JP5246910B2 - アブラナ科野菜類炭疽病菌に抵抗性を示す新規遺伝子及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、アブラナ科野菜類炭疽病菌に抵抗性を示す蛋白質をコードする新規なＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを有する形質転換体及び形質転換植物体、並びに該形質転換植物体の部分若しくは繁殖材料に関する。

植物に病気を引き起こす原因には、伝染性の生物的病原（病原体）と非伝染性の環境的病原とがある。植物の感染病の８０％以上は、糸状菌（カビ・菌類）によって引き起こされ、残りは細菌、ウィルス、ウィロイド、ファイトプラズマ、リケッチア様微生物、線虫、原虫などが原因である。植物は常にこれら病原体の攻撃にさらされており、独自の生体防御反応により病原体の感染から身を守っている。一例として、Ｆｌｏｒの唱える遺伝子対遺伝子説によると、植物側の抵抗性遺伝子産物が菌由来のエリシター（非病原性遺伝子産物）を認識し、病原菌に対する一連の抵抗反応を発現すると考えられている。このような反応は、植物細胞内における刺激の認識及びシグナル伝達の結果として進行する。しかしながら、このメカニズムの詳細については未だ解明されていないのが現状である。
ところでアブラナ科野菜類炭疽病は、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属に属する糸状菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）を病原とし、コマツナ、ハクサイ、ダイコンなどアブラナ科作物に感染し、被害をもたらしている病気である。近年、このアブラナ科野菜類炭疽病菌に抵抗性を示すシロイヌナズナ生態型（エコタイプ）が複数見出されている（非特許文献１）。しかしながら、この抵抗性の原因は、いまだ明らかとなっていない。

Ｙ．Ｎａｒｕｓａｋａ，ｅｔａｌ．，ＭＰＭＩ Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．７，２００４，ｐｐ．７４９−７６２

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アブラナ科植物に対しアブラナ科野菜類炭疽病菌への抵抗性を付与する遺伝子を同定することにある。さらに、本発明は、同定された遺伝子を利用して、アブラナ科野菜類炭疽病菌に抵抗性を示すアブラナ科植物を作出することをも目的とする。

本発明者らは、約４０種類のシロイヌナズナエコタイプを解析した結果、アブラナ科野菜類炭疽病菌に抵抗性の１１種類のエコタイプを同定している（Ｙ．Ｎａｒｕｓａｋａ，ｅｔ ａｌ．，ＭＰＭＩ Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．７，２００４，ｐｐ．７４９−７６２）。アブラナ科野菜類炭疽病菌に対する抵抗性遺伝子を同定すべく、本発明者らは、数種の抵抗性エコタイプと、感受性エコタイプＣｏｌ−０（以下、単に「Ｃｏｌ」と称することがある）を交配し、ＳＳＬＰ法によりマッピングを行った。ところが、ＳＳＬＰの多型マーカーの作成の限界等により、抵抗性遺伝子の同定は困難を極めた。そこで、本発明者らは、ＳＳＬＰ法により絞り込んだ抵抗性遺伝子の推定存在領域から、抵抗性遺伝子の候補となりうる複数の遺伝子を見出し、その単離と感受性エコタイプＣｏｌ−０への形質転換による表現型の解析を試みた。その結果、本発明者らは、抵抗性エコタイプであるＷｓ、及びＥｉｌ−０（以下、単に「Ｅｉｌ」と称することがある）において、５番染色体上の特定の領域に存在する遺伝子が、シロイヌナズナに対し、アブラナ科野菜類炭疽病菌への抵抗性を付与する機能を有することを見出すに至り、本発明を完成した。本発明は、アブラナ科野菜類炭疽病菌に対する抵抗性遺伝子を同定した世界で初めての例である。

本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 少なくともアブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与する活性を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡである。
（ａ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、２、４又は５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、２、４又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｅ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
＜２＞ 前記＜１＞に記載のＤＮＡを含むベクターである。
＜３＞ 前記＜１＞に記載のＤＮＡが導入された形質転換体である。
＜４＞ 植物細胞である、前記＜３＞に記載の形質転換体である。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体である。
＜６＞ 前記＜５＞に記載の形質転換植物体の子孫又はクローンである、形質転換植物体である。
＜７＞ 前記＜５＞又は＜６＞に記載の形質転換植物体の部分若しくは繁殖材料である。

本発明により、アブラナ科野菜類炭疽病菌に対する抵抗性遺伝子が提供された。この遺伝子を利用すれば、アブラナ科野菜類炭疽病菌抵抗性のアブラナ科作物を育種することができる。これにより、アブラナ科野菜類炭疽病菌による病害から作物を守り、その生産効率を向上させることが可能となった。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１．アブラナ科野菜類炭疽病菌抵抗性タンパク質をコードするＤＮＡ）
本発明者らは、アブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ；以下、単に「炭疽病菌」と称することがある）に対する新規な抵抗性遺伝子を同定した。本発明に含まれる、抵抗性エコタイプＷｓにおける、炭疽病菌に対する新規な抵抗性遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、それら塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３に示す。また、本発明に含まれる、抵抗性エコタイプＥｉｌ−０における、炭疽病菌に対する新規な抵抗性遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：４に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に、それら塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：６に示す。さらに、参考として、感受性エコタイプＣｏｌ（コロンビア）における対応遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：７に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：８に、それら塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９に示す。一方、これら３種のシロイヌナズナエコタイプのアミノ酸配列の比較を図３−１〜図３−３に示す（なお、図３−１〜図３−３は一連の図を示す）。

本発明における炭疽病菌抵抗性タンパク質をコードするＤＮＡは、そのコードするタンパク質が、少なくとも炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）に対し抵抗性を有するものである。また、本発明のＤＮＡは、さらなる病原菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００に対して抵抗性を有していても良い。
本発明のＤＮＡにより抵抗性が付与されうるアブラナ科植物には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ハクサイ、コマツナ、カブ（以上、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）などが含まれるが、これらに制限されるものではない。本発明のＤＮＡが、病原菌に対して抵抗性を示すか否かは、該ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを用いて形質転換植物体を作製し、該形質転換植物体が、病害ストレスに曝された状態で病気の発生が抑制されているか否かを検討することによって確認することができる。

また、本発明は、炭疽病菌抵抗性を有し、かつ、配列番号：３又は６に記載のタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡをも提供する。このようなＤＮＡとしては、該タンパク質において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで「複数のアミノ酸」とは、炭疽病菌に対する抵抗性が維持される限り、特に制限はないが、通常、１〜１０アミノ酸以内、好ましくは１〜５アミノ酸以内、より好ましくは１〜３アミノ酸以内である。アミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され得る領域としては、上記抵抗性が維持される限り、特に限定されない。
抵抗性エコタイプＷｓにおける抵抗性遺伝子がコードするアミノ酸配列には、感受性エコタイプＣｏｌにおける対応遺伝子がコードするアミノ酸配列を基準として、２つのアミノ酸の特異的な置換、即ち、「Ｉ１５３Ｔ」及び「Ｖ５１８Ｉ」が認められ、この置換が抵抗性エコタイプに重要であると位置づけられた（図１及び図３−１〜図３−３）。また、抵抗性エコタイプＥｉｌ−０における抵抗性遺伝子がコードするアミノ酸配列には、感受性エコタイプＣｏｌにおける対応遺伝子がコードするアミノ酸配列を基準として、アミノ酸の特異的な置換、即ち、「Ｉ１５３Ｔ」、「Ｌ２８２Ｖ」、「Ｉ３７９Ｌ」、「Ａ３８３Ｖ」、「Ｖ４１０Ｉ」、及び「Ｄ８１７Ｎ」が認められ、この置換が抵抗性エコタイプに重要であると位置づけられた（図３−１〜図３−３）。配列番号：３又は６に記載のタンパク質と構造的に類似しているタンパク質には、これら置換のうち少なくとも一つを有するもの、若しくはこれら置換の二つ以上の組み合わせを有するものが含まれ、また、さらなるアミノ酸の変異を有するものも含まれる。

上記のＤＮＡは、当業者によく知られた方法、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７．）、あるいは、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）により変異を導入する方法、により調製することができる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。一方、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もある。本発明のＤＮＡには、このような人工的に調製された又は天然の変異ＤＮＡが含まれる。

本発明のＤＮＡの形態としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。
ゲノムＤＮＡは、例えば、本発明の抵抗性遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、配列番号：１又は４に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、配列番号：１又は４に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。
また、ｃＤＮＡは、例えば、本発明の抵抗性遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、配列番号：２又は５に記載のｃＤＮＡの塩基配列情報を基に作成したプローブやプライマーを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：１、２、４又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、炭疽病菌抵抗性を有するタンパク質をコードしている限り、本発明のＤＮＡに含まれる。

ハイブリダイゼーション技術を用いてこのようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が２５〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜３００ｍＭであり、温度が４２〜６８℃、好ましくは４２〜６５℃である。例えば、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、温度４２℃である。こうして単離されたＤＮＡは、それがコードするアミノ酸レベルにおいて、配列番号：３や配列番号：６に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．Ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９０，２１５，４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。

（２．ベクター）
本発明のベクターは、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また、上記ベクターは、本発明のＤＮＡを発現可能な発現ベクターであることが好ましい。本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモーターを挿入するには、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモーターは、天然状態において本発明のＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）の発現を制御している固有のプロモーターに限らない。例えば、植物で広く用いられているカリフラワーモザイクウィルス由来のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いることができる。このように、本発明においては、様々なプロモーターを用いることができる。

（３．形質転換体の作製）
本発明の形質転換体は、本発明のベクター（発現ベクター）を宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、上述した遺伝子が機能しうるものであれば特に限定されるものではないが、植物が好ましい。宿主が植物である場合は、形質転換植物体（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。

本発明において形質転換の対象は、植物体全体であり得るし、また、植物器官（例えば種子、葉、花弁、茎、根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞であり得る。形質転換に用いられる植物種としては、上記したようにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ハクサイ、コマツナ、カブ（以上、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）などのアブラナ科に属する植物が挙げられるが、これら例示した植物に限定されるものではない。

上記発現ベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に導入することができる。
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜１６００Ｖ、２５〜１０００μＦ、２０〜３０ｍｓｅｃの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１８００ｐｓｉ程度の圧力、５〜６ｃｍ程度の距離で行う。
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、本発明のＤＮＡを植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的のＤＮＡを挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的のＤＮＡを植物宿主に導入することができる。
アグロバクテリウムのＴｉプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、本発明に係るプロモーター及び目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にＴｉプラスミド又はＲｉプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＤＮＡ）と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。
Ｔｉ又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいＤＮＡを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むことができる。

形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。

本発明のベクター（発現ベクター）は、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明のベクター（発現ベクター）が該細菌中で自律複製可能であると同時に、本発明のＤＮＡ、リボソーム結合配列、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、本発明のＤＮＡの発現を制御するＤＮＡが含まれていてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

本発明のＤＮＡが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行われる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。

（４．形質転換植物体の製造）
本発明においては、上記形質転換植物細胞等から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、例えば、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、ＬＳ培地、ＭＳ培地などが例示される。本発明における形質転換植物体の製造工程としては、本発明のＤＮＡを挿入した植物発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生する工程を含む。一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから種子等を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。

また、本発明の形質転換植物体の部分は、例えば、農作物として食用等に供されうる。本発明には、本発明の形質転換植物体の「部分又は繁殖材料」、例えば、植物器官（例えば種子、葉、花弁、茎、根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞が含まれる。

形質転換植物体から植物種子を得るには、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。このようにして育種された植物は、導入されたＤＮＡの発現により、炭疽病菌に対する抵抗性を獲得した病害ストレス耐性植物となる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕ＳＳＬＰ（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析による抵抗性遺伝子（Ｒ−遺伝子）の探索
アブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）に抵抗性のシロイヌナズナ生態型（エコタイプ）Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ（Ｗｓ）と、感受性のＣｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）を交配し、Ｆ１種子を得た。さらにＦ１個体を自家受粉させてＦ２種子を得た。このＦ１植物に炭疽病菌を噴霧接種したところ、全てが抵抗性を示した。次にＦ２植物に炭疽病菌を噴霧接種したところ、抵抗性個体数と感受性個体数が３：１に分離し、抵抗性が優性で、この抵抗性は１遺伝子支配であることが判明した。このため、上記Ｆ２集団から病原菌に対して感受性の表現型をもつ個体を選抜したとき、その個体はＷｓの標的遺伝子座に対するＣｏｌの遺伝子（アリル）をホモザイガスでもつことが予想された。従って、表現型によって選抜された多数のＦ２個体の染色体構造を多型マーカーによって調べたとき、遺伝子型がホモでＣｏｌ型を示す頻度が最も高い領域付近に、標的遺伝子のアリルが存在することも予想された。この予想に基づき、標的遺伝子を同定すべく、ＳＳＬＰ解析を行った結果、多型マーカーＫ１１Ｉ１とＫ１７Ｏ２２（表１）で挟まれた領域までは、標的遺伝子の存在領域を絞り込むことに成功した。

〔実施例２〕Ｗｓにおける候補遺伝子のＣｏｌへの形質転換とその表現型の解析
しかしながら、実施例１の方法では、これ以上、標的遺伝子の存在領域を絞り込むことに利用できる多型マーカーの作成ができず、ＳＳＬＰ解析に限界が生じた。そこで、上記絞り込んだ領域に存在する候補遺伝子をシロイヌナズナＣｏｌに形質転換して、その表現型を解析することにより、標的遺伝子を同定することとした。

そこで、まず、ＷｓのゲノムＤＮＡから、候補遺伝子の一つであるＷｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０遺伝子を単離し、Ｗｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０遺伝子を導入した植物の病害抵抗性の解析を行った。Ｗｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０遺伝子のゲノムＤＮＡは、Ｃｏｌ−Ａｔ５ｇ４５２５０のゲノム情報により推定して設計したプライマー１：ＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧ（配列番号：１４）とプライマー２：ＡＣＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１５）を用いてＰＣＲ法により増幅した。このゲノムＤＮＡの塩基配列を定法に従って決定した。この塩基配列のうち、Ｗｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０遺伝子の開始コドンより上流約２．０ｋｂをプロモーターとして同定した。シロイヌナズナにおいては、開始コドンより上流約１．０ｋｂ内にプロモーターが存在し、開始コドンより約１５０ｂ内に５’非翻訳領域が存在することが知られているためである（ＭａｌｅｃｋらＮａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２６，４０３−４１０（２０００））。また、Ｗｓの発現ライブラリーからＷｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０ｃＤＮＡを同定し、その塩基配列を定法に従って決定した。なお、同定されたイントロン領域を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示し、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に示した。（なお、配列番号：１中、エキソン領域（コード領域）は１〜４７３、６１０〜１７９２、１８８１〜２１９５、２３０２〜３１８６、及び３３０３〜４１００である。）

次に、同定したゲノムＤＮＡが病害ストレスに対して抵抗性を示すか否かを検討した。シロイヌナズナＷｓゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて、Ｗｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０遺伝子の開始コドンより上流２．０ｋｂを含むＷｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０遺伝子をクローニングした。ＰＣＲは、プライマー（プライマー１：ＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧ（配列番号：１６）とプライマー２：ＡＣＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１７））を使用して、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒及び６８℃で６分のサイクルを３０サイクルの反応条件で行った。
クローニングした遺伝子を、バイナリーベクター（ｐＢＩ系ベクター）のマルチクローニングサイトにおける制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入してベクターに連結した。さらにこれをシロイヌナズナＣｏｌに形質転換した。この形質転換体のＦ２及びＦ３世代の個体にアブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）を噴霧接種し、その表現型を検討したところ、炭疽病菌に抵抗性を示すことが判明した（図２）。

〔実施例３〕戻し交雑によるＷｓの抵抗性遺伝子のＣｏｌへの導入
アブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）に抵抗性を示すＷｓに感受性を示すＣｏｌを交雑した。交雑によって得られた子孫に炭疽病菌を噴霧接種し、抵抗性を示した個体についてさらにＣｏｌを交雑するということを、約４年もの歳月を費やして、８回繰り返した。その結果、遂に、Ｗｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０及びその周辺領域がＷｓ型でそれ以外の領域はＣｏｌ型を示す個体を作出することに成功した。この個体に炭疽病菌を噴霧接種してその表現型を検討したところ、炭疽病菌に抵抗性を示すことが判明した。
以上により、Ｗｓ−Ａｔ５ｇ４５２５０がアブラナ科野菜類炭疽病菌に対する抵抗性遺伝子であることが明らかとなった。

〔実施例４〕戻し交雑によるＥｉｌ−０の抵抗性遺伝子のＣｏｌへの導入
アブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）に抵抗性を示すＥｉｌ−０に感受性を示すＣｏｌを交雑した。交雑によって得られた子孫に炭疽病菌を噴霧接種し、抵抗性を示した個体についてさらにＣｏｌを交雑するということを、約４年もの歳月を費やして、７回繰り返した。その結果、遂に、Ｅｉｌ−Ａｔ５ｇ４５２５０及びその周辺領域がＥｉｌ型でそれ以外の領域はＣｏｌ型を示す個体を作出することに成功した。この個体に炭疽病菌を噴霧接種してその表現型を検討したところ、炭疽病菌に抵抗性を示すことが判明した。
以上により、Ｅｉｌ−Ａｔ５ｇ４５２５０がアブラナ科野菜類炭疽病菌に対する抵抗性遺伝子であることが明らかとなった。なお、同定されたイントロン領域を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：４に示し、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に示した。（なお、配列番号：４中、エキソン領域（コード領域）は１〜４７３、６１０〜１７９２、１８８１〜２１９５、２３０２〜３１８６、及び３３０３〜４１００である。）

本発明は、例えば、ハクサイ、コマツナ、カブ、キャベツ、ナタネ、ダイコン等のアブラナ科作物の育種分野において好適に利用可能であり、本発明を利用すれば、アブラナ科野菜類炭疽病菌による病害からアブラナ科作物を守ることができ、その生産効率を向上させることが可能となる。

図１は、シロイヌナズナエコタイプコロンビア（Ｃｏｌ）のＡｔ５ｇ４５２５０遺伝子産物に対する、各エコタイプ（ＲＬＤ、Ｌｅｒ、Ｗｓ）のアミノ酸置換部位を示した図である。なお、アブラナ科野菜類炭疽病菌に対して、コロンビア（Ｃｏｌ）、ＲＬＤ、Ｌｅｒは感受性であり、Ｗｓは抵抗性である。 図２は、各シロイヌナズナにアブラナ科野菜類炭疽病菌を接種後、６日目の病斑の様子を示した図である。なお、Ａは、感受性エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ）を示し、Ｂは、抵抗性エコタイプＷｓを示し、Ｃは、ＷｓのＡｔ５ｇ４５２５０遺伝子をコロンビア（Ｃｏｌ）に導入した形質転換体を示す。 図３−１は、感受性エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ）、抵抗性エコタイプＷｓ、及び抵抗性エコタイプＥｉｌ−０（Ｅｉｌ）のアミノ酸配列を比較した図である（なお、図３−１〜図３−３は一連の図を示す）。 図３−２は、感受性エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ）、抵抗性エコタイプＷｓ、及び抵抗性エコタイプＥｉｌ−０（Ｅｉｌ）のアミノ酸配列を比較した図である（なお、図３−１〜図３−３は一連の図を示す）。 図３−３は、感受性エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ）、抵抗性エコタイプＷｓ、及び抵抗性エコタイプＥｉｌ−０（Ｅｉｌ）のアミノ酸配列を比較した図である（なお、図３−１〜図３−３は一連の図を示す）。

Claims (7)

1. 少なくともアブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与する活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
   （ａ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
   （ｂ）配列番号：１、２、４又は５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
   （ｃ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列において、第１５３番目のアミノ酸以外の１個〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
   （ｄ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ第１５３番目のアミノ酸がＴｈｒであるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
2. 請求項１に記載のＤＮＡを含むベクター。
3. 請求項１に記載のＤＮＡが導入された形質転換体。
4. 植物細胞である、請求項３に記載の形質転換体。
5. 請求項１に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
6. 少なくともアブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与することを特徴とする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質。
   （ａ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号：１、２、４又は５に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
   （ｃ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列において、第１５３番目のアミノ酸以外の１個〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質
   （ｄ）配列番号：３又は６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ第１５３番目のアミノ酸がＴｈｒであるアミノ酸配列からなるタンパク質
7. 請求項１に記載のＤＮＡ、請求項２に記載のベクター、及び請求項６に記載のタンパク質のいずれかを含んでなる、少なくともアブラナ科野菜類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ）への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与することを特徴とする組成物。