制备型高速逆流色谱仪一次性可以分离出几百毫克甚至克级的目标物。
优选地，所述的原植物为胡桃科胡桃属植物，优选包括核桃(Juglans regia L.)、核桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)、野核桃(Juglans cathayensis Dode)、麻核桃(Juglans hopeiensis Hu)和泡核桃(Juglans sigillata Dode)中的一种或多种。
本发明方法增加了大量制备没食子酰基葡萄糖的植物来源；据文献报道，没食子酰基葡萄糖类化合物通常存在于牡丹皮、芍药、五倍子、黄芩、芦荟、决明子、菊花、杜仲、大黄等植物中，本方法是首次以胡桃属植物为原料，用高速逆流色谱法大量生产该类化合物。
优选地，步骤(1)中所述醇的的水溶液中醇的体积分数为10％-90％，优选为50％-70％；所述胡桃属植物粉末与醇的水溶液的质量比为1:8-50，优选为1:8-10；回流时间为2-4h，优选为2-3小时。
采用特定醇浓度、用量比例和回流时间，有助于充分提取胡桃属植物中的没食子酰基葡萄糖类化合物。
优选地，步骤(1)中所述醇包括甲醇、乙醇或丙醇，进一步优选包括乙醇。
优选地，将步骤(1)所得滤渣重复步骤(1)回流提取、过滤步骤，合并所得滤液后，减压浓缩至无醇味，得到胡桃属植物提取物。
优选地，将步骤(1)所得滤渣重复1-3次步骤(1)回流提取、过滤步骤，进一步优选为重复2次，以提高原料利用率，充分提取胡桃属植物中的没食子酰基葡萄糖类化合物。
优选地，步骤(2)中所述溶剂包括石油醚或正己烷。
优选地，步骤(3)中所述溶剂***中各原料的体积比为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝(1-2)：(3-5)：(1-2)：(3-5)，优选为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝1：2：1：2；烷烃包括正己烷或环己烷，优选包括正己烷，脂肪酸酯包括乙酸乙酯或乙酸甲酯，优选包括乙酸乙酯，脂肪醇包括甲醇、乙醇或丙醇，优选包括甲醇或正丙醇。
采用特定的溶剂***成分和用量比例，有助于提升没食子酰基葡萄糖化学组分的富集效果，提高富集效率。
优选地，步骤(3)中主机转速为750～850rpm/min，优选为800rpm/min；流动相流速为1.5～3.0mL/min，优选为2.0mL/min。
采用特定的主机转速和流动相流速，能够保证没食子酰基葡萄糖化学组分的富集效果，并提高富集效率。
优选地，步骤(4)中所述溶剂***中各原料的体积比为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝(0.5-1.5)：(8-12)：(0.5-1.5)：(8-12)，优选为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝1：9：1：9；烷烃包括正己烷或环己烷，优选包括正己烷，脂肪酸酯包括乙酸乙酯或乙酸甲酯，优选包括乙酸乙酯，脂肪醇包括正丙醇、异丙醇或正丁醇，优选包括正丙醇。
采用特定的溶剂***成分和用量比例，有助于提升没食子酰基葡萄糖类物质的纯化精制效果，提高纯化精制效率，得到没食子酰基葡萄糖单体化合物。
优选地，步骤(4)中主机转速为750～850rpm/min，优选为800rpm/min；流动相流速为1.5～3.0mL/min，优选为2.5mL/min。
采用特定的主机转速和流动相流速，能够保证没食子酰基葡萄糖类物质的纯化精制效果，并提高纯化精制效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明没食子酰基葡萄糖的制备方法利用高速逆流色谱从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖化学组分和单体化合物，工艺简单、快捷，分离周期短，大大缩短了分离时间。本发明方法目标产物收率高、样品无损失、分离效果好，依据实际需要，既可以从胡桃属植物中分离制备没食子酰基葡萄糖的化学组份，又可以进一步同时纯化精制不少于4个没食子酰基葡萄糖单体化合物。本发明方法单体制备量大；根据所需没食子酰基葡萄糖的质量，可以调节被分离样品的进样量，制备型高速逆流色谱仪一次性可以分离出几百毫克甚至克级的目标物。本发明方法增加了大量制备没食子酰基葡萄糖的植物来源；据文献报道，没食子酰基葡萄糖类化合物通常存在于牡丹皮、芍药、五倍子、黄芩、芦荟、决明子、菊花、杜仲、大黄等植物中，本方法是首次以胡桃属植物为原料，用高速逆流色谱法大量生产该类化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1高速逆流色谱分离没食子酰基葡萄糖化学组分的色谱图；
图2为本发明实施例1没食子酰基葡萄糖化学组分的高效液相色谱图；
图3为本发明实施例1高速逆流色谱分离没食子酰基葡萄糖单体化合物的色谱图；
图4a-图4d为本发明实施例1所得4种没食子酰基葡萄糖化合物的高效液相色谱图；
图5为本发明实施例2高速逆流色谱分离没食子酰基葡萄糖化学组分的色谱图；
图6为本发明实施例2没食子酰基葡萄糖化学组分的高效液相色谱图；
图7为本发明实施例2高速逆流色谱分离没食子酰基葡萄糖单体化合物的色谱图；
图8a-图8d为本发明实施例2所得4种没食子酰基葡萄糖化合物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种快速、高效分离没食子酰基葡萄糖类化合物的方法，即应用高速逆流色谱法从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖的方法。该方法分离条件温和，分离效率高，既能快速富集没食子酰基葡萄糖的化学组分，又能进一步同时精制不少于4个没食子酰基葡萄糖单体化合物，为新药研发和临床应用提供技术指导和物质基础。
本发明提供了一种从胡桃属植物中大量制备没食子酰基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)制备胡桃属植物提取物：
取干燥的胡桃属植物(任何部位)，适当粉碎。称取物料粉末，加入8～50倍重量的体积分数为10～90％的乙醇溶液中，回流提取2～4h，滤过；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得胡桃属植物提取物。
(2)提取物的脱脂与干燥：
为不影响后续的冷冻干燥，将上述步骤制得的提取物加适量水混悬后，放入萃取容器中，同时加入等体积的石油醚，萃取3-5次以除去脂溶性成分，收集水层溶液，减压浓缩将有机溶剂挥发完全，得到脱脂后的胡桃属植物提取物，再经冷冻干燥，即得胡桃属植物粗分离物。
(3)高速逆流色谱法富集没食子酰基葡萄糖化学组分：
a.溶剂***和样品溶液的配制：
高速逆流色谱(HSCCC)的溶剂***由烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成，其中烷烃可选用正己烷或环己烷，脂肪酸酯可选用乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇可选用甲醇或乙醇，烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水的配比为(1-2)：(3-5)：(1-2)：(3-5)，充分振摇后在室温下静置过夜。使用前分别取上相作为HSCCC的固定相，下相作为HSCCC的流动相，超声脱气30min。取步骤(2)中的胡桃属植物粗分离物，用相同体积的上相和下相溶解样品，备用。
b.高速逆流色谱富集没食子酰基葡萄糖化学组分：
首先将溶剂***的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速750～850rpm/min，再以1.5～3.0mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入(3)a中的样品溶液。在280nm波长下检测，记录色谱图，收集紫外吸收最大的那个流份，将该流份减压浓缩除去有机溶剂后，再经冷冻干燥，即得没食子酰基葡萄糖化学组分。
c.没食子酰基葡萄糖化学组分的分析和鉴定
使用高效液相对(3)b中富集得到的没食子酰基葡萄糖化学组份进行分析和鉴定：应用安捷伦SB-C18色谱柱(Analytical HPLC Column 4.6×150mm,5μM)，乙腈-0.1％三氟乙酸水(v/v)为流动相梯度洗脱[1-3min:5％乙腈；3-20min:5％-30％乙腈；20-24min:30％-100％乙腈]，检测波长280nm，记录色谱图，其中有4-6个较大色谱峰，它们在280nm和250nm处均有很大的紫外吸收，在其它波段的吸收则很弱，可知(3)b中所收集的流份富含没食子酰基葡萄糖。
(4)高速逆流色谱法精制没食子酰基葡萄糖单体化合物：
a.溶剂***和样品溶液的配制
高速逆流色谱的溶剂***由烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成，其中烷烃可选用正己烷或环己烷，脂肪酸酯可选用乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇可选用正丙醇、异丙醇或正丁醇，烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水的配比为(0.5-1.5)：(8-12)：(0.5-1.5)：(8-12)，充分振摇后在室温下静置过夜。使用前分别取上相作为HSCCC的固定相，下相作为HSCCC的流动相，超声脱气30min。取步骤(3)b制得的没食子酰基葡萄糖化学组分，用相同体积的上相和下相溶解样品，备用。
b.高速逆流色谱分离制备过程：
首先将溶剂***的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速750～850rpm/min，再以1.5～3.0mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入(4)a中的样品溶液。在280nm下检测，记录色谱图，根据色谱图收集没食子酰基葡萄糖各单体化合物的流分。
c.没食子酰基葡萄糖单体化合物的分析和鉴定：
使用高效液相对(4)b中所得没食子酰基葡萄糖单体化合物进行纯度检测：应用安捷伦SB-C18色谱柱(Analytical HPLC Column 4.6×150mm,5μm)，乙腈-0.1％三氟乙酸水(v/v)为流动相梯度洗脱[1-3min:5％乙腈；3-20min:5％-30％乙腈；20-24min:30％-100％乙腈]，检测波长280nm，测得单体化合物的各流分均为单一峰，纯度高于98％；使用1H NMR和13C NMR对没食子酰基葡萄糖单体化合物进行结构鉴定。
实施例1
一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备核桃楸树皮提取物：
取经干燥的核桃楸树皮，经粉碎机粉碎。称取核桃楸树皮粉末1kg，加入10倍重量的体积分数为70％的乙醇水溶液中，回流提取3h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得核桃楸树皮提取物124g。
(2)核桃楸树皮提取物的脱脂与干燥：
取步骤(1)制得的核桃楸树皮提取物100g，加适量水制成800ml混悬液，放入分液漏斗中，同时加入石油醚800mL进行萃取，重复3次，以抽掉脂溶性成分，收集水层溶液，旋转蒸发减压浓缩至无醇味，得到脱脂后的核桃楸树皮提取物，再经冷冻干燥，即得核桃楸树皮粗分离物70g。
(3)高速逆流色谱法富集没食子酰基葡萄糖化学组分：
a.溶剂***和样品溶液的配制
在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水两相溶剂体系，其体积比为1：2：1：2，振摇30s后在室温下静置过夜。使用前分别放出上相和下相，使用超声波提取器脱气30min。取步骤(2)中的核桃楸树皮粗分离物1g，用10mL的上相和10mL的下相溶解样品，备用。
b.高速逆流色谱富集没食子酰基葡萄糖化学组分的过程
首先将溶剂***的上相快速(20mL/min)注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速800rpm/min，再以2.0mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入a中的样品溶液。在280nm波长下检测，记录色谱图，根据色谱图收集富含没食子酰基葡萄糖的流分，本次共制得没食子酰基葡萄糖化学组分80mg。高速逆流色谱图见图1。
c.没食子酰基葡萄糖化学组分的分析和鉴定
使用高效液相色谱对b中分离得到的没食子酰基葡萄糖化学组分进行成分分析和检测：应用安捷伦SB-C18色谱柱(Analytical HPLC Column4.6×150mm,5μM)，乙腈-0.1％三氟乙酸水(v/v)为流动相梯度洗脱[1-3min:5％乙腈；3-20min:5％-30％乙腈；20-24min:30％-100％乙腈]，检测波长280nm，记录色谱图，其中有4个较大色谱峰，它们在280nm和250nm处均有很大的紫外吸收，在其它波段的吸收则很弱，可知(3)b中所收集的流份富含没食子酰基葡萄糖，高效液相色谱检测图见图2。
(4)高速逆流色谱法精制没食子酰基葡萄糖单体化合物：
a.溶剂***和样品溶液的配制
在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：正丙醇：水两相溶剂体系，其体积比为1：9：1：9，振摇30s后在室温下静置过夜。使用前分别放出上相和下相，使用超声波提取器脱气30min。取步骤(3)b制得的没食子酰基葡萄糖化学组分40mg，用4.5mL的上相和4.5mL的下相溶解样品，备用。
b.高速逆流色谱分离制备过程
首先将溶剂***的上相快速(20mL/min)注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速800rpm/min，再以2.5mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入(4)a中的样品溶液。在280nm波长下检测，记录色谱图，见图3，根据色谱图收集其中4个较大的流分。
c.没食子酰基葡萄糖单体化合物的分析和鉴定
使用高效液相对(4)b中所得没食子酰基葡萄糖单体化合物进行纯度检测：应用安捷伦SB-C18色谱柱(Analytical HPLC Column 4.6×150mm,5μm)，乙腈-0.1％三氟乙酸水(v/v)为流动相梯度洗脱[1-3min:5％乙腈；3-20min:5％-30％乙腈；20-24min:30％-100％乙腈]，检测波长280nm，测得单体化合物的各流分均为单一峰，纯度均高于98％，见图4a、4b、4c和4d；经1H NMR和13C NMR谱图分析和文献对照，鉴定所得4个流份分别为1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖(10.4mg)、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖(15.2mg)、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖(20.3mg)和1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖(17.1mg)，其葡萄糖片段的13C NMR数据见表1。
表1化合物13C NMR数据
NO. 化合物1a 化合物2a 化合物3b 化合物4a
C-1 94.7 92.1 93.6 92.3
C-2 73.7 72.7 71.8 70.7
C-3 75.1 73.6 76.2 72.9
C-4 70.2 69.6 69.6 68.3
C-5 74.1 74.8 76.3 72.6
C-6 63.5 62.9 63.8 61.6
a在DMSO-d6中测定；b在Actone-d6中测定。
实施例2
一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备核桃外果皮提取物：
取干燥粉粹后的核桃外果皮粉末1kg，加入8倍重量的体积分数为80％的乙醇溶液中，回流提取2h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得核桃外果皮提取物110g。
(2)核桃外果皮提取物的脱脂与干燥：
取步骤(1)制得的核桃外果皮提取物100g，加适量水制成800ml混悬液，放入分液漏斗中，同时加入石油醚800mL进行萃取，重复3次，以抽掉脂溶性成分，收集水层溶液，旋转蒸发减压浓缩至无醇味，得到脱脂后的核桃外果皮提取物，再经冷冻干燥，即得核桃外果皮粗分离物65g。
(3)高速逆流色谱法富集没食子酰基葡萄糖化学组分：
高速逆流色谱富集没食子酰基葡萄糖化学组分，具体操作方法详见实例1。使用体积比为1：2：1：2的正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水溶剂***，在主机转速为800rpm/min，流速为4.0mL/min，检测波长为280nm条件下，从1g核桃外果皮粗分离物中得到92mg目标组分，经液相检测，该目标组分富含没食子酰基葡萄糖。高速逆流色谱色谱图见图5，高效液相色谱检测图见图6。
(4)高速逆流色谱法精制没食子酰基葡萄糖单体化合物：
高速逆流色谱法精制没食子酰基葡萄糖单体化合物，具体操作方法详见实例1。使用体积比为1：9：1：9的正己烷：乙酸乙酯：异丙醇：水溶剂***，在主机转速为800rpm/min，流速为4.0mL/min，检测波长为280nm条件下，从92mg没食子酰基葡萄糖化学组分种纯化得到1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖10.1mg、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖13.8mg、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖17.2mg和1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖10.5mg，经高效液相检测，这4个化合物的纯度均大于98％。高速逆流色谱色谱图见图7，高效液相色谱检测图见图8a-图8d。
对比例1
为和实施例1作平行对比，我们取核桃楸树皮的干燥粗粉1kg，用10倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得乙醇浸膏130g。将130g乙醇浸膏悬浮于去离子水中依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别合并各萃取层，减压浓缩，得到石油醚萃取物(13g)、氯仿萃取物(11g)、乙酸乙酯萃取物(28g)、正丁醇萃取物(36g)。
为充分提取没食子酰基葡萄糖类化合物，该对比实验将乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物合并后再分离。首先将合并后的萃取物64克过大孔树脂除去水溶溶性成分，再用95％乙醇洗脱，得34克洗脱物。之后将上述34克洗脱物经过减压硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、Sephadex LH-20柱层析、开口ODS柱层析、反复重结晶及制备液相等色谱手段，最终得到化合物1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖0.208g、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.472g、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.361g和1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.206g。
通过折算可以发现，采用实施例1所述方法，理论上能够从1千克核桃楸树皮中纯化得到1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖0.903g、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖1.319g、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖1.762g和1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖1.484g。由此可见，使用等量的药材，实施例1的目标产物得量远大于对比例1。
另外，从时间上来看，用1千克核桃楸树皮制备高纯度的没食子酰基葡萄糖单体化合物，采用对比例1所述方法需要6-8个月的时间，而按照实施例1所述方法，仅需40天。
对比例2
为和实施例2作平行对比，我们取核桃外果皮的干燥粗粉1kg，用10倍量80％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得乙醇浸膏103g。将103g乙醇浸膏悬浮于去离子水中依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别合并各萃取层，减压浓缩，得到石油醚萃取物(14g)、氯仿萃取物(8g)、乙酸乙酯萃取物(18g)、正丁醇萃取物(22g)。
为充分提取没食子酰基葡萄糖类化合物，该对比实验将乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物合并后再分离。首先将合并后的萃取物40克过大孔树脂除去水溶溶性成分，再用95％乙醇洗脱，得18克洗脱物。之后将上述18克洗脱物经过减压硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、Sephadex LH-20柱层析、开口ODS柱层析、反复重结晶及制备液相等色谱手段，最终得到化合物1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖0.067g、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.103g、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.144g和1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.128g。
通过折算可以发现，用实施例2所述方法，理论上能够从1千克核桃外果皮中纯化得到1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖0.722克、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.987g、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖1.23g和1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖0.751g。由此可知，使用等量的药材，实施例2的目标产物得量远大于对比例2。
另外，从时间上来看，用1千克核桃楸树皮制备高纯度的没食子酰基葡萄糖单体化合物，用对比例2所述方法需要6-8个月的时间，而按照实施例2所述方法，仅需1个月。
本发明没食子酰基葡萄糖的制备方法利用高速逆流色谱从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖化学组分和单体化合物，工艺简单、快捷，分离周期短，大大缩短了分离时间。本发明方法目标产物收率高、样品无损失、分离效果好，依据实际需要，既可以从胡桃属植物中分离制备没食子酰基葡萄糖的化学组份，又可以进一步同时纯化精制不少于4个没食子酰基葡萄糖单体化合物。本发明方法单体制备量大；根据所需没食子酰基葡萄糖的质量，可以调节被分离样品的进样量，制备型高速逆流色谱仪一次性可以分离出几百毫克甚至克级的目标物。本发明方法增加了大量制备没食子酰基葡萄糖的植物来源；据文献报道，没食子酰基葡萄糖类化合物通常存在于牡丹皮、芍药、五倍子、黄芩、芦荟、决明子、菊花、杜仲、大黄等植物中，本方法是首次以胡桃属植物为原料，用高速逆流色谱法大量生产该类化合物。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (25)

1.一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，利用高速逆流色谱从胡桃属植物中分离纯化没食子酰基葡萄糖化学组分和单体化合物；
包括如下步骤：
(1)将粉碎后的胡桃属植物粉末加入醇的水溶液，回流提取，所得提取液过滤，减压浓缩至无醇味，得胡桃属植物提取物；
(2)将所述步骤(1)所得胡桃属植物提取物加水溶解，用溶剂萃取以除去脂溶性成分，减压浓缩将有机溶剂挥发完全，剩余水层溶液再经冷冻干燥，得胡桃属植物粗分离物；
(3)将所述步骤(2)所得胡桃属植物粗分离物用高速逆流色谱富集没食子酰基葡萄糖化学组分；溶剂***由烷烃－脂肪酸酯－脂肪醇－水组成，溶剂***的上相为固定相，下相为流动相；
(4)将所述步骤(3)所得没食子酰基葡萄糖化学组分用高速逆流色谱进一步纯化精制，得到没食子酰基葡萄糖单体化合物；溶剂***由烷烃－脂肪酸酯－脂肪醇－水组成，溶剂***的上相为固定相，下相为流动相；
所述没食子酰基葡萄糖单体化合物为1,6-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖、1,2,6-三没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖、1,2,3,6-四没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖或1,2,3,4,6-五没食子酰基-O-β-D-吡喃葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述胡桃属植物包括核桃、核桃楸、野核桃、麻核桃和泡核桃中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述醇的的水溶液中醇的体积分数为10％－90％；所述胡桃属植物粉末与醇的水溶液的质量比为1：8－50；回流时间为2－4h。
4.根据权利要求3所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述醇的的水溶液中醇的体积分数为50％－70％。
5.根据权利要求3所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述胡桃属植物粉末与醇的水溶液的质量比为1：8－10。
6.根据权利要求3所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述回流时间为2－3小时。
7.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述醇包括甲醇、乙醇或丙醇。
8.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述醇包括乙醇。
9.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶剂包括石油醚或正己烷。
10.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述溶剂***中各原料的体积比为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝(1－2)：(3－5)：(1－2)：(3－5)；烷烃包括正己烷或环己烷，脂肪酸酯包括乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇包括甲醇、乙醇或丙醇。
11.根据权利要求10所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述溶剂***中各原料的体积比为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝1：2：1：2。
12.根据权利要求10所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述烷烃包括正己烷。
13.根据权利要求10所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述脂肪酸酯包括乙酸乙酯。
14.根据权利要求10所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述脂肪醇包括甲醇或正丙醇。
15.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中主机转速为750～850rpm/min；流动相流速为1.5～3.0mL/min。
16.根据权利要求15所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中主机转速为800rpm/min。
17.根据权利要求15所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中流动相流速为2.0mL/min。
18.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述溶剂***中各原料的体积比为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝(0.5－1.5)：(8－12)：(0.5－1.5)：(8－12)；烷烃包括正己烷或环己烷，脂肪酸酯包括乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇包括正丙醇、异丙醇或正丁醇。
19.根据权利要求18所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述溶剂***中各原料的体积比为烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水＝1：9：1：9。
20.根据权利要求18所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述烷烃包括正己烷。
21.根据权利要求18所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述脂肪酸酯包括乙酸乙酯。
22.根据权利要求18所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述脂肪醇包括正丙醇。
23.根据权利要求1所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中主机转速为750～850rpm/min；流动相流速为1.5～3.0mL/min。
24.根据权利要求23所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中主机转速为800rpm/min。
25.根据权利要求23所述的一种没食子酰基葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中流动相流速为2.5mL/min。
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Assignee: Foshan Aiweidun Technology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF SPECIAL ANIMAL AND PLANT SCIENCES OF CAAS

Contract record no.: X2023980032401

Denomination of invention: A Preparation Method of Galloyl Glucose

Granted publication date: 20181026

License type: Common License

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