CN102199297A - 一种星型阳离子聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM及制备方法，该方法将β-CD-(N3)7和PAMAM溶于叔丁醇与水的混合溶剂中，搅拌溶解后，将五水硫酸铜和抗坏血酸钠的水溶液，滴入混合溶剂中，升温到40～50℃并在氮气保护下搅拌反应24～28小时，将反应产物用透析袋透析，过滤，冷冻干燥得到。本发明还提供了β-CD-PAMAM在RNA干扰MMP-9表达中作为基因转导载体的应用。本发明星型阳离子聚合物具有良好的水溶性和生物相容性，表面大量的阳离子基团可与siRNA形成纳米粒，具有较高的转染效率，其可与siRNA形成纳米粒，并且表面大量的阳离子基团，提供了进一步功能化的可能。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种星型阳离子聚合物及其制备方法，以及其在RNA干扰MMP-9表达中作为基因转导载体的应用。
背景技术
糖尿病患者皮肤易损，且一旦出现伤口很难愈合。其原因主要包括：(1)患者全身因素(如代谢营养状况、免疫力等)；(2)伤口局部因素(如是否合并感染、周围组织的血管病变、神经病变等)；(3)伤口微观的改变(过量的基质金属蛋白酶分泌、生长因子缺乏、组织增殖能力降低、微循环的异常、炎症因子分泌过多等)。这些原因最终导致细胞外基质合成和降解的失平衡，从而影响溃疡愈合。
基质金属蛋白酶9(MMP-9)是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中的一员，又称明胶酶B，是依赖Zn2+的金属酶。在糖尿病病理状态下：(1)研究发现糖尿病病人的足溃疡渗出液中基质金属蛋白酶9(MMP-9)的水平较正常人升高。(2)本发明前期研究发现糖尿病大鼠皮肤MMP-9的水平较正常大鼠明显增高，MMP-9/TIMP-1(组织金属蛋白酶抑制剂-1)之间平衡失调，细胞外基质过度降解，可能与糖尿病大鼠伤口愈合减慢有关。(3)在糖尿病足患者中，单纯局部应用生长因子并不能加快溃疡愈合，考虑可能与MMP-9的升高加速降解生长因子、生长因子受体、整合素及其受体，从而加重伤口局部炎症反应，减慢伤口愈合。因此抑制伤口局部MMP-9的表达是促进糖尿病足伤口愈合的可选择方法之一。然而目前还没有特异性MMP-9抑制剂，且MMPs抑制剂(TIMP)价格十分昂贵，不适合临床常规使用，所以，通过RNA干扰技术抑制糖尿病伤口MMP-9的表达成为可供选择的方法之一。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)近年来发展迅速，已经从基础研究发展到临床应用。RNA干扰技术的核心是通过内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失，这种依赖于dsRNA的转录后基因沉默过程被称为RNA干扰。此技术的关键步骤之一就是将基因转导进入细胞的技术。
基因的转导需要高效率、高安全性的载体，由于病毒载体潜在的安全性问题，很大程度限制了其在体内实验中的应用，故人们一直致力寻找新的基因转导载体。非病毒载体中的新型阳离子聚合物目前受到极大关注，因为其具有以下优点：(1)无免疫原性，不会引起机体的免疫反应；(2)通过控制粒径尺寸和表面性质可控制载体的生理行为；(3)可根据需要设计载体的分子结构；(4)遗传物质的释放可做到由聚合物基质的降解速率决定。阳离子聚合物与核酸带负电的磷酸基团通过静电相互作用形成复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM。
本发明的另一个目的是提供星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM的制备方法。
本发明的再一个目的是提供星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM，其分子式如下：
上述星型阳离子聚合物的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子(PAMAM)的合成：
a 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：在冰水浴、氮气保护下，将丙炔胺的甲醇溶液缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥，得到0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子；
b 1代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：在冰水浴，氮气保护下，将0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥，得到1代聚酰胺-胺树枝状大分子；
c 2代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：1代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液和丙烯酸甲酯的甲醇溶液进行迈克尔加成反应，在冰水浴、氮气保护下，将1代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥，得到1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，然后1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子和过量的乙二胺反应，在冰水浴、氮气保护下，将1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应36～48小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥，得到2代聚酰胺-胺树枝状大分子；
d 3代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：2代聚酰胺-胺树枝状大分子和丙烯酸甲酯进行迈克尔加成反应，在冰水浴、氮气保护下，将2代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥，得到2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，然后2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子和过量的乙二胺反应，在冰水浴、氮气保护下，将2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应36～48小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥，得到3.0代聚酰胺-胺树枝状大分子；
(2)七臂-(6-聚酰胺-胺基-6-去氧)-β-环糊精星型聚合物(β-CD-PAMAM)的合成：
e 七(6-叠氮基-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-(N3)7)的合成：将三苯基膦(Ph3P)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在室温下，加入碘(I2)，将温度升至60～70℃，缓慢加入β-环糊精(β-CD)，N2气氛下反应24～28h，减压蒸馏除去大部分DMF，冰水浴条件下缓慢加入甲醇钠溶液，产物在甲醇中沉淀5～7次，然后真空干燥，得到白色固体七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-(I)7)，将七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精溶解在无水DMF中，加入叠氮钠(NaN3)，N2气氛下升温至60～70℃反应24～28h，减压蒸馏除去部分DMF，然后滴加到大量的水中沉淀，用去离子水反复洗涤多遍，然后室温真空干燥，得到白色固体七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-(N3)7)；
f取β-CD-(N3)7和三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)溶于叔丁醇与水的混合溶剂中，搅拌溶解后，将五水硫酸铜和抗坏血酸钠的水溶液，缓慢滴入混合溶剂中，升温到40～50℃并在氮气保护下搅拌反应24～28小时，反应结束后，将反应产物透析，过滤，冷冻干燥得到产物β-CD-PAMAM。
所述步骤a中丙炔胺的氨基与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶(3～5)，丙炔胺甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL甲醇溶液中含有1.0～1.2g丙炔胺。
所述步骤b中0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子***末端酯基与乙二胺的摩尔比为1∶(10～15)，0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后甲醇溶液中每10mL甲醇溶液中含有1.1～1.5g 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。
所述步骤c中1代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端氨基与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶(3～5)，1代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL甲醇溶液含有1.0～1.5g 1代聚酰胺-胺树枝状大分子，1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端酯基与乙二胺的摩尔比为1∶(10～15)，1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL甲醇溶液含有1.1～1.5g 1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。
所述步骤d中2代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端氨基与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶(3～5)，2代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL溶液含有1.0～1.5g 2代聚酰胺-胺树枝状大分子，2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端酯基与乙二胺的摩尔比为1∶(10～15)，2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL溶液含有1.1～1.5g 2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。
所述步骤e中三苯基膦溶于N，N-二甲基甲酰胺中形成的质量体积比浓度为0.15～0.20g/ml，三苯基膦和碘的摩尔比为1∶(1～1.1)，三苯基膦和β-环糊精的摩尔比为1.5∶1～1.4∶1.1，三苯基膦和甲醇钠的摩尔比为1∶(1.3～1.5)，叠氮钠和β-环糊精的摩尔比为(8～10)∶1。
所述步骤f中β-CD-(N3)7和三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)的摩尔比为1∶(7～10)，催化剂五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比是1∶(2～2.5)，混合溶剂中叔丁醇和水的体积比为(1～1.2)∶1，β-CD-(N3)7溶于混合溶剂形成质量体积比浓度为0.1～0.2g/mL，五水硫酸铜溶于混合溶剂形成质量体积比浓度为3～4mg/mL，透析条件为3500Da透析袋透析48～72小时。
所述三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子的分子式如下：
上述星型阳离子聚合物在RNA干扰MMP-9表达中作为基因转导载体的应用。
本发明通过分子设计合成星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM，该聚合物具有以下优点：(1)具有良好的水溶性和生物相容性；(2)表面大量的阳离子基团，可与siRNA形成纳米粒，具有较高的转染效率；可与siRNA形成纳米粒；(3)表面大量的阳离子基团，提供了进一步功能化的可能。
附图说明
图1为实施例一制备的β-CD-PAMAM的1H NMR图谱(D2O，300MHz)。
图2为高糖培养下不同浓度β-CD-PAMAM处理组细胞活力图。
图3为正糖培养下不同浓度β-CD-PAMAM处理组细胞活力图。
图4为β-CD-PAMAM与siRNA结合能力凝胶电泳图。
图5为β-CD-PAMAM与siRNA结合后形成纳米复合物的透射电镜图。
图6为β-CD-PAMAM介导FAM标记的siRNA转染后激光共聚焦显微图片，其中A为β-CD-PAMAM/siRNA＝30∶1组普通光镜大鼠皮肤成纤维细胞图(400x)；B为β-CD-PAMAM/siRNA＝30∶1激光共聚焦荧光图(400x)；C为：β-CD-PAMAM/siRNA＝30∶1普通光镜与荧光叠加图(400x)；D为：β-CD-PAMAM/siRNA＝4∶1组普通光镜大鼠皮肤成纤维细胞图(400x)E为：β-CD-PAMAM/siRNA＝4∶1激光共聚焦荧光图(400x)；F为：β-CD-PAMAM/siRNA＝4∶1普通光镜与荧光叠加图(400x)；G为：Lipofectamine2000/siRNA组普通光镜大鼠皮肤成纤维细胞图(400x)H为：Lipofectamine2000/siRNA组激光共聚焦荧光图(400x)I为：Lipofectamine2000/siRNA组普通光镜与荧光叠加图(400x)；J为：β-CD-PAMAM/siRNA＝30∶1组普通光镜大鼠皮肤成纤维细胞图(1000x)；K为：β-CD-PAMAM/siRNA＝30∶1激光共聚焦荧光图(1000x)L为：β-CD-PAMAM/siRNA＝30∶1普通光镜与荧光叠加图(1000x)。
图7为流式细胞仪检测高糖培养下不同组别转染效率及细胞死亡率图。
图8为流式细胞仪检测正糖培养下不同组别转染效率及细胞死亡率图。
图9为实施例八实验方法示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
制备实施例一
1、三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子的合成
(1)冰水浴下，氮气保护，将1.5g丙炔胺溶于5mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(7.03g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温搅拌反应24小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：95％。
(2)冰水浴下，氮气保护，将5.4g 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(28.5g乙二胺溶于30mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1小时，然后在室温下搅拌反应24小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到1代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：90％。
(3)冰水浴下，氮气保护，将3.3g 1代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(6.0g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温搅拌反应24小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。冰水浴下，氮气保护，将3.8g 1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(14.5g乙二胺溶于15mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1小时，然后在室温下搅拌反应48小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到2代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：87％。
(4)冰水浴下，氮气保护，将3.83g 2代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(5.35g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温搅拌反应24小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。冰水浴下，氮气保护，将3.4g 2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(11.4g乙二胺溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1小时，然后在室温下搅拌反应36小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到3代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：89％。
2、七臂-(6-聚酰胺-胺基-6-去氧)-β-环糊精星型聚合物(β-CD-PAMAM)的合成
(1)称取Ph3P(18.4g，70mmol)，溶解在100mL无水DMF中，然后在室温下，加入I2(17.8g，70mmol)，将油浴温度升至60℃。缓慢加入干燥的β-CD(5.7g，5mmol)，N2气氛下反应24h。减压蒸馏除去约60mL DMF，冰水浴条件下缓慢加入甲醇钠溶液(3.0M，30mL)。产物在甲醇中沉淀5次，然后真空干燥，得到白色固体七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-(I)7)。将七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(3.8g，2.0mmol)溶解在40mL无水DMF中，加入NaN3(1.3g，20mmol)，N2气氛下升温至70℃反应24h。减压蒸馏除去部分DMF，然后滴加到大量的水中沉淀。用去离子水反复洗涤多遍，然后室温真空干燥。得到白色固体七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精，产率：85％。
(2)取0.26mmol的β-CD-(N3)7和2.0mmol的三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)溶于5mL叔丁醇与水的混合溶剂中(1∶1，v/v)。搅拌溶解后，将0.40mmol的五水硫酸铜和0.80mmol的抗坏血酸钠分别溶于0.5mL水中，缓慢滴入混合溶剂中。升温到40℃并在氮气保护下搅拌反应24小时。反应结束后，将反应产物用透析袋(3500Da)透析48小时，过滤，冷冻干燥得到产物β-CD-PAMAM，产率：85％。
制备实施例二
1、不同代数的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子的合成
(1)冰水浴下，氮气保护，将1.5g丙炔胺溶于5mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(11.73g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌2小时，然后升温至室温搅拌反应36小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：98％。
(2)冰水浴下，氮气保护，将4.54g 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于15mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(36.0g乙二胺溶于15mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应2小时，然后在室温下搅拌反应36小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到1代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：95％。
(3)冰水浴下，氮气保护，将5.66g 1代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于25mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(17.2g丙烯酸甲酯溶于15mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌2小时，然后升温至室温搅拌反应36小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。冰水浴下，氮气保护，将3.8g 1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于10mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(21.8g乙二胺溶于15mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应2小时，然后在室温下搅拌反应48小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到2代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：90％。
(4)冰水浴下，氮气保护，将3.83g 2代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于15mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(8.9g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温搅拌反应28小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。冰水浴下，氮气保护，将3.4g 2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于10mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(17.2g乙二胺溶于15mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1小时，然后在室温下搅拌反应48小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到3代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：93％。
2、七臂-(6-聚酰胺-胺基-6-去氧)-β-环糊精星型聚合物(β-CD-PAMAM)的合成
(1)称取Ph3P(18.4g，70mmol)，溶解在120mL无水DMF中，然后在室温下，加入I2(21.36g，84mmol)，将油浴温度升至70℃。缓慢加入干燥的β-CD(6.84g，6mmol)，N2气氛下反应28h。减压蒸馏除去约60mL DMF，冰水浴条件下缓慢加入甲醇钠溶液(3.0M，30mL)。产物在甲醇中沉淀7次，然后真空干燥，得到白色固体七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-(I)7)。将七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(3.8g，2.0mmol)溶解在40mL无水DMF中，加入NaN3(1.56g，24mmol)，N2气氛下升温至70℃反应24h。减压蒸馏除去部分DMF，然后滴加到大量的水中沉淀。用去离子水反复洗涤多遍，然后室温真空干燥。得到白色固体七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精，产率：88％。
(2)取0.26mmol的β-CD-(N3)7和2.4mmol的三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)溶于5mL叔丁醇与水的混合溶剂中(1∶1，v/v)。搅拌溶解后，将0.40mmol的五水硫酸铜和1.0mmol的抗坏血酸钠分别溶于0.5mL水中，缓慢滴入混合溶剂中。升温到50℃并在氮气保护下搅拌反应28小时。反应结束后，将反应产物用透析袋(3500Da)透析48小时，过滤，冷冻干燥得到产物β-CD-PAMAM，产率：81％。
制备实施例三
1、三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子的合成
(1)冰水浴下，氮气保护，将1.5g丙炔胺溶于5mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(9.0g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1.5小时，然后升温至室温搅拌反应30小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：95％。
(2)冰水浴下，氮气保护，将5.0g 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(33.0g乙二胺溶于30mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1.5小时，然后在室温下搅拌反应30小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到1代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：90％。
(3)冰水浴下，氮气保护，将4.5g 1代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(11.0g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1.5小时，然后升温至室温搅拌反应30小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。冰水浴下，氮气保护，将3.8g 1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(19.0g乙二胺溶于15mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1.5小时，然后在室温下搅拌反应40小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到2代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：87％。
(4)冰水浴下，氮气保护，将3.83g 2代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液(6.5g丙烯酸甲酯溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌1.5小时，然后升温至室温搅拌反应30小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。冰水浴下，氮气保护，将3.4g 2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子溶于20mL甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液(13.2g乙二胺溶于10mL甲醇)中。2小时滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1.5小时，然后在室温下搅拌反应40小时。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到3代聚酰胺-胺树枝状大分子，产率：89％。
2、七臂-(6-聚酰胺-胺基-6-去氧)-β-环糊精星型聚合物(β-CD-PAMAM)的合成
(1)称取Ph3P(18.4g，70mmol)，溶解在100mL无水DMF中，然后在室温下，加入I2(19.0g，70mmol)，将油浴温度升至65℃。缓慢加入干燥的β-CD(6.51g，5mmol)，N2气氛下反应26h。减压蒸馏除去约60mL DMF，冰水浴条件下缓慢加入甲醇钠溶液(3.0M，30mL)。产物在甲醇中沉淀6次，然后真空干燥，得到白色固体七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-(I)7)。将七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(3.8g，2.0mmol)溶解在40mL无水DMF中，加入NaN3(1.3g，20mmol)，N2气氛下升温至65℃反应26h。减压蒸馏除去部分DMF，然后滴加到大量的水中沉淀。用去离子水反复洗涤多遍，然后室温真空干燥。得到白色固体七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精，产率：85％。
(2)取0.26mmol的β-CD-(N3)7和2.2mmol的三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)溶于5mL叔丁醇与水的混合溶剂中(1∶1，v/v)。搅拌溶解后，将0.40mmol的五水硫酸铜和0.90mmol的抗坏血酸钠分别溶于0.5mL水中，缓慢滴入混合溶剂中。升温到45℃并在氮气保护下搅拌反应26小时。反应结束后，将反应产物用透析袋(3500Da)透析48小时，过滤，冷冻干燥得到产物β-CD-PAMAM，产率：85％。
测试实施例四
将实施例一、实施例二和实施例三得到的七臂-(6-聚酰胺-胺基-6-去氧)-β-环糊精星型聚合物(β-CD-PAMAM)溶于重水中，进行氢谱核磁表征，结果如图1所示。1HNMR：δ2.20-3.30(PAMAM上的质子特征峰)，δ3.30-4.30(β-CD上的质子特征峰)，δ7.92(点击化学反应五元环上的质子特征峰)。
实施例五β-CD-PAMAM的细胞毒性实验
试验方法：所用细胞为大鼠皮肤成纤维细胞株CRL1213(编号4032860)，购自ATCC。将对数生长期的CRL1213细胞以9000个/孔接种于96孔板，每孔培养基(DMEM正糖培养基及高糖培养基，购自GIBICO公司，胎牛血清(FBS)，购自Hyclone公司)终体积为200ul，37℃，5％CO2环境下培养24小时待细胞贴壁后，将原培养基换为不同浓度(质量-体积比为21.3ug/ml、16.0ug/ml、10.7ug/ml、5.3ug/ml、2.1ug/ml时)β-CD-PAMAM的培养基(过滤法除菌)。每个浓度组设5个复孔。将96孔板继续放入37℃，5％CO2的培养箱中培养。分别在24、48、72小时后，每孔加入20ul噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT)(购自Sigma公司)，继续培养箱内孵育，4小时后将培养基及MTT吸出，加入150ul二甲基亚砜(Dmethyl sulfoxide，DMSO)(购自Amresco公司)，摇床摇匀15分钟，在酶标仪492nm波长处检测OD值，通过以下公式计算不同浓度阳离子聚合物培养后的细胞活力，对照组为未加β-CD-PAMAM组。筛选出细胞活力80％以上的材料浓度。细胞活力(％)＝[A492(实验组)/A492(对照组)]×100
试验结果：β-CD-PAMAM浓度为21.3ug/ml、16.0ug/ml、10.7ug/ml、5.3ug/ml、2.1ug/ml时，高糖培养组(图2)、正糖培养组(图3)MTT示24小时、48小时、72小时培养后细胞活力基本均在70％以上。
由图2可知高糖组不同浓度β-CD-PAMAM培养的细胞24小时、48小时、72小时后细胞活力基本均在70％以上。
由图3可知正糖组不同浓度β-CD-PAMAM培养的细胞24小时、48小时、72小时后细胞活力基本均在70％以上。
实施例六β-CD-PAMAM与MMP-9特异性siRNA的结合能力
试验方法：
(1)MMP-9特异性siRNA制备，由上海吉玛公司完成，其序列为：MMP9siRNA(5`-GGGCUUAGAUCAUUCUUCATT-33`-UGAAGAAUGAUUAAGCCCAG-5)
(2)β-CD-PAMAM与siRNA按照质量比40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1混合，同时设阴性对照组(只加入siRNA，未加阳离子聚合物)，室温(37℃)孵育15分钟，配置4％的琼脂糖凝胶(购自Invitrogen公司)，待胶凝固后，每个上样孔加5ul混合液，1ul胶体金，1ul 6x上样缓冲液(loading buffer)(购自Takara公司)，80V电压电泳20分钟，电泳完毕后在凝胶成像仪(Alpha-Innotech提供)中观察结果。
试验结果：β-CD-PAMAM与MMP-9特异性siRNA按照质量比为40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1混合后行琼脂糖凝胶电泳(图4)观察到各浓度组β-CD-PAMAM均可与siRNA结合并将siRNA阻滞在上样孔内，提示以上各浓度的β-CD-PAMAM均足以与MMP-9特异性siRNA结合。β-CD-PAMAM与MMP-9特异性siRNA结合后形成纳米复合物可通过透射电镜观察(图5)。
由图4可知各浓度的β-CD-PAMAM均足以与MMP-9特异性siRNA结合。图5中箭头所指为β-CD-PAMAM与MMP-9特异性siRNA形成的纳米粒。
实施例七β-CD-PAMAM介导FAM标记的siRNA转染效率评估
将对数生长期的CRL1213细胞(来源同上)按照1×105/孔种于24孔板内，培养基终体积为500ul，经24小时培养后，将培养基换为500ulOpti-MEM培养基(购自Invitrogen公司)，同时在Opti-MEM中加入FAM荧光标记的siRNA(siRNA终浓度为40nmol/L)(购自上海吉玛公司)与Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)(500ul终体积的Opti-MEM中加入1ul)的混合物或与β-CD-PAMAM(β-CD-PAMAM/siRNA质量比为40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1)的混合物，在37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时后将培养基换成体积比10％胎牛血清(购自Hyclone公司)的普通培养基继续培养，24小时内在激光共聚焦显微镜(购自LSM510META，Germany)下观察转染效果，整个操作过程均需避光。
流式细胞仪(FACSC alibur Becton Dickinson产品)检测转染效率基本步骤同上，待转染后24小时内将细胞用PBS(购自广东化学试剂厂)洗两次后，用含EDTA0.25％胰酶(购自吉诺公司)消化，细胞脱壁后，用10％胎牛血清的培养基中和，细胞悬液入流式管，5min，1000rpm后弃上清，将细胞用PBS再次洗涤后离心，弃上清，最后用200ulPBS重悬进行流式细胞仪检测，同时行PI(购自吉诺公司)染色观察不同浓度β-CD-PAMAM转染细胞后对细胞的毒性作用，整个操作过程均需避光。该细胞实验分为正糖培养组(5.6mmol/L)及高糖培养组(25mmol/L)，在不同糖浓度培养下分别进行不同浓度材料的转染效率检测。
试验结果：流式细胞仪检测结果显示高糖培养组β-CD-PAMAM与siRNA质量比为40∶1(0.9645±0.0524)、30∶1(0.9880±0.0060)、20∶1(0.9911±0.0031)、10∶1(0.9438±0.0291)组转染效率均明显高于4∶1(0.5623±0.2531)组及Lipofectamine2000(0.5758±0.1017)转染组，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)(图7)。正糖培养组β-CD-PAMAM与siRNA质量比为40∶1(0.9758±0.0164)、30∶1(0.9894±0.0085)、20∶1(0.9539±0.0255)组转染效率高于β-CD-PAMAM与siRNA质量比为10∶1(0.8846±0.0500)、4∶1(0.7946±0.2297)组及Lipofectamine2000与siRNA混合组(0.6067±0.1118)，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图8)。流式细胞仪检测转染后死细胞数量，无论高糖培养组细胞(图7)或正糖培养组细胞(图8)，各组之间差异均无统计学意义(P＞0.05)。根据以上结果，筛选出阳离子聚合物与siRNA质量比为20∶1为最优转染体系。
激光共聚焦显微镜观察结果(图6)与转染效率检测结果一致，随着β-CD-PAMAM与siRNA质量比的逐渐下降，带有荧光的细胞数量逐渐减少(图6A-F)，进一步放大1000倍观察，可见转染后细胞内空泡状结构增多，该现象为转染复合物通过胞吞作用进入细胞所形成的内含体(图6J-L)。
图7可知高糖培养组β-CD-PAMAM与siRNA质量比为40∶1(0.9645±0.0524)、30∶1(0.9880±0.0060)、20∶1(0.9911±0.0031)、10∶1(0.9438±0.0291)组转染效率均明显高于4∶1(0.5623±0.2531)组及Lipofectamine2000(0.5758±0.1017)转染组，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。各组细胞死亡百分率无统计学差异(P＞0.05)。
图8可知正糖培养组β-CD-PAMAM与siRNA质量比为40∶1(0.9758±0.0164)、30∶1(0.9894±0.0085)、20∶1(0.9539±0.0255)组转染效率高于β-CD-PAMAM与siRNA质量比为10∶1(0.8846±0.0500)、4∶1(0.7946±0.2297)组及Lipofectamine2000与siRNA混合组(0.6067±0.1118)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。各组细胞死亡百分率无统计学差异(P＞0.05)。
实施例八β-CD-PAMAM介导的RNAi对CRL1213细胞表达的MMP-9抑制效果评估
(1)试验方法如图9所示
(2)实验分组：
高糖培养组包括：
1.高糖培养组
2.MMP-9高表达模型组
3.β-CD-PAMAM/siRNA转染组
4.Lipofectamine/siRNA转染组
正糖培养组包括：
1.正糖培养组
2.MMP-9高表达模型组
3.β-CD-PAMAM/siRNA转染组
4.Lipofectamine/siRNA转染组
(3)建立MMP-9高表达细胞模型
对数生长期的CRL1213细胞(来源同上)按照3×105/孔种于6孔板，待细胞生长至90％融合时，将普通培养基换为0.5％胎牛血清(FBS)的培养基(饥饿液)使细胞同步化，饥饿24小时后，换为终体积为1ml的刺激液(含10％FBS的DMEM高糖培养基+脂多糖1ug/ml(购自Sigma公司))继续培养18小时后，收集细胞进行qRT-PCR检测MMP-9的表达。同时检测用10％FBS的DMEM高糖培养组及10％FBS的DMEM正糖培养组细胞MMP-9的表达。
(4)聚合物介导转染后对MMP-9抑制效果检测
建立MMP-9高表达模型后，将刺激液换为1mlOpti-MEM培养基，同时在Opti-MEM中加入MMP-9特异性siRNA(siRNA终浓度为40nmol/L)与Lipofectamine2000(1ml终体积的Opti-MEM中加入2ul)的混合物或与β-CD-PAMAM(第三部分筛选出的阳离子聚合物介导的最优转染体系)的混合物，在37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时后将培养基换成含10％FBS的高糖或正糖培养基继续培养，24小时后收集细胞进行qRT-PCR检测MMP-9的表达。
(5)qRT-PCR检测各组MMP-9的表达
总RNA抽提
1)收集细胞，加入1mlTrizol溶液，吹打混匀，使细胞充***解，静置5min；
2)加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；
3)4℃下，10000rpm离心15min，可见分成三层，RNA在上层水相，移至另一个新的灭活RNA酶的离心管(RNAase free EP)；
4)RNA沉淀加入0.5ml异丙醇，轻柔的充分混匀，室温静置10min；
5)4℃下，10000rpm离心10min，收集RNA沉淀，去上清；
6)用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水处理过的75％乙醇洗涤两次，超净台风干；
7)加入30ulDEPC水溶解沉淀。
总RNA纯度和完整性检测
1)纯度检测：取1ulRNA样品50倍稀释，在UV-2201紫外分光光度仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。
2)总RNA完整性测定：取RNA样品1ul，1％琼脂糖凝胶电泳80Vx20min，用凝胶成像***观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条带完整即可证明总RNA抽提比较完整。
逆转录
1)在无RNA酶(RNAase free)的PCR管中配置下列溶液
2)将上述溶液吹打均匀，置65℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；
3)在该PCR管中加入下列试剂
4)将上述20ul反应溶液30℃保温10min；
5)42℃保温50min；
6)72℃保温10min。
定量PCR
1)设计的引物：上游引物：MMP-9sense 5′CGCAAGCCTCTAGAGACCAC3′
下游引物：MMP-9Anti-sense 5′TGGGGGATCCGTGTTTATTA 3′
上游引物：GAPDH sense 5′GGCATTGCTCTCAATGACAA 3′
下游引物：GAPDH Anti-sense 5′TGTGAGGGAGATGCTCAGTG 3′
2)反应体系
3)反应条件：
①DNA变性(95℃，15秒钟)；②退火(65℃，15秒钟)；③延伸(72℃，32秒钟)，40个循环。
4)溶解曲线分析：温度60℃-95℃，每0.4℃读1次。
试验结果：
予高糖+脂多糖(LPS)1ug/ml刺激18小时后，MMP-9表达明显升高，高糖培养组(刺激前3.78±0.20)(刺激后14.01±0.74)、正糖培养组(刺激前3.87±0.32)(刺激后8.25±0.34)刺激前后MMP-9表达量的差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)，说明MMP-9高表达细胞模型建立成功。转染Lipofectamine2000/siRNA复合物(高糖培养组2.79±0.08，正糖培养组1.00±0.00)或β-CD-PAMAM/siRNA复合物(高糖培养组4.47±0.54，正糖培养组2.10±0.09)后检测MMP-9表达，均较模型组明显下降，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，无论高糖培养组或正糖培养组β-CD-PAMAM介导的RNAi效果不劣于Lipofectamine2000介导RNAi对大鼠皮肤成纤维细胞CRL1213MMP-9的抑制效果(表5、表6)。
表5高糖培养下各组MMP-9表达量
表6正糖培养下各组MMP-9表达量
由表5可知高糖培养下转染Lipofectamine2000/siRNA复合物或β-CD-PAMAM/siRNA复合物后检测MMP-9表达，均较模型组明显下降，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。β-CD-PAMAM不劣于Lipofectamine2000介导的RNAi效果。
由表6可知正糖培养下转染Lipofectamine2000/siRNA复合物或β-CD-PAMAM/siRNA复合物后检测MMP-9表达，均较模型组明显下降，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。β-CD-PAMAM不劣于Lipofectamine2000介导的RNAi效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种星型阳离子聚合物，其特征在于：所述星型阳离子聚合物分子式如下：
2.权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：
a 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：在冰水浴、氮气保护下，将丙炔胺的甲醇溶液缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥，得到0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子；
b 1代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：在冰水浴、氮气保护下，将0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥，得到1代聚酰胺-胺树枝状大分子；
c 2代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：1代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液和丙烯酸甲酯的甲醇溶液进行迈克尔加成反应，在冰水浴、氮气保护下，将1代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥，得到1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，然后1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子和过量的乙二胺反应，在冰水浴、氮气保护下，将1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应36～48小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥，得到2代聚酰胺-胺树枝状大分子；
d 3代聚酰胺-胺树枝状大分子的合成：2代聚酰胺-胺树枝状大分子和丙烯酸甲酯进行迈克尔加成反应，在冰水浴、氮气保护下，将2代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应24～36小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥，得到2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子，然后2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子和过量的乙二胺反应，在冰水浴、氮气保护下，将2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的甲醇溶液缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中，滴加完成后，先在0℃下搅拌反应1～2小时，然后在室温下搅拌反应36～48小时，反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥，得到3.0代聚酰胺-胺树枝状大分子；
(2)七臂-(6-聚酰胺-胺基-6-去氧)-β-环糊精星型聚合物的合成：
e 七(6-叠氮基-6-去氧)-β-环糊精的合成：将三苯基膦溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺中，在室温下，加入碘，将温度升至60～70℃，缓慢加入β-环糊精，N2气氛下反应24～28h，减压蒸馏除去大部分DMF，冰水浴条件下缓慢加入甲醇钠溶液，产物在甲醇中沉淀5～7次，然后真空干燥，得到白色固体七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精，将七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精溶解在无水DMF中，加入叠氮钠，N2气氛下升温至60～70℃反应24～28h，减压蒸馏除去部分DMF，然后滴加到大量的水中沉淀，用去离子水反复洗涤多遍，然后室温真空干燥，得到白色固体七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精；
f取七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精和三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物溶于叔丁醇与水的混合溶剂中，搅拌溶解后，将五水硫酸铜和抗坏血酸钠的水溶液，缓慢滴入混合溶剂中，升温到40～50℃并在氮气保护下搅拌反应24～28小时，反应结束后，将反应产物透析，过滤，冷冻干燥得到产物β-CD-PAMAM。
3.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤a中丙炔胺的氨基与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶(3～5)，丙炔胺甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL甲醇溶液中含有1.0～1.2g丙炔胺。
4.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤b中0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子***末端酯基与乙二胺的摩尔比为1∶(10～15)，0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后甲醇溶液中每10mL甲醇溶液中含有1.1～1.5g 0.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。
5.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤c中1代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端氨基与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶(3～5)，1代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL甲醇溶液含有1.0～1.5g 1代聚酰胺-胺树枝状大分子，1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端酯基与乙二胺的摩尔比为1∶(10～15)，1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL甲醇溶液含有1.1～1.5g 1.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。
6.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤d中2代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端氨基与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶(3～5)，2代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL溶液含有1.0～1.5g 2代聚酰胺-胺树枝状大分子，2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子的***末端酯基与乙二胺的摩尔比为1∶(10～15)，2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子甲醇溶液的滴入速度为0.5～1.0mL/分钟，滴加完成后的甲醇溶液中每10mL溶液含有1.1～1.5g 2.5代聚酰胺-胺树枝状大分子。
7.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤e中三苯基膦溶于N，N-二甲基甲酰胺中形成的质量体积比浓度为0.15～0.20g/ml，三苯基膦和碘的摩尔比为1∶(1～1.1)，三苯基膦和β-环糊精的摩尔比为1.5∶1～1.4∶1.1，三苯基膦和甲醇钠的摩尔比为1∶(1.3～1.5)，叠氮钠和β-环糊精的摩尔比为(8～10)∶1。
8.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤f中七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精和三代含炔基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的摩尔比为1∶(7～10)，催化剂五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比是1∶(2～2.5)，混合溶剂中叔丁醇和水的体积比为(1～1.2)∶1，七(6-叠氮-6-去氧)-β-环糊精溶于混合溶剂形成质量体积比浓度为0.1～0.2g/mL，五水硫酸铜溶于混合溶剂形成质量体积比浓度为3～4mg/mL，透析条件为3500Da透析袋透析48～72小时。
9.根据权利要求1所述星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子的分子式如下：
10.权利要求1所述星型阳离子聚合物在RNA干扰MMP-9表达中作为基因转导载体的应用。
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