JPWO2010013738A1 - 複数の病害に対して抵抗性を示す植物及びその作出法 - Google Patents
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Abstract
Description
アブラナ科野菜類炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)に抵抗性のシロイヌナズナ生態型Wassilewskija(Ws-0)と、感受性のColumbia(Col-0)を交配し、F1種子を得た。さらにF1個体を自家受粉させてF2種子を得た。播種後4週間栽培したシロイヌナズナF1植物(22℃、12時間の明期/12時間の暗期のサイクル)に5x105個/mlの炭疽病菌胞子懸濁液を噴霧接種し、6日間後に検定したところ、全てが抵抗性を示した。次に同様に栽培したF2植物に5x105個/mlの炭疽病菌胞子懸濁液を噴霧接種したところ、抵抗性個体数と感受性個体数が3:1に分離し、抵抗性が優性で、この抵抗性は1遺伝子支配又は近接する複数の遺伝子支配であることが判明した。このため、上記F2集団から病原菌に対して感受性の表現型をもつ個体を選抜したとき、その個体はWs-0の標的遺伝子座に対するCol-0の遺伝子(アリル)をホモザイガスでもつことが予想された。従って、表現型によって選抜された多数のF2個体の染色体構造を多型マーカーによって調べたとき、遺伝子型がホモでCol型を示す頻度が最も高い領域付近に、標的遺伝子のアリルが存在することも予想された。この予想に基づき、標的遺伝子を同定すべく、SSLP解析を行った結果、多型マーカーN01-K11I1とN01-K17O22で挟まれた領域までは、標的遺伝子の存在領域を絞り込むことに成功した(図1)。
実施例1の方法では、これ以上、標的遺伝子の存在領域を絞り込むことに利用できる多型マーカーの作製ができず、SSLP解析に限界が生じた。そこで、抵抗性生態型Ws-0のT-DNA挿入ライブラリーを用いて、約3万ラインをスクリーニングした結果、炭疽病に対して感受性になったT-DNA挿入変異体を8個体得た。これら変異体のWs-At5g45250とWs-At5g45260の塩基配列を解析したところ、これら遺伝子に変異が導入された変異体が発見された。At5g45250中に5塩基の欠損のある変異体ΔAt5g45250-21、並びにAt5g45260中にT-DNAタグが挿入された変異体ΔAt5g45260-1及びΔAt5g45260-2は炭疽病菌に感受性を示した(図2「Ws-0変異体」)。
植物病原菌に対する抵抗性を、シロイヌナズナにも感染することが知られているavrRps4遺伝子を有するトマト斑葉細菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)を用いて調べた。斑葉細菌をカナマイシン(25μg/ml)及びリファンピシン(25μg/ml)を添加したKing's B液体培地中で一晩振とう培養した。菌懸濁液を1×105(cfu)/mlに調製し、この菌液を播種後7週間栽培したシロイヌナズナ(22℃、8時間の明期/16時間の暗期のサイクル)のロゼット葉の裏側に、針がない1mlシリンジを押しつけて圧力をかけ、菌液を葉中へ注入することで病原菌を接種した。接種後3日目に接種葉をコルクポーラーでくりぬいて、10mM MgSO4液中で破砕し、菌懸濁液を固形培地に蒔いて2日後に出現したコロニー数をカウントすることで、葉面積当たりの菌の増殖を測定した。トマト斑葉細菌を接種した植物(野生株、過剰発現体、遺伝子破壊体)の感受度(病原細菌の増殖)の結果を図4A及び図4Bに示す。
At5g45260が破壊された変異体においては、Ws-0野生型に対して菌の増殖が多く、斑葉細菌病に対して感受度が高まった。
At5g45250が破壊された変異体においても、Ws-0野生型に対して菌の増殖が多く、斑葉細菌病に対して感受度が高まった。また、At5g45250が破壊された変異体にプロモーター領域約2kbを含むWs-At5g45250遺伝子約6kbを形質転換した復帰体は、Ws-0野生型と同様の抵抗性を示した。また、炭疽病菌と斑葉細菌病に感受性の生態型RLDにプロモーター領域約2kbを含むWs-At5g45250遺伝子約6kbを導入した形質転換体は斑葉細菌病に対して強い抵抗性を示した。
まず、青枯病菌に抵抗性であることが報告されているFedoroff氏由来のNo-0(非特許文献12)につき、炭疽病菌、斑葉細菌病に対する抵抗性を検討した。その結果、この生態型は、両病原菌に対して抵抗性を示した。そこで、No-0におけるトランスポゾン変異体を用いて、At5g45250とAt5g45260における変異とこれら病原菌に対する抵抗性との関係を調査した(図2「Fedoroff氏由来のNo-0トランスポゾン変異体」)。その結果、At5g45250中にトランスポゾンタグが挿入された変異体ΔAt5g45250-31(rps4-31)は、炭疽病菌に感受性を示した。また、At5g45250のプロモーター領域及びAt5g45260中にトランスポゾンタグが挿入された変異体ΔAt5g45250-60-1も、炭疽病菌に感受性を示した。シロイヌナズナ生態型No-0(Fedoroff氏由来)においても、At5g45250及びAt5g45260が、炭疽病菌に対する抵抗性に関与していた。
シロイヌナズナにおける炭疽病菌感受性の生態型Col-0、RLD-0に、炭疽病菌抵抗性の生態型Ws-0のAt5g45250又はAt5g45260の導入を行い、炭疽病菌に対する抵抗性を獲得するか否か検討した(図6A〜図6D)。その結果、野生型Col-0に抵抗性遺伝子Ws-At5g45250を導入した形質転換体は、本菌に抵抗性を示すが、植物が矮小化してしまった(図6B)。また、野生型RLDに抵抗性遺伝子Ws-At5g45250を導入した形質転換体は、正常に生育するとともに、本菌に抵抗性を示した(図6C)。野生型Col-0に抵抗性遺伝子Fedoroff氏由来のNo-0-At5g45260を導入した形質転換体は、正常に生育するとともに、本菌に抵抗性を示した(図6D)。以上から、野生型Col-0は炭疽病菌に抵抗性型のWs-At5g45250を導入しても、安定的に維持できないが、炭疽病菌に抵抗性型のFedoroff氏由来のNo-0-At5g45260を導入した形質転換体は植物体内で安定に維持され、炭疽病菌に抵抗性になることが判明した。RLD-0は元来抵抗性型のAt5g45260を有しており、抵抗性型のWs-At5g45250を導入することで、植物体内で安定的に維持され、炭疽病菌に抵抗性を示した。このように異なる2つの抵抗性遺伝子を導入することで、炭疽病菌に抵抗性を示す植物が作製できた。
シロイヌナズナ生態型について、炭疽病に対する感受度について調査した(図7〜図8)。これら生態型についてシロイヌナズナのSNP解析データを利用して(非特許文献10)、At5g45250及びAt5g45260のアミノ酸配列の系統樹解析を行った(図7〜図8)。At5g45250については炭疽病に感受性と抵抗性の生態型が混在して分類された。At5g45250における各生態型のアミノ酸配列を比較したところ、アブラナ科野菜類炭疽病、斑葉細菌病、及び青枯病の全てに感受性のRLD-0において950番目のチロシンがヒスチジンに置換されていた(図9)。そこで、炭疽病に抵抗性のWs-0におけるWs-At5g45250の950番目のチロシンをヒスチジンに置換したコンストラクトを作製してWs-0をバックグランドとするWs-At5g45250の破壊体ΔAt5g45250-21(rps4-21)に導入したところ、本形質転換体は炭疽病に感受性を示し、抵抗性を復帰できなかった。従って、本アミノ酸が抵抗性に重要であることが示された。一方、At5g45260のアミノ酸配列の系統樹解析の結果、At5g45260については感受性の生態型が1つのグループに分類された(図7)。このグループ(Ler-1,Lov-5,C24)は実施例2に記載したとおり、775番目のチロシンがアスパラギンに置換されていた。本アミノ酸が抵抗性に重要であることが示された(図10〜図11)。
実施例2から6における結果から、炭疽病菌に対する植物の抵抗性において、At5g45250及びAt5g45260の2つの遺伝子が必須であり、これら2つの遺伝子を炭疽病菌感受性の生態型の植物に導入することで、当該植物を炭疽病菌抵抗性の生態型に転換することが可能であることが示された。本発明者らは、この事実を再確認するために、シロイヌナズナにおける炭疽病菌感受性の生態型Col-0に、炭疽病菌抵抗性の生態型Ws-0のAt5g45250及びAt5g45260の導入を行い、炭疽病菌に対する抵抗性を獲得するか否かを検討した。
実施例2から6における結果から、炭疽病菌に対する植物の抵抗性において、At5g45250及びAt5g45260の2つの遺伝子が必須であり、これら2つの遺伝子を炭疽病菌感受性の生態型の植物に導入することで、当該植物を炭疽病菌抵抗性の生態型に転換することが可能であることが示された。本発明者らは、この事実を再確認するために、コマツナにおける炭疽病菌感受性の品種「おそめ」に、炭疽病菌抵抗性のシロイヌナズナ生態型Ws-0のAt5g45250及びAt5g45260を導入し、炭疽病菌に対する抵抗性を獲得するか否かを検討した。
Claims (10)
- 2以上の病原菌に対する抵抗性を植物に付与する方法であって、単独では、2以上の病原菌に対する抵抗性を植物に付与しないが、2以上の組み合わせにより、これら病原菌に対する抵抗性を植物に付与する遺伝子を、当該組み合わせで植物に導入することを特徴とする方法。
- 病原菌が、アブラナ科野菜類炭疽病菌及びトマト斑葉細菌病菌であり、遺伝子の組み合わせが、RPS4遺伝子とRCH2遺伝子の組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- RPS4遺伝子及びRCH2遺伝子が、Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0からなる群より選択されるシロイヌナズナ生態型に由来する、請求項2に記載の方法。
- 病原菌が、さらに、青枯病菌を含む、請求項2または3に記載の方法。
- 2以上の病原菌に対する抵抗性が付与された形質転換植物体であって、単独では、2以上の病原菌に対する抵抗性を植物に付与しないが、2以上の組み合わせにより、これら病原菌に対する抵抗性を植物に付与する遺伝子を、当該組み合わせで導入された形質転換植物体。
- 病原菌が、アブラナ科野菜類炭疽病菌及びトマト斑葉細菌病菌であり、遺伝子の組み合わせが、RPS4遺伝子とRCH2遺伝子の組み合わせである、請求項5に記載の形質転換植物体。
- RPS4遺伝子及びRCH2遺伝子が、Ws-0、No-0、Nd-1、Aa-0、Eil-0、Rrs-7、Sha、Tamm-2、Tsu-1、Fei-0、Ts-1、Bsch-0、Br-0、Est-1、Rrs-10、Van-0、Nfa-8、Bay-0からなる群より選択されるシロイヌナズナ生態型に由来する、請求項6に記載の形質転換植物体。
- さらに、青枯病菌への抵抗性を有する、請求項6または7に記載の形質転換植物体。
- 請求項5から8のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫又はクローンである、形質転換植物体。
- 請求項5から9のいずれかに記載の形質転換植物体の部分若しくは繁殖材料。
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