CN102215667B - 对多种病害显示抗性的植物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

发现了拟南芥的基因组上相邻的多种不同抗性基因识别多种不同病原体的攻击而引发抵抗反应。可以通过将多种不同抗性基因组合导入植物中，从而赋予植物以针对多种不同病原体的抗性。

Description

对多种病害显示抗性的植物及其制造方法
技术领域
本发明涉及通过将2种以上针对病原菌的抗性基因组合导入植物中来将针对2种以上病原菌的抗性赋予植物的方法，以及通过该方法制造的转化植物体、其部分或繁殖材料。
背景技术
据说全世界由病害造成的农业生产灾害为10～20％，这等于8亿人的粮食。由于全世界的饥饿人口估计为8亿人，因而防止病害可以说是在粮食的稳定供给中最为重要的课题。引起植物发生疾病的原因有传染性的生物病原(病原体)和非传染性的环境病原。植物的感染病中80％以上是由丝状真菌(霉菌类)引起的，其余是由细菌、病毒、类病毒、植原体、立克次氏体样微生物、线虫、原虫等引起的。植物通常受到这些病原体攻击，通过特有的生物体防御反应来保护自身免受病原体感染。
例如，十字花科蔬菜类炭疽病的病原是属于刺盘孢属(Colletotrichum)的丝状真菌(希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum))，感染小松菜、白菜、萝卜等十字花科作物，是造成灾害的疾病，但近年来，发现了多种对该病原菌显示抗性的拟南芥生态型(ecotype)(非专利文献1)。而且，本发明者们发现，在抗性生态型Ws-0中，存在于第5号染色体上的特定区域的基因具有赋予拟南芥以针对十字花科蔬菜类炭疽病菌的抗性的功能。
另外，对于主要感染茄科植物的具有无毒基因avrRps4的番茄细菌性叶斑病菌(病原细菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato))，拟南芥中也发现了抗性基因(非专利文献2)。而且，对于作为感染以茄科和十字花科植物为代表的200种以上的植物、带来使其枯死的农业上的重大灾害的病害的青枯病(青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum))，拟南芥中也发现了抗性基因(非专利文献3～5)。
根据Flor所倡导的基因对基因学说(非专利文献6)，认为这种植物的生物体防御反应是由于植物方面的抗性基因产物识别来源于菌的激发物(elicitor)(无毒基因产物)，从而表现针对病原菌的一系列抵抗反应。而且，在该学说中，1种抗性基因针对1种病原菌1对1地发挥作用。
然而，地球上存在十万种的丝状真菌，但其中大多数不感染植物，仅有约8000种是植物病原菌，其中，会对1种植物引发病害的不到10种。即，植物对大部分病原体显示抗性。尽管如此，拟南芥的基因组上仅存在约150种(非专利文献7)抗性基因，稻基因组上仅存在约600种(非专利文献8)抗性基因。因此，现状是植物针对多样的病原体的抗性的机制仅用基因对基因学说不能说明，其详细尚未阐明。
非专利文献1：Y.Narusaka等人，Molecular Plant-Microbe Interactions，17：749-762(2004)
非专利文献2：W.Gassmann等人，Plant J.20：265-277(1999)
非专利文献3：L.Deslandes等人，Molecular Plant-Microbe Interactions，11(7)：659-667(1998)
非专利文献4：L.Deslandes等人，Proc Natl Acad Sci USA.，99(4)：2404-2409(2002)
非专利文献5：L.Deslandes等人，Proc Natl Acad Sci USA.，24：8024-8029(2003)
非专利文献6：H.Flor.，Annu.Rev.Phytopathol.9：275-296(1971)
非专利文献7：Meyers，B.C.等人，Plant Cell，15：809-834(2003)
非专利文献8：Goff，S.A.等人，Science，296：92-100(2002)
非专利文献9：土屋等，植物防疫54：87-92(2000)
非专利文献10：Clark等人，Science，317：338-342(2007)
非专利文献11：Fedoroff NV.和Smith D.，Plant J.3：273-289(1993)
非专利文献12：Noutoshi等人，Plant J.，43：873-888(2005)
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于这样的状况而做出的，其目的是阐明植物针对多样的病原体的抗性的机制，并利用该机制制造针对多样的病原体显示抗性的植物。
用于解决课题的方法
本发明者们在世界上首次搞清楚了十字花科蔬菜类炭疽病菌(希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum))感染拟南芥的生态型Col-0，从而建立了植物免疫研究中的模型实验***(非专利文献1)。对于100种以上的拟南芥的生态型进行了感染生理学和遗传学分析，结果获得了对该病原菌显示抗性的11种生态型。而且，弄清楚了其中显示特别强的抗性的Eil-0的抗性是优势且单基因支配的，该基因存在于拟南芥的5条染色体中的第4号染色体上(非专利文献1)。该基因(座)很可能是抗性基因(R-基因，植物方面识别病原体的受体)，将其命名为RCH1(用于希金斯刺盘孢的识别(Recognition of C.higginsianum))。
因为暗示了在其他抗性生态型中，在与Eil-0不同的基因座上存在抗性基因，所以本发明者们对该基因进行了分析，弄清楚了生态型Ws-0中的抗性基因存在于第5号染色体上。生态型Ws-0中的抗性基因的详细图谱的结果是，目标基因位于十几个抗性基因形成了簇(cluster)的区域(MRC-J-区域)。接着，本发明者们通过使用在生态型Ws-0中***了T-DNA的突变体文库(3万个体)的反求遗传学分析，筛选出了发生了针对炭疽病菌由抗性向敏感性的表型变化的突变体。对于得到的8个突变体进行了T-DNA***部位和突变部位分析，弄清楚了敏感性突变体在Ws-At5g45250(由Gassmann命名为RPS4)或Ws-At5g45260基因(由本发明者们命名为RCH2)中发生了突变。
对于RPS4和RCH2与针对病原菌的抗性的关系，到目前为止有几个报告例。例如，Gassmann等已经将拟南芥生态型Col-0和Ler-0的RPS4鉴定为针对番茄细菌性叶斑病菌(病原细菌丁香假单胞菌番茄致病变种)的抗性基因(非专利文献2)。另一方面，Gassmann等认定存在于RPS4附近的RCH2(在文献中称为RSH4)与番茄细菌性叶斑病菌无关(非专利文献2)。
另外，与Gassmann等不同的另一研究小组将拟南芥生态型Nd-1和Ct-1的RCH2(在文献中称为RRS1-R)鉴定为针对感染茄科和十字花科植物的青枯病菌(作为土壤病原细菌的青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum))的抗性基因(非专利文献3～5)。另一方面，该研究小组认定RPS4与针对青枯病菌的抗性无关(非专利文献4)。
这样，对于RPS4和RCH2，一直以来被鉴定为与炭疽病菌不同的病原体的抗性基因，但本发明者们弄清楚了其作为针对炭疽病菌的抗性基因发挥功能。
而且，本发明者们分析了各种生态型中抗性、敏感性与两基因的关系，结果弄清楚了，为了诱导针对炭疽病菌、番茄细菌性叶斑病菌、青枯病菌的抗性，RPS4和RCH2两者都是必须的。
该结果颠覆了RPS4和RCH2分别与青枯病菌和番茄细菌性叶斑病菌无关的一直以来的报告，并且改变了一直以来关于植物对病原体的抵抗反应的机制的看法。
即，根据Flor所主张的基因对基因学说，认为植物对病原体的抵抗反应是由植物的抗性基因和对应的病原体的无毒基因(Avr-基因)的1对1的组合所决定的(非专利文献6)，但本发明者们在世界上首次发现了，拟南芥的基因组上相邻的2种不同的抗性基因识别3种不同的病原体的攻击而引发抵抗反应。根据本发明，弄清楚了植物的免疫***也与动物同样地，通过少数基因的组合来识别多样的病原体，从而启动防御体系。
即，本发明是基于植物对病原体的抵抗反应中的新机制的发现而做出的，更详细地说，本发明如下。
<1>赋予植物以针对2种以上病原菌的抗性的方法，其特征在于，将2种以上基因的组合导入植物中，所述基因单独不赋予植物以针对2种以上病原菌的抗性，但通过上述组合来赋予植物以针对这些病原菌的抗性。
<2>根据<1>所述的方法，其中，病原菌是十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌，基因的组合是RPS4基因和RCH2基因的组合。
<3>根据<2>所述的方法，其中，RPS4基因和RCH2基因来源于选自Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0中的拟南芥生态型。
<4>根据<2>或<3>所述的方法，其中，病原菌还包含青枯病菌。
<5>被赋予了针对2种以上病原菌的抗性的转化植物体，该转化植物体如下获得：将2种以上基因的组合导入植物中，所述基因单独不赋予植物以针对2种以上病原菌的抗性，但通过上述组合来赋予植物以针对这些病原菌的抗性。
<6>根据<5>所述的转化植物体，其中，病原菌是十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌，基因的组合是RPS4基因和RCH2基因的组合。
<7>根据<6>所述的转化植物体，其中，RPS4基因和RCH2基因来源于选自Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0中的拟南芥生态型。
<8>根据<6>或<7>所述的转化植物体，其还具有针对青枯病菌的抗性。
<9>转化植物体，其是<5>～<8>的任一项所述的转化植物体的后代或克隆。
<10><5>～<9>的任一项所述的转化植物体的部分或繁殖材料。
发明的效果
根据本发明，可以通过将多种不同抗性基因的组合导入植物中，从而使植物识别多种不同病原体的攻击，引发抵抗反应。如果利用本发明者们发现的植物中的抗病性的机制，则可以制成对广泛的病害显示抗性的植物。例如，可以通过将抗病性基因RPS4和RCH2同时导入植物，从而赋予植物以针对十字花科蔬菜类炭疽病菌、细菌性叶斑病菌、青枯病菌的抗性。由此，可以保护作物免受由十字花科蔬菜类炭疽病菌、细菌性叶斑病菌、青枯病菌造成的病害，提高十字花科作物和/或茄科作物等的生产效率。另外，已经报告了一般如果单独导入抗病性基因则植物矮小化的事例，但根据本发明，通过多种基因的组合，可以避免这种抗性植物制造中的植物矮小化的问题。
附图说明
图1是通过SSLP(简单序列长度多态性(simple sequence lengthpolymorphism))分析来显示抗性基因存在区域的压缩后的图。在拟南芥生态型(Ws-0)中，抗性基因At5g45250和At5g45260相邻存在。CIW9、N01-K9E15、nga129、N01-MLN1、N01-K17O22、N01-K11I1表示SSLP标记。
图2是显示拟南芥生态型Ws-0、Col-0、来源于Fedoroff氏的No-0的突变体的图。
图3是显示拟南芥生态型Ws-0与Col-0中的At5g45260的氨基酸序列的比较的图。Col-0的At5g45260相对于Ws-0，图中的箭头部分的序列的83个氨基酸缺失。
图4A是显示At5g45260中的突变与针对细菌性叶斑病的抗性的关系的分析结果的图，显示炭疽病菌抗性的生态型Ws-0中的At5g45260(RCH2)被破坏的影响。图中，Ws-0、Col-0、RLD-0分别表示野生型。另外，“rch2-2”(ΔAt5g45260-2)和“rch2-1”(ΔAt5g45260-1)表示Ws中的At5g45260的破坏体(2例)。
图4B是显示At5g45250中的突变与针对细菌性叶斑病的抗性的关系的分析结果的图，显示炭疽病菌抗性的生态型Ws-0中At5g45250(RPS4)被破坏的影响和生态型RLD中导入了At5g45250的影响。图中，Ws-0、Col-0、RLD-0分别表示野生型。另外，“rps4-21”(ΔAt5g45250-21)表示Ws-At5g45250的破坏体，“rps4-21-C9”和“rps4-21-C11”表示在Ws-At5g45250的破坏体中再导入Ws-At5g45250而得的回复体(2例)，“RLD/RPS4-Ws-2”和“RLD/RPS4-Ws-3”表示在RLD-0中导入了Ws-At5g45250的转化体(2例)。
图5A～图5G是显示At5g45250和At5g45260中的突变与针对青枯病的抗性的关系的分析结果的照片(生物的形态)。图中，Nd-1(抗性)、Ws-0(中度抗性)、No-0(抗性)、Col-0(敏感性)表示野生型。rps4-31(ΔAt5g45250-31)表示来源于Fedoroff氏的No-0中At5g45250被破坏了的突变体，对青枯病菌是敏感性的。rps4-21(ΔAt5g45250-21)表示Ws-0中At5g45250被破坏了的突变体，对青枯病菌是敏感性的。rch2-1(ΔAt5g45260-1)表示Ws-0中At5g45260被破坏了的突变体，对青枯病菌是敏感性的。
图6A～图6D是显示在拟南芥的炭疽病菌敏感性的生态型Col-0、RLD-0中导入了抗性基因的结果的照片(生物的形态)。Ws-At5g45250/Col-0是在野生型Col-0中导入了抗性基因Ws-At5g45250的转化体。Ws-At5g45250/RLD是在野生型RLD-0中导入了抗性基因Ws-At5g45250的转化体。No-0-At5g45260/Col-0是在野生型Col-0中导入了抗性基因来源于Fedoroff氏的No-0-At5g45260的转化体。
图7显示利用本发明者们所分析的数据和拟南芥的SNP分析数据(非专利文献10)进行At5g45250和At5g45260的氨基酸序列的***树分析的结果。
图8是接着图7的图。
图9显示RPS4(At5g45250)中各生态型之间的氨基酸序列的比较。图中显示了在各生态型之间不保守的氨基酸。在对十字花科蔬菜类炭疽病、细菌性叶斑病和青枯病全部为敏感性的RLD-0中，第950位的酪氨酸被置换成组氨酸。
图10显示RCH2(At5g45260)中各生态型之间的氨基酸序列的比较。在第1-1290位的氨基酸区域中，以Col-0的氨基酸序列为基准，显示了在各生态型之间不保守的氨基酸。在第1291-1379位的氨基酸区域中，显示了在各生态型之间不保守的氨基酸。在对炭疽病菌为敏感性的生态型(Ler-1，Lov-5，C24)中，第775位的酪氨酸被置换成天冬酰胺。从Col-0的WRKY结构域到C末端侧约有80-90个氨基酸缺失(图3)。对炭疽病菌为敏感性的生态型Cvi-0、Bur-0也与Col-At5g45260同样地在C末端侧被确认了缺失。
图11是接着图10的图。
图12是显示在拟南芥中的炭疽病菌敏感性的生态型Col-0中导入抗性基因的结果的照片(生物的形态)。Ws-At5g45250/Col-0是在野生型Col-0中导入了抗性基因Ws-At5g45250的转化体。Ws-At5g45250·At5g45260/Col-0是在Ws-At5g45250/Col-0中导入了抗性基因Ws-At5g45260的转化体。
图13是显示对图12所示的Ws-At5g45250·At5g45260/Col-0喷雾接种炭疽病菌6天后的病征的照片(生物的形态)。
图14是显示在十字花科作物小松菜中的炭疽病菌敏感性品种“おそめ”中导入抗性基因的结果的照片(生物的形态)。Ws-At5g45260/小松菜是在野生型小松菜中导入了拟南芥的抗性基因Ws-At5g45260的转化体。Ws-At5g45250·At5g45260/小松菜是在野生型小松菜中同时导入了拟南芥的抗性基因Ws-At5g45250和Ws-At5g45260的转化体。图中表示对野生型小松菜和转化小松菜喷雾接种炭疽病菌6天后的病斑。
具体实施方式
本发明是基于通过多种不同抗性基因的组合，来识别多种不同病原体的攻击，引发抵抗反应这样的对于植物针对病原体的抵抗反应的全新见解而做出的。因此，本发明的方法是赋予植物以针对2种以上病原菌的抗性的方法，其特征在于，将2种以上基因的组合导入植物中，所述基因单独不赋予植物以针对2种以上病原菌的抗性，但通过上述组合来赋予植物以针对这些病原菌的抗性。
作为本发明中的“赋予植物以针对2种以上病原菌的抗性的基因的组合”，只要是通过上述机制来引发植物针对病原体的抵抗反应的组合即可，不特别限制。例如，在病原菌是十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌的情况下，可列举RPS4基因和RCH2基因的组合。这里所谓“十字花科蔬菜类炭疽病”，是指以希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum)等霉菌(丝状真菌)为病原而引发的疾病，是在小松菜、芜青、白菜、萝卜等十字花科作物中发生的疾病。另外，所谓“番茄细菌性叶斑病”，是指以丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)等细菌为病原而引发的疾病，是主要在茄科植物和拟南芥中发生的疾病。作为通过利用RPS4基因和RCH2基因的组合来赋予植物以抗性的对象的病原菌，还可列举青枯病菌。“青枯病”是以青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)等细菌为病原而引发的疾病，主要使茄子、番茄等茄科作物、萝卜等十字花科作物、草莓等200余种植物受到感染、灾害。在日本，到目前为止已知20科38种植物发生本病(非专利文献9)。
作为本发明中使用的RPS4基因和RCH2基因，只要是来源于对十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌为抗性的生态型植物的基因即可，不特别限制。例如，作为RPS4基因和RCH2基因的来源的优选拟南芥生态型，可列举Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0(参照图7～图11)。拟南芥的RPS4基因和RCH2基因分别被赋予了At5g45250和At5g45260的AGI代码，关于它们的具体序列可以从非专利文献10或POLYMOLPH的网址“http://polymorph.weigelworld.org/”提取。此外，关于RPS4基因，将来源于拟南芥生态型Ws-0的DNA的碱基序列示于序列号：1，将其蛋白质的氨基酸序列示于序列号：2，将来源于拟南芥生态型No-0(Fedoroff氏：非专利文献11)的DNA的碱基序列示于序列号：5，将其蛋白质的氨基酸序列示于序列号：6，将来源于拟南芥生态型Nd-1的DNA的碱基序列示于序列号：9，将其蛋白质的氨基酸序列示于序列号：10。关于RCH2基因，将来源于拟南芥生态型Ws-0的DNA的碱基序列示于序列号：3，将其蛋白质的氨基酸序列示于序列号：4，将来源于拟南芥生态型No-0(Fedoroff氏：非专利文献11)的DNA的碱基序列示于序列号：7，将其蛋白质的氨基酸序列示于序列号：8，将来源于拟南芥生态型Nd-1的DNA的碱基序列示于序列号：11，将其蛋白质的氨基酸序列示于序列号：12。
在赋予植物以针对青枯病的抗性的情况下，特别优选使用来源于拟南芥的抗性生态型Nd-1、No-0(Fedoroff氏：非专利文献11)、和中度抗性的Ws-0的RPS4基因和RCH2基因的组合。
而且，本发明中还可以使用编码与由这些来源于拟南芥的RPS4基因或RCH2基因所编码的蛋白质在结构上类似的蛋白质的DNA(例如，上述RPS4基因和RCH2基因的突变体或除拟南芥以外的植物中的同源基因)。编码与由RPS4基因或RCH2基因所编码的蛋白质在结构上类似的蛋白质的DNA包含下述DNA：(i)编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质具有在由上述来源于对十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌为抗性的生态型的拟南芥品种的RPS4基因或RCH2基因所编码的蛋白质的氨基酸序列中，替换、缺失、***和/或添加1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列；(ii)与包含上述来源于对十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌为抗性的生态型拟南芥品种的RPS4基因或RCH2基因的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA；(iii)编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与由上述来源于对十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌为抗性的生态型拟南芥品种的RPS4基因或RCH2基因所编码的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。对于RPS4基因或编码与由该基因所编码的蛋白质在结构上类似的蛋白质的DNA、和RCH2基因或编码与由该基因所编码的蛋白质在结构上类似的蛋白质的DNA的组合，只要能够通过对植物导入该组合来至少赋予植物以针对十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌的抗性即可，不特别限制。
这里进行替换等的“多个氨基酸”通常为1～30个氨基酸以内，优选为1～10个氨基酸以内，更优选为1～5个氨基酸以内，更优选为1～3个氨基酸以内。对于能够替换、缺失、添加和/或***氨基酸的区域，只要能够维持上述抗性即可，不特别限定。所谓“严格条件”，是指钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，且温度为42～68℃、优选为42～65℃。例如，5×SSC(83mM NaCl、83mM柠檬酸钠)、温度为42℃。所谓“90％以上的同源性”，是指氨基酸序列整体的90％以上、优选为95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)的序列的同源性。氨基酸序列、碱基序列的同源性使用Karlin和Altschul开发的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，2264-2268.、Karlin，S.& Altschul，SF.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，5873.)来确定。还开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul，SF.等人，J Mol Biol，1990，215，403.)。在使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如得分(score)＝100、字长(wordlength)＝12。另外，在使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为得分＝50、字长＝3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
上述编码与由RPS4因或RCH2因所编码的蛋白质在结构上类似的蛋白质的DNA，可以通过本领域技术人员公知的方法来调制，所述方法例如，杂交技术(Southern，EM.，J Mol Biol，1975，98，503.)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki，RK.等人，Science，1985，230，1350.、Saiki，RK.等人，Science，1988，239，487.)、或对该DNA通过定点诱变法(Kramer，W.&Fritz，HJ.，Methods Enzymol，1987，154，350.)引入突变的方法。另外，在自然界也会发生由于碱基序列的突变而引起所编码的蛋白质的氨基酸序列的突变。这些DNA的形态包括基因组DNA、cDNA和化学合成DNA，可以利用常用方法来制备。
关于由此制备的DNA的组合是否能赋予植物以针对病原菌的抗性，可以如下评价：制作导入了这些DNA的组合的转化植物体，研究该转化植物体在暴露于病害胁迫的状态下是否能抑制疾病发生。
可以如下制作转化体植物体：例如，将本发明的DNA的组合***到能保证在植物内表达的载体中，利用该载体在植物体内表达本发明的DNA的组合。作为载体中所用的启动子，不限于在天然状态下控制本发明的DNA的表达的固有启动子。例如，可以使用在植物中被广泛应用的来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子。转化对象可以是整个植物体，还可以是植物器官(例如种子、叶、花瓣、茎、根等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束等)或植物培养细胞。作为转化中所用的植物，从本发明的目的出发，对十字花科蔬菜类炭疽病菌和番茄细菌性叶斑病菌为敏感性的植物(生态型)是适合的。作为植物种类，可列举例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、白菜、小松菜、芜青(以上为Brassica rapa)、卷心菜(Brassica oleracea)、油菜籽(Brassica napus)、萝卜(Raphanus sativus)等十字花科植物，番茄(Solanum lycopersicum L.)、茄子(Solanummelongena)、柿子椒(Capsicum annuum cv.Grossum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、烟草(Nicotiana tabacum)等茄科植物，菊科的菊(Chrysanthemum morifolium)、芭蕉科的香蕉(Musa spp.、Musa acuminata、Musa balbisiana)、蔷薇科的草莓(Fragaria ananassa)、葫芦科的蔓荔枝(苦瓜)(Momordica charantia L.var.pavel Crantz)等，但不限于这些例示出的植物。
上述表达载体可以通过常规的转化方法，例如电穿孔法、农杆菌法、基因枪法、PEG法等导入植物中。例如，在使用电穿孔法时，利用具备脉冲控制仪的电穿孔装置，在电压500～1600V、25～1000μF、20～30msec的条件下进行处理，从而将基因导入宿主中。另外，在使用基因枪法时，可以直接使用植物体、植物器官、植物组织本身，也可以制备切片然后使用，还可以制备原生质体来使用。可以使用基因导入装置(例如Bio-Rad社的PDS-1000/He等)处理这样制备的样品。处理条件根据植物或样品不同而不同，通常以1000～1800psi左右的压力、5～6cm左右的距离进行。
另外，可以通过利用植物病毒作为载体，从而将本发明的DNA导入植物体中。作为可利用的植物病毒，可列举例如花椰菜花叶病毒。即，首先，将病毒基因组***来源于大肠杆菌的载体等中来制备重组体，然后在病毒的基因组中***这些目标DNA。可以将这样被修饰后的病毒基因组用限制性酶从重组体上切下，接种到植物宿主中，从而将目标DNA导入植物宿主中。
在利用农杆菌的Ti质粒的方法中，利用属于农杆菌属(Agrobacterium)的细菌一旦感染植物，就会使其所具有的质粒DNA的一部分转移到植物基因组中这样的性质，可以将目标DNA导入植物宿主中。属于农杆菌属的细菌中的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物形成被称为冠瘿的肿瘤，另外，发根农杆菌(Agrobacteriumu rhizogenes)感染植物产生毛状根。这是由于，这些农杆菌在感染时，被称为Ti质粒或Ri质粒的各细菌中所存在的质粒上的被称为T-DNA区域(转移DNA(TransferredDNA))的区域转移到植物中，并整合到植物的基因组中的缘故。只要在Ti或Ri质粒上的T-DNA区域中***想要整合到植物基因组中的DNA，就可以在农杆菌属细菌感染植物宿主时将目标DNA整合到植物基因组中。
转化获得的肿瘤组织和/或幼芽、毛状根等可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养，还可以使用现有公知的植物组织培养法，通过加入适当浓度的植物激素(植物生长素、细胞***素、赤霉素、脱落酸、乙烯、芸苔素内酯(brassinolide)等)等，从而使其再生成植物体。
作为由上述转化植物细胞等再生出转化植物体的再生方法，可采用例如，将愈伤组织状的转化细胞转移到改变了激素的种类、浓度的培养基中培养，使其形成不定胚，从而获得完整的植物体的方法。作为所使用的培养基，可例示LS培养基、MS培养基等。作为本发明中的转化植物体的制造工序，包括将***有本发明的DNA的植物表达载体导入宿主细胞而获得转化植物细胞，再由该转化植物细胞再生出转化植物体的工序。
另外，导入有本发明的DNA的转化植物体还可以通过杂交来制造。即，通过使保持本发明的DNA(抗性型基因)的植物、和可与该植物杂交且未保持本发明的DNA的植物杂交，从而在未保持本发明的DNA的植物中导入本发明的DNA，赋予其针对病原菌的抗性。
只要获得了染色体内导入有本发明的DNA的转化植物体，就可以由该植物体通过有性生殖或无性生殖获得后代。另外，还可以由该植物体和/或其后代或克隆获得种子等，以它们为基础来大量生产该植物体。
另外，对于本发明的转化植物体的部分，例如，可以制成农作物供给食用等。本发明包括本发明的转化植物体的“部分或繁殖材料”，例如，植物器官(例如种子、叶、花瓣、茎、根等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束等)或植物培养细胞。
为了从转化植物体获得植物种子，例如，从发根培养基中采摘转化植物体，移栽到加入了含水的土壤的盆中，使其在一定温度下生长，开花，并最终形成种子。另外，为了由种子生产植物体，例如，在转化植物体上所形成的种子成熟之后，将种子分离并播种到含水的土壤中，使其在一定温度、照度下生长，从而生产植物体。这样育种而得的植物通过表达所导入的DNA的组合，而成为获得了针对多种病原菌的抗性的病害胁迫耐性植物。
实施例
以下，使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于以下实施例。
〔实施例1〕通过SSLP(简单序列长度多态性(simple sequence lengthpolymorphism))分析来探索抗性基因
使对十字花科蔬菜类炭疽病菌(希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum))为抗性的拟南芥生态型Wassilewskiia(Ws-0)、与敏感性的Columbia(Col-0)杂交，从而得到F1种子。再使F1个体自花受粉而获得F2种子。对播种后栽培4周的拟南芥F1植物(22℃、12小时光周期/12小时暗周期的循环)喷雾接种5x105个/ml的炭疽病菌孢子悬浮液，6天后进行鉴定，结果全部显示抗性。接着，对同样栽培的F2植物喷雾接种5x105个/ml的炭疽病菌孢子悬浮液，结果抗性个体数与敏感性个体数以3∶1分离，由此判明了抗性是显性的，且该抗性由单基因支配或由相邻的多个基因支配。因此，可预想，在从上述F2组中筛选出具有对病原菌为敏感性的表型的个体时，该个体以纯合的方式具有对应于Ws-0的目标基因座的Col-0的基因(等位基因)。因此，还可以预想，在用多态性标记研究根据表型筛选出的大量F2个体的染色体结构时，在基因型显示纯合的Col型的频率最高的区域附近存在目标基因的等位基因。基于该预想，为了鉴定目标基因而进行了SSLP分析，结果成功地将目标基因的存在区域压缩至多态性标记N01-K11I1与N01-K17O22所夹的区域(图1)。
〔实施例2〕RPS4基因(At5g45250)和RCH2基因(At5g45260)中的突变与对炭疽病菌的抗性的关系的分析
在实施例1的方法中，无法制作能够用于进一步压缩目标基因的存在区域的多态性标记，因SSLP分析存在界限。因此，使用抗性生态型Ws-0的T-DNA***文库，对约3万个系进行筛选，结果获得了8个针对炭疽病为敏感性的T-DNA***突变体。对这些突变体的Ws-At5g45250和Ws-At5g45260的碱基序列进行分析，结果发现了在这些基因中引入了突变的突变体。在At5g45250中有5个碱基缺失的突变体ΔAt5g45250-21、以及在At5g45260中***了T-DNA标签的突变体ΔAt5g45260-1和ΔAt5g45260-2对炭疽病菌显示敏感性(图2“Ws-0突变体”)。
对于Ws-At5g45250，已由本发明者们阐明其为抗性基因(特愿2007-86343)，对于At5g45260，猜想其可能为抗性基因。因此，比较了对炭疽病菌为抗性的生态型Ws-0与敏感性的生态型Col-0中的At5g45260的氨基酸序列(图3)。在Col-At5g45260中，从WRKY结构域到C末端侧约有80～90个氨基酸缺失。与Col-At5g45260同样地在C末端侧被确认了缺失的生态型Cvi-0、Bur-0也对炭疽病菌显示敏感性。由此可判明，At5g45260也与对炭疽病菌的抗性有关，为了获得该抗性，至少从At5g45260WRKY结构域到C末端侧的约80～90氨基酸的存在是重要的。
而且，在对炭疽病菌为敏感性的生态型(Ler-1、Lov-5、C24)中，第775位的酪氨酸被替换成了天冬酰胺。这显示该氨基酸对抗性是重要的(图10～图11)。
〔实施例3〕At5g45250和At5g45260中的突变与对具有avrRps4基因的细菌性叶斑病菌的抗性的关系的分析
使用已知也会感染拟南芥的具有avrRps4基因的番茄细菌性叶斑病菌(丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato))来研究针对植物病原菌的抗性。将细菌性叶斑病菌在添加了卡那霉素(25μg/ml)和利福平(25μg/ml)的金氏B(King’s B)液体培养基中振荡培养过夜。将菌体悬浮液制成1×105(cfu)/ml，将该菌液接种到播种后栽培7周的拟南芥(22℃、8小时光周期/16小时暗周期的循环)的莲座叶的背面，该接种是通过挤压无针的1ml注射器来施加压力，将菌液注入叶中，从而接种病原菌。在接种后第3天用打孔器剜下接种叶，在10mM MgSO4溶液中破碎，将菌体悬浮液接种到固体培养基上，计数2天后出现的菌落数，从而测定出每单位叶面积的菌的增殖量。将接种了番茄细菌性叶斑病菌的植物(野生株、过表达体、基因破坏体)的敏感度(病原细菌的增殖)的结果示于图4A和图4B。
(1)At5g45260与对细菌性叶斑病的敏感度的关系(图4A)
At5g45260被破坏的突变体与Ws-0野生型相比，菌的增殖较多，对细菌性叶斑病的敏感度提高。
(2)At5g45250与对细菌性叶斑病的敏感度的关系(图4B)
At5g45250被破坏的突变体与Ws-0野生型相比，菌的增殖也较多，细菌性叶斑病的敏感度也提高。另外，在At5g45250被破坏的突变体中转化包含约2kb的启动子区域的约6kb的Ws-At5g45250基因而得的回复体与Ws-0野生型同样地显示抗性。另外，在对炭疽病菌和细菌性叶斑病为敏感性的生态型RLD中导入了包含约2kb的启动子区域的约6kb的Ws-At5g45250基因的转化体对细菌性叶斑病显示强的抗性。
由以上结果可判明，在对细菌性叶斑病的抗性表达中At5g45250和At5g45260两者也都是必须的。到目前为止报告了仅At5g45250与对细菌性叶斑病的抗性表达相关(非专利文献2)，但本结果显示，At5g45260也与对细菌性叶斑病的抗性表达相关。特别是，由于在作为在已报告的拟南芥生态型中唯一的敏感性生态型的RLD-0中，通过导入Ws-At5g45250而获得了对细菌性叶斑病和炭疽病菌的抗性，因此明确了其本来具有对这些病原菌为抗性的At5g45260，敏感性的原因在于At5g45250。
〔实施例4〕拟南芥生态型No-0和Ws-0的At5g45250和At5g45260中的突变与对炭疽病菌和青枯病菌的抗性的关系的分析
首先，对于已报告对青枯病菌为抗性的来源于Fedoroff氏的No-0(非专利文献12)，研究其对炭疽病菌、细菌性叶斑病的抗性。其结果是，该生态型对这两种病原菌显示抗性。因此，使用No-0中的转座子突变体，研究了At5g45250和At5g45260中的突变与对这些病原菌的抗性的关系(图2“来源于Fedoroff氏的No-0转座子突变体”)。其结果是，在At5g45250中***有转座子标签的突变体ΔAt5g45250-31(rps4-31)对炭疽病菌显示敏感性。另外，在At5g45250的启动子区域和At5g45260中***有转座子标签的突变体ΔAt5g45250-60-1也对炭疽病菌显示敏感性。在拟南芥生态型No-0(来源于Fedoroff氏)中，At5g45250和At5g45260也与对炭疽病菌的抗性相关。
制备1×108(cfu)/ml的青枯病菌悬浮液。对播种后在石棉上栽培了7周的拟南芥(22℃、8小时光周期/16小时暗周期的循环)连同石棉将根切断，将20ml以上上述菌液灌注入断根部分。接种后第7天鉴定发病。接种了青枯病菌的植物(野生株、基因破坏体)的敏感度的结果示于图5A～图5G。
生态型Nd-1、No-0、Ws-0对青枯病为抗性(图5A～图5C)、Col-0为敏感性(图5D)。ΔAt5g45250-60-1被报告对青枯病菌为敏感性(非专利文献12)。根据本发明，证明了在来源于Fedoroff氏的No-0的At5g45250中***有标签的突变体ΔAt5g45250-31(rps4-31)对青枯病菌为敏感性(图5E)。在生态型Ws-0的At5g45250中有5个碱基缺失的突变体ΔAt5g45250-21(rps4-21)、以及在At5g45260中***有T-DNA标签的突变体ΔAt5g45260-1(rch2-1)对青枯病菌显示强的敏感性(图5F～图5G)。由以上结果显示，如果将来源于Fedoroff氏的No-0和Ws-0的At5g45250和At5g45260转化到对这些病原菌为敏感性的植物中，则可以制作对炭疽病菌、细菌性叶斑病和青枯病菌为抗性的植物。
〔实施例5〕在拟南芥的炭疽病菌敏感性的生态型Col-0、RLD-0中导入抗性基因、以及其效果
在拟南芥中的炭疽病菌敏感性的生态型Col-0、RLD-0中导入炭疽病菌抗性的生态型Ws-0的At5g45250或At5g45260，研究是否获得了对炭疽病菌的抗性(图6A～图6D)。其结果是，在野生型Col-0中导入抗性基因Ws-At5g45250而得的转化体对该菌显示抗性，但植物发生了矮小化(图6B)。另外，在野生型RLD中导入抗性基因Ws-At5g45250而得的转化体正常生长，并且对该菌显示抗性(图6C)。在野生型Col-0中导入作为抗性基因的来源于Fedoroff氏的No-0-At5g45260而得的转化体正常生长，并且对该菌显示抗性(图6D)。由以上结果可判明，野生型Col-0即使导入了炭疽病菌抗性型的Ws-At5g45250，也不能稳定维持，但导入了炭疽病菌抗性型的来源于Fedoroff氏的No-0-At5g45260的转化体能够在植物体内稳定维持，并对炭疽病菌显示抗性。RLD-0本来具有抗性型的At5g45260，通过导入抗性型的Ws-At5g45250，从而能在植物体内稳定维持，并对炭疽病菌显示抗性。这样通过导入2种不同的抗性基因，可以制作对炭疽病菌显示抗性的植物。
此外，本领域技术人员容易理解：导入了来源于Fedoroff氏的No-0-At5g45260的Col-0具有对细菌性叶斑病为抗性的At5g45250和对青枯病为抗性的At5g45260，因此对细菌性叶斑病和青枯病也显示抗性。
〔实施例6〕各种拟南芥生态型中对炭疽病的敏感度与At5g45250和At5g45260的氨基酸序列的关系
对于拟南芥生态型，研究对炭疽病的敏感度(图7～图8)。对于这些生态型，利用拟南芥的SNP分析数据(非专利文献10)，进行At5g45250和At5g45260的氨基酸序列的***树分析(图7～图8)。对于At5g45250，对炭疽病为敏感性和抗性的生态型混合存在而被分类。将具有At5g45250的各生态型的氨基酸序列进行比较，结果是在对十字花科蔬菜类炭疽病、细菌性叶斑病和青枯病全部为敏感性的RLD-0中，第950位的酪氨酸被替换成组氨酸(图9)。因此，制作将对炭疽病为抗性的Ws-0中的Ws-At5g45250的第950位酪氨酸替换成组氨酸的构建体，并导入以Ws-0为背景的Ws-At5g45250破坏体ΔAt5g45250-21(rps4-21)中，结果该转化体对炭疽病显示敏感性，不能回复抗性。因此，显示出本氨基酸对抗性是重要的。另一方面，At5g45260的氨基酸序列的***树分析的结果是，关于At5g45260，敏感性的生态型被分类为1个小组(图7)。该小组(Ler-1、Lov-5、C24)如实施例2所记载的那样，第775位的酪氨酸被替换为天冬酰胺。显示出本氨基酸对抗性是重要的(图10～图11)。
〔实施例7〕在拟南芥中的炭疽病菌敏感性的生态型Col-0中导入来源于生态型Ws-0的At5g45250和At5g45260、以及其效果
由实施例2～6中的结果显示，在植物对炭疽病菌的抗性中，At5g45250和At5g45260这2种基因是必须的，通过将这2种基因导入炭疽病菌敏感性的生态型的植物中，可以将该植物转换成炭疽病菌抗性的生态型。本发明者们为了在此确认该事实，在拟南芥中的炭疽病菌敏感性的生态型Col-0中导入了炭疽病菌抗性的生态型Ws-0的At5g45250和At5g45260，研究了是否能获得对炭疽病菌的抗性。
其结果正如实施例5(图6B)已经证明的那样，在野生型Col-0中导入抗性基因Ws-At5g45250而得的转化体对该菌显示抗性，但植物发生了矮小化(图12左)。在该矮小化后的转化体中导入来源于炭疽病菌抗性型的生态型Ws-0的Ws-At5g45260而得的转化体在植物体内稳定维持，回避了矮小化而正常生长(图12右)，并且获得了对炭疽病菌的抗性(图13)。以上再次确认了可以通过导入2种不同的抗性基因，来制成对炭疽病菌显示抗性的植物。另外，虽然已经报告了一般如果单独导入抗病性基因则植物矮小化的事例，但再次确认了可以通过组合导入多种基因，从而回避这样的抗性植物制造中的植物矮小化的问题。
此外，本领域技术人员容易理解：同时导入了来源于Ws-0的Ws-At5g45250和Ws-At5g45260的Col-0具有对细菌性叶斑病为抗性的Ws-At5g45250和对青枯病为抗性的Ws-At5g45260，因此对细菌性叶斑病和青枯病也显示抗性。
〔实施例8〕在小松菜中的炭疽病菌敏感性的品种“おそめ”中导入来源于拟南芥生态型Ws-0的At5g45250和At5g45260、以及其效果
由实施例2～6中的结果显示，在植物对炭疽病菌的抗性中，At5g45250和At5g45260这2种基因是必须的，通过将这2种基因导入炭疽病菌敏感性的生态型的植物中，可以将该植物转换成炭疽病菌抗性的生态型。本发明者们为了再次确认该事实，在小松菜中的炭疽病菌敏感性的品种“おそめ”中导入了炭疽病菌抗性的拟南芥生态型Ws-0的At5g45250和At5g45260，研究了是否能获得对炭疽病菌的抗性。
其结果是，在野生型小松菜中导入Ws-At5g45250而得的转化体大多数发生了矮小化，不能维持个体，好不容易生长出的个体也发生了植物矮小化。另外，在野生型小松菜中导入抗性基因Ws-At5g45260而得的转化体不能够稳定地获得对炭疽病菌的抗性(图14右)。另一方面，在野生型小松菜中同时导入拟南芥生态型Ws-0的At5g45250和At5g45260而得的转化体在植物体内稳定维持，植物也正常生长，并且变成对炭疽病菌为抗性(图14左)。以上结果再次确认了可以通过导入2种不同的抗性基因，来制成对炭疽病菌显示抗性的植物。另外，虽然已经报告了一般如果单独导入抗病性基因则植物矮小化的事例，但再次确认了可以通过组合导入多种基因，从而回避这样的抗性植物制造中的植物矮小化的问题。
此外，本领域技术人员容易理解：导入了来源于Ws-0的Ws-At5g45250和Ws-At5g45260的小松菜具有对细菌性叶斑病为抗性的Ws-At5g45250和对青枯病为抗性的Ws-At5g45260，因此对细菌性叶斑病和青枯病也显示抗性。
产业可利用性
本发明适合用于例如白菜、小松菜、芜青、卷心菜、油菜籽、萝卜等十字花科作物和/或番茄、茄子、柿子椒、马铃薯等茄科植物的育种领域，通过利用本发明，可以保护这些作物免受由十字花科蔬菜类炭疽病菌、斑细菌病菌和青枯病菌造成的病害，从而可以提高其生产效率。
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Claims (4)

1.赋予植物以针对炭疽病菌和细菌性叶斑病菌的抗性的方法，其特征在于，将RPS4基因和RSH4基因的组合导入植物中，所述植物是十字花科植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，RPS4基因和RSH4基因来源于选自Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0中的拟南芥生态型。
3.赋予植物以针对炭疽病菌、细菌性叶斑病菌和青枯病菌的抗性的方法，其特征在于，将RPS4基因和RSH4基因的组合导入植物中，所述植物是十字花科植物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，RPS4基因和RSH4基因来源于选自Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0中的拟南芥生态型。
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