CN105541601B - 一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用，氢氧化钠在利用pH区带逆流色谱法分离制备松萝中的有机酸单体中的应用。石油醚‑乙酸乙酯‑甲醇‑水溶剂体系，所述溶剂***的上相中加入三氟乙酸作为保留剂，下相中加入氢氧化钠作为洗脱剂。1)将溶剂***中加入三氟乙酸的上相泵入逆流色谱仪器的分离柱，作为保留剂；3)开启逆流色谱仪，将样品溶液注入逆流色谱仪器中；4)将溶剂***中加入氢氧化钠的下相，注入逆流色谱仪器中，作为洗脱剂；5)监测洗出液，根据所得的色谱图收集目标组分。本发明对松萝中的有机酸单体进行分离制备，分离效果好、分离量大、回收率高、有机酸单体的纯度达到92％以上，制备成本远低于现有技术。

Description

一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用
技术领域
本发明涉及逆流色谱分离制备方法，具体地说是关于运用pH区带逆流色谱法从松萝粗提物中分离制备有机酸单体的方法。
技术背景
松萝为松萝科植物长松萝(Usnea longissima Ach.)和破茎松萝(Usneadiffracta Vain.)的干燥地衣体，具有清肝、化痰、止血、解毒等功效，可用于治疗头痛、目赤、咳嗽痰多、疟疾、瘰疬、白带，崩漏、外伤出血、痈肿、毒蛇咬伤等。主要有效成分为有机酸类化合物，包括苔色酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸。其中，松萝酸是其代表性成分，是一种广谱抗菌素，对多数***有强大的抑制作用，也能抑制结核菌的生长，用于治疗化脓性创伤、二度烧伤、局部结核等，此外，还有抗癌、抗原虫以及解痉等作用。
迟春艳等在《食品科学》(Vol.30,No.03,2009,127～129)发表了“制备型高速逆流色谱分离纯化长松萝中的松萝酸”，研究采用正己烷-乙腈-乙酸乙酯-水(8:7:5:0.8)的两相体系将石油醚(60-90℃)回流浸提的粗提物进行制备型高速逆流色谱的分离纯化，一次进样25mg，可得到松萝酸11.2mg。利用高效液相色谱检测该样品纯度达到99％。
冯洁等在《中国中药杂志》(Vol.l34,No.6,2009,708～711)发表了“长松萝化学成分研究”，研究应用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱和HPLC柱色谱法分离纯化化合物，利用IR、UV、MS和NMR数据鉴定化合物结构。结果从松萝中分离鉴定了13个化合物,分别为赤星衣酸乙酯(1)，木栓酮(2)，β-香树脂醇(3)，β-谷甾醇(4)，2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(5)，坝巴酸(6)，泽屋萜(7)，苔色酸乙酯(8)，3β-羟基-粘霉-5-烯(9)，齐墩果酸(10)，(+)-松萝酸(11)，苔色酸甲酯(12)和4-甲基-2,6-二羟基苯甲醛(13)。
Wang Xiao等在《Journal of Chromatography A》(Vol.1103,2006,166～169)发表了“Preparative separation of cichoric acid from Echinacea Purpurea by pH-zone-refining counter-current chromatography”，研究采用乙醇超声提取，回收乙醇，得菊苣酸浓缩液2.3L。用AB-8大孔吸附树脂的层析柱进行初步纯化，首先用水冲洗大孔吸附树脂柱至洗脱液无颜色，然后用30％乙醇洗脱目标化合物，得14.9g样品粗提物。最后采用叔丁基甲醚-乙腈-水(4:1:5)的溶剂***，上层有机相加10mmol/L三氟乙酸作为固定相，下层水相加10mmol/L氨水作为流动相，一次进样3g，经过2次分离，得到目标化合物563mg，经过HPLC分析检测得知所得菊苣酸纯度为95.6％。
Wang Xiao等在《Journal of separation science》(Vol.30,2007,3214～3217)发表了“Large-scale separation of salvianolic acid B from the Chinesemedicinal plant Salvia miltiorrhiza by pH-zone-refining countercurrentchromatography”，研究用95％乙醇回流提取，减压浓缩，得浓缩液；浓缩液加一倍量水，用Na2CO3调pH至7.5，用***萃取；水相用盐酸调pH值至3，用***萃取，回收***，得红色粉末状丹参粗提物57.19g。采用叔丁基甲醚-水(1:1)，上层有机相加三氟乙酸(浓度10mmol/L)作为固定相，下层水相加氨水(浓度10mmol/L)作为流动相。一次进样2.0g，得丹酚酸B524.2mg和少量的迷迭香酸，所得化合物纯度均大于93％。
中国专利申请号为201210595556.0的发明公开了一种从长松萝中提取松萝酸的生产工艺，该方法为：将原料经粗粉碎后从投料斗投入，提取罐组主机旋转，将物料从机组前端向后缓慢推进，同时提取溶剂从机组末端的进液管进入提取罐内，由罐后端穿过移动的物料向前端流动，固液两相物质在这种逆向运动中充分接触，从而将药材中有效成分提取出来。药渣经出料传送器强制推动至出渣口而排出，专门的挤汁机对药渣进行挤压，将药渣中残留药液挤出药材组织，减少药渣中残留药液含量。提取效率更高、提取更完全。本发明同时选用连续萃取罐组萃取并结合硅胶柱层析法纯化，分离效果更佳。可得最高收率为1％，含量为95％以上的松萝酸成品。
中国专利申请号为201010236842.9的发明公开了一种制备松萝酸的方法。该方法包括如下步骤：1)将长松萝粉碎后与有机溶剂混匀，进行回流提取，得到松萝酸粗提物；2)选择两相溶剂体系，采用高速逆流色谱法，将所述步骤1)得到的松萝酸粗提物进行分离，得到松萝酸。本发明采用高速逆流色谱进行松萝酸的分离，与以往的实验室制备技术手段相比具有明显的优点：一次进样量大、分离能力强、分离时间短、样品损失小，以及分离和纯化可同步完成。本发明提供的方法适于柱容量325ml的高速逆流色谱仪，利用该方法制备所得松萝酸的纯度高达99％。
现有关于松萝中有机酸单体分离纯化的方法主要采用半制备HPLC、反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱，其局限性是费时费力、成本高、易产生不可逆吸附、样品回收率低、制备效率低；有报道运用高速逆流色谱法对松萝中有机酸单体进行分离纯化，虽然具有进样量大、分离能力强、分离时间短、样品损失小等特点，但相对于pH区带逆流色谱而言，其仍存在进样量小、实验条件较难优化等缺点；有报道采用连续萃取罐组结合硅胶柱层析法纯化松萝中的有机酸单体的方法，其最高收率为1％，成品为95％以上的松萝酸。上述研究方法多是针对松萝的主要成分松萝酸进行的分离制备和纯化，至于其他有机酸单体并未涉及。也有文献报道运用pH区带逆流色谱技术分离制备中药材提取物中的有机酸单体，所选用的溶剂***有叔丁基甲醚-水、叔丁基甲醚-乙腈-水、叔丁基甲醚-乙腈-正丁醇-水和叔丁基甲醚-四氢呋喃-水，均以三氟乙酸作为保留剂，氨水作为洗脱剂；也有关于氯仿-甲醇-水溶剂***的报道，以氨水作为保留剂，三氟乙酸作为洗脱剂；有报道以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水作为溶剂***，以盐酸作为保留剂，氨水作为洗脱剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用，该方法具有成本低，操作简单，快速高效，可以从松萝中大量分离制备有机酸单体的优势。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
氢氧化钠在利用pH区带逆流色谱法分离制备松萝中的有机酸单体中的应用。
利用pH区带逆流色谱法分离制备松萝中的有机酸单体的溶剂***，为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系，所述溶剂***的上相中加入三氟乙酸作为保留剂，下相中加入氢氧化钠作为洗脱剂。
优选的，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为5:5:(2-3):(8-7)，优选为5:5:3:7。
优选的，上相中的三氟乙酸的浓度为10-15mmol/L，优选为10mmol/L；下相中的氢氧化钠的浓度为10-20mmol/L，优选为前1.5小时10mmol/L，之后转换为20mmol/L。
所述溶剂***的制备过程，包括如下步骤：将A组分、B组分、C组分和D组分按上述配比进行混合，摇匀后静置，待分层后，将上下两相分开；在上相中加入三氟乙酸，在下相中加入氢氧化钠。
上述溶剂***在利用pH区带逆流色谱法分离制备松萝中有机酸单体中的应用。
利用所述溶剂***进行松萝中有机酸单体分离的方法，包括如下步骤：
将上述溶剂***泵入逆流色谱仪中对松萝的有机酸粗提物的样品溶液进行分离，监测洗出液，根据所得的色谱图收集目标组分。
具体步骤如下：
1)将溶剂***中加入三氟乙酸的上相泵入逆流色谱仪器的分离柱，作为保留剂；
2)取等量加入三氟乙酸的上相和未加氢氧化钠的下相混合后溶解松萝的有机酸粗提物，得到样品溶液；使样品保持游离状态并且能够完全溶解。
3)开启逆流色谱仪，将样品溶液注入逆流色谱仪器中；
4)将溶剂***中加入氢氧化钠的下相，注入逆流色谱仪器中，作为洗脱剂；
5)监测洗出液，根据所得的色谱图收集目标组分。
优选的，步骤1)中，溶剂***的上相泵入逆流色谱仪器的分离柱的速度为10-20ml/min。
优选的，步骤2)中，松萝的有机酸提取物的制备方法，包括如下步骤；采用有机溶剂对松萝进行提取，将提取液浓缩、冷冻干燥后，制得松萝的有机酸提取物。
进一步优选的，步骤2)中，所述样品溶液中，每克有机酸提取物用5-10ml上相和5-10ml下相的混合物进行溶解。
优选的，步骤3)中，样品溶液注入逆流色谱仪器中时，逆流色谱仪的转速为750-1000rpm。
优选的，步骤4)中，溶剂***的下相注入逆流色谱仪器的速度为2ml/min；进一步优选的前1.5小时内的下相中的氢氧化钠的浓度为10mmol/L，1.5小时以后氢氧化钠的浓度转换为20mmol/L，目的是在实现化合物成功分离的基础上减少分离过程所用的时间。
优选的，分析有机酸粗提物的高效液相色谱条件为：YMC-Pack ODS-A C18column(250mm×4.6mm)，紫外检测波长：300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水，梯度洗脱程序为：0-40min,50％-100％甲醇；40-55min，100％-100％甲醇。分析有机酸提取物的目的是分析粗提物中成分的数目和分离度，检测pH区带逆流色谱馏分的纯度以及利用保留时间来归属各馏分中的化合物。
pH区带逆流色谱矩形峰的鉴定方法，采用Agilent 5973N质谱仪和Bruker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H-NMR和13C-NMR谱的测定。
上述方法在松萝中有机酸单体的分离制备中的应用。
本发明的pH区带逆流色谱最佳实验条件的优化经历了如下过程：
根据Wang Xiao等发表的“Preparative separation of cichoric acid fromEchinacea Purpurea by pH-zone-refining counter-current chromatography”，选用叔丁基甲醚-乙腈-水(4:1:5)为溶剂体系，上相加10mmol/L三氟乙酸，下相加10mmol/L氨水，未形成pH区带，经HPLC检测，不能实现成功分离；根据Cheng Chunru等发表的“Preparativeisolation of triterpenoids from Ganoderma lucidum by counter-currentchromatography combined with pH-zone-refining”选用氯仿-甲醇-水(13:7:4)为溶剂体系，上相加氨水10mmol/L，下相加三氟乙酸10mmol/L，也没有形成pH区带，不能实现成功分离。
根据迟春艳等发表的“制备型高速逆流色谱分离纯化长松萝中的松萝酸”，选用正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水(8:5:7:0.8)为溶剂体系，在上相加三氟乙酸10mmol/L，在下相加氨水10mmol/L，未实现成功分离；根据Liu Yuqin发表的“Accelerated solventextraction of monacolin K from red yeast rice and purification by high-speedcounter-current chromatography”，选用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:4:6)为溶剂体系，上相加盐酸10mmol/L，下相加氨水10mmol/L，形成两个明显的区带，经HPLC检测，得到苔色酸和4-甲氧基苔色酸，纯度分别为92.5％和91.9％，所需时间约为3.5小时，且各成分有分离开来的趋势；在此基础上继续优化分离制备条件，溶剂体系不变，将盐酸换成三氟乙酸，导致保留能力减弱，使得苔色酸和4-甲氧基苔色酸被同时洗脱出来，仅得到去甲环萝酸和巴尔巴地衣酸，纯度分别为94.5％和96.9％，所需时间约为4小时，且其他有机酸单体有分离开来的趋势。
为了实现苔色酸和4-甲氧基苔色酸的分离，减少了溶剂体系中甲醇的含量，溶剂体系变为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2:8)，最终形成三个pH区带，经HPLC检测，得到苔色酸、4-甲氧基苔色酸和去甲环萝酸，纯度分别为94.5％、96.9％和95.8％，所需时间约为5小时，且其他有机酸有分离开来的趋势；为了实现成功的分离，将氨水换成氢氧化钠以增强下相的洗脱能力，最终得到苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为92.5％、96.9％、93.5％、95.1％、93.0％和94.2％，所需时间约为11小时，实现了成功分离。
由于完成分离所需要的时间过长，本发明对pH区带逆流色谱条件进行了进一步的优化，目的是在成功分离的基础上实现分离时间的缩短。根据分离经验，将溶剂体系换成石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:3:7)，同样实现了成功分离，形成5个pH区带及柱容物，得到苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为93.2％、95.4％、94.1％、95.7％、92.7％和96.8％，所需时间约为9.5小时，节约了1.5个小时；继续优化实验条件，溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:3:7)不变，上相加三氟乙酸10mmol/L，下相分成两部分，一部分加入10mmol/L氢氧化钠，另一部分加入20mmol/L氢氧化钠，其中前1.5小时用含有10mmol/L氢氧化钠的下相洗脱，之后切换为20mmol/L氢氧化钠的下相，结果也实现了成功分离，形成5个pH区带及柱容物，得到苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为92.7％、97.7％、93.8％、94.8％、92.2％和95.7％，所需时间为8小时，节约了1.5小时，相对于初始的分离时间共节约了3个小时，实现了最初设立的缩短分离时间的目标。
可见，本发明的实验条件是发明人根据自身的经验和对前人研究成果借鉴的基础上，经过反复的摸索逐渐建立的，逐渐摸索的过程是需要发明人付出大量的创造性劳动的基础上才能最终确定，所以，本发明的技术方案是非显而易见的。
本发明的有益技术效果为：本发明利用pH区带逆流色谱对松萝中的有机酸单体进行分离制备，分离效果好、分离量大、操作简单、快速高效、回收率高、有机酸单体的纯度达到92％以上，有机酸单体的制备成本远低于现有技术，是一种经济高效的从松萝药材中分离制备有机酸单体的方法。
附图说明
图1为实施例5松萝粗提物的pH区带逆流色谱分离的色谱图，1、苔色酸，2、4-甲氧基苔色酸，3、去甲环萝酸，4、巴尔巴地衣酸，5、环萝酸，6、松萝酸；
图2为粗提物的高效液相色谱图；
图3为从松萝中分离得到有机酸单体的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1
1、取风干的松萝地衣体1.5kg，粉碎后过40目筛，用4倍量的乙酸乙酯溶液回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得119g粗提物，存于4℃冰箱中用于进一步分离制备；
2、运用pH区带逆流色谱技术分离制备松萝粗提物中的有机酸单体
溶剂***为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2:8)，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入10mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，高速逆流色谱仪器的柱体积为300ml，进样量1.5g，转速800rpm，流速2.0ml/min，固定相保留率41％，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂***，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入10mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，取1.5g松萝粗提物溶解于10ml加入三氟乙酸的上相和10ml未加氢氧化钠的下相混合物中待用。采用上海同田生物技术有限公司研制的半制备型高速逆流色谱仪器，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测器、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以高流速(20ml/min)注满色谱分离柱，停泵。将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪器进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品能够进入色谱分离柱。开启速度控制器，使高速逆流色谱仪器的色谱分离柱正转，转速达到800rpm时，设置流动相流速为2.0ml/min，开始泵流动相。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为92.5％、96.9％、93.5％、95.1％、93.0％和94.2％，所需时间约为11小时。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：YMC-Pack ODS-A C18column(250mm×4.6mm)，紫外检测波长300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水(0-40min,50％-100％甲醇；40-55min,100％-100％甲醇)。
实施例2
1、取风干的松萝地衣体1.5kg，粉碎后过40目筛，用4倍量的乙酸乙酯溶液回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得121g粗提物，存于4℃冰箱中用于进一步分离制备；
2、运用pH区带逆流色谱技术分离制备松萝粗提物中的有机酸单体
溶剂***为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2.5:7.5)，在上相固定相中加入15mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入15mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，高速逆流色谱仪器的柱体积为300ml，进样量1.5g，转速800rpm，流速2.0ml/min，固定相保留率40％，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂***，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入10mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，取1.5g松萝粗提物溶解于10ml加入三氟乙酸的上相和10ml未加氢氧化钠的下相混合物中待用。采用上海同田生物技术有限公司研制的半制备型高速逆流色谱仪器，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测器、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以高流速(10ml/min)注满色谱分离柱，停泵。将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪器进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品能够进入色谱分离柱。开启速度控制器，使高速逆流色谱仪器的色谱分离柱正转，转速达到800rpm时，设置流动相流速为2.0ml/min，开始泵流动相。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为92.3％、94.9％、95.5％、95.8％、93.4％和93.2％，所需时间约为10.5小时。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：YMC-Pack ODS-A C18column(250mm×4.6mm)，紫外检测波长300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水(0-40min,50％-100％甲醇；40-55min,100％-100％甲醇)。
实施例3
1、取风干的松萝地衣体1.5kg，粉碎后过40目筛，用4倍量的乙酸乙酯溶液回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得122g粗提物，存于4℃冰箱中用于进一步分离制备；
2、运用pH区带逆流色谱技术分离制备松萝粗提物中的有机酸单体
溶剂***为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:3:7)，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入10mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，高速逆流色谱仪器的柱体积为300ml，进样量1.5g，转速800rpm，流速2.0ml/min，固定相保留率43％，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂***，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，在上相固定相中加入15mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入20mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，取1.5g松萝粗提物溶解于10ml加入三氟乙酸的上相和10ml未加氢氧化钠的混合物中待用。采用上海同田生物技术有限公司研制的半制备型高速逆流色谱仪器，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测器、记录仪和色谱分离柱(有聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以高流速注满色谱分离柱，停泵。将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪器进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品能够进入色谱分离柱。开启速度控制器，使高速逆流色谱仪器的色谱分离柱正转，转速达到800rpm时，设置流动相流速为2.0ml/min，开始泵流动相。然后根据检测器紫外管谱图接收目标成分，得苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为92.2％、93.4％、94.3％、93.7％、92.9％和95.8％，所需时间约为9.5小时。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：YMC-Pack ODS-A C18column(250mm×4.6mm)，紫外检测波长300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水(0-40min,50％-100％甲醇；40-55min,100％-100％甲醇)。
实施例4
1、取风干的松萝地衣体1.5kg，粉碎后过40目筛，用4倍量的乙酸乙酯溶液回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得123g粗提物，存于4℃冰箱中用于进一步分离制备；
2、运用pH区带逆流色谱技术分离制备松萝粗提物中的有机酸单体
溶剂***为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:3:7)，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入15mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，高速逆流色谱仪器的柱体积为300ml，进样量1.5g，转速800rpm，流速2.0ml/min，固定相保留率42％，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂***，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，在下相流动相中加入15mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，取1.5g松萝粗提物溶解于10ml加入三氟乙酸的上相和10ml未加氢氧化钠的混合物中待用。采用上海同田生物技术有限公司研制的半制备型高速逆流色谱仪器，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测器、记录仪和色谱分离柱(有聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以高流速注满色谱分离柱，停泵。将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪器进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品能够进入色谱分离柱。开启速度控制器，使高速逆流色谱仪器的色谱分离柱正转，转速达到800rpm时，设置流动相流速为2.0ml/min，开始泵流动相。然后根据检测器紫外管谱图接收目标成分，得苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为89.2％、87.4％、92.3％、93.5％、94.9％和93.8％，所需时间约为8.5小时。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：YMC-Pack ODS-A C18column(250mm×4.6mm)，紫外检测波长300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水(0-40min,50％-100％甲醇；40-55min,100％-100％甲醇)。
实施例5
1、取风干的松萝地衣体1.5kg，粉碎后过40目筛，用4倍量的乙酸乙酯溶液回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得120g粗提物，存于4℃冰箱中用于进一步分离制备；
2、运用pH区带逆流色谱技术分离制备松萝粗提物中的有机酸单体
溶剂***为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:3:7)，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，将下相流动相分成两部分，其中一部分加入10mmol/L氢氧化钠；另一部分加入20mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，在约1.5小时时进行变换。高速逆流色谱仪器的柱体积为300ml，进样量1.5g，转速800rpm，流速2.0ml/min，固定相保留率42％，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂***，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，在上相固定相中加入10mmol/L三氟乙酸作为保留剂，将下相分成两部分，在一部分下相流动相中加入10mmol/L氢氧化钠，另一部分加入20mmol/L氢氧化钠作为洗脱剂，取1.5g松萝粗提物溶解于10ml加入三氟乙酸的上相和10ml未加氢氧化钠的混合物中待用。采用上海同田生物技术有限公司研制的半制备型高速逆流色谱仪器，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测器、记录仪和色谱分离柱(有聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以高流速注满色谱分离柱，停泵。将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪器进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品能够进入色谱分离柱。开启速度控制器，使高速逆流色谱仪器的色谱分离柱正转，转速达到800rpm时，设置流动相流速为2.0ml/min，开始泵入已加入10mmol/L氢氧化钠流动相，约1.5小时后，开始泵入已加入20mmol/L氢氧化钠流动相。然后根据检测器紫外管谱图(图1)接收目标成分，得苔色酸、4-甲氧基苔色酸、去甲环萝酸、巴尔巴地衣酸、环萝酸和松萝酸，经HPLC分析，纯度分别为92.7％、97.7％、93.8％、94.8％、92.2％和95.7％，所需时间为8小时。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：YMC-Pack ODS-A C18column(250mm×4.6mm)，紫外检测波长300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水(0-40min,50％-100％甲醇；40-55min,100％-100％甲醇)。
图2是对松萝粗提物的HPLC分析，目的是了解粗提物中有机酸的数目及分离度，得到各成分的保留时间，为pH区带逆流色谱各馏分的纯度检测和归属确定分析条件；图3是对pH区带逆流色谱馏分的HPLC检测，目的是得到各成分的纯度并根据保留时间与粗提物中各成分的保留时间进行比对，实现各馏分的归属。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.利用溶剂***进行松萝中有机酸单体分离制备的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将溶剂***泵入逆流色谱仪中对松萝的有机酸粗提物的样品溶液进行分离，监测洗出液，根据所得的色谱图收集目标组分；所述溶剂***为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系，溶剂***的上相中加入三氟乙酸作为保留剂，下相中加入氢氧化钠作为洗脱剂；
溶剂***的上相泵入逆流色谱仪器的分离柱的速度为10-20ml/min，溶剂***的下相注入逆流色谱仪器的速度为2ml/min，松萝的有机酸粗提物样品溶液注入逆流色谱仪器中时，逆流色谱仪的转速为750-1000rpm；
所述松萝的有机酸粗提物的样品溶液的制备方法，包括如下步骤；采用乙酸乙酯对松萝进行提取，将提取液浓缩、冷冻干燥后，制得松萝的有机酸粗提物，每克有机酸粗提物用5-10ml加入三氟乙酸的上相和5-10ml未加入氢氧化钠的下相的混合物进行溶解，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溶剂***中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为5:5:(2-3):(8-7)；上相中的三氟乙酸的浓度为10-15mmol/L；下相中的氢氧化钠的浓度为10-20mmol/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述溶剂***中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为5:5:3:7。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于：所述溶剂***的制备方法包括如下步骤：将石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水按权利要求2中各组分的配比进行混合，摇匀后静置，待分层后，将上下两相分开；在上相中加入三氟乙酸，在下相中加入氢氧化钠。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：前1.5小时内的下相中的氢氧化钠的浓度为10mmol/L，1.5小时以后氢氧化钠的浓度转换为20mmol/L。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：分析有机酸粗提物的高效液相色谱条件为：YMC-Pack ODS-A C18column，250mm×4.6mm，紫外检测波长300nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相采用甲醇-水，梯度洗脱程序为：0-40min，50％-100％甲醇；40-55min，100％-100％甲醇。
7.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：pH区带逆流色谱矩形峰的鉴定方法，采用Agilent 5973N质谱仪和Bruker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H-NMR和13C-NMR谱的测定。
8.权利要求1-5任一所述的方法在松萝中有机酸单体分离制备中的应用。
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Assignor: Shandong Analysis Test Center

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Denomination of invention: Separation and preparation method of organic acid monomers in Chinese usnea and application thereof

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