CN108277279A

CN108277279A - 一种lncRNA在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用

Info

Publication number: CN108277279A
Application number: CN201810091825.7A
Authority: CN
Inventors: 尹崇高; 李洪利; 赵司顺; 李霞; 孙瑞美; 李佩瑞
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: CN108277279B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种lncRNA乳腺癌标志物及敲除其在治疗乳腺癌中的应用。所述lncRNA为Linc00426，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该标志物在乳腺癌细胞中有非常明显的上调，可辅助用于乳腺癌的筛查。此外，本发明发现敲除该lncRNA可有效抑制乳腺癌细胞的侵袭、转移和增殖，可用于治疗乳腺癌。

Description

一种lncRNA在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种lncRNA在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，20世纪末的统计资料表明全世界每年约有130万人诊断为乳腺癌，而有40万人死于该病。同样在20世纪的最后 10年里中国大陆京、津、沪等大城市的乳腺癌的发病率也已位居女性恶性肿瘤的第一、二位。

目前的影像学诊断及病理检测虽然准确性高，但到发现时往往已处于晚期，对治疗极为不利。因此，如何实现对乳腺癌的尽早诊断并有效治疗，是目前乳腺癌患者所亟需的。

RNA按照经典分类方法可分为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA。除此之外，按照是否能够具有编码蛋白功能可分为编码RNA和非编码 RNA(non-coding RNA)。早期，人们对于RNA的研究仅限于编码RNA，但经过研究发现，该部分RNA仅占基因组的1％，剩下的均为非编码RNA。于是，对于非编码RNA功能的挖掘成为了近些年来科学家们关注的重点。而ncRNA根据所含碱基数量的多少又可以分为小分子非编码RNA(miRNA，microRNA)和长链非编码RNA(lncRNA，long non-coding RNA)。其中，miRNA经过这些年的研究已经取得了长足的进步，一些miRNA已经成为肿瘤靶向治疗的新药运用于临床。但lncRNA的研究目前刚处于起步阶段，在这一领域，还有很大的空白需要研究人员去填补。

这些年来，在人类各种肿瘤中，不断有新的异常表达的lncRNA被挖掘。从目前的研究来看，lncRNA在肿瘤中的作用贯穿肿瘤的整个发生和发展的过程中。既可对癌细胞的周期、凋亡、转移等产生影响，也可在表观遗传的层面上宏观调控肿瘤细胞的很多特征。lncRNA与肿瘤的发生和发展有重要关系，因此筛选可有效用于***的lncRNA具有重要的意义。

发明内容

本发明主要目的之一，提供一种诊断乳腺癌的试剂盒，可以使患者得到准确诊断。

本发明目的之二，提供一种治疗乳腺癌的治疗手段和药物组合，实现乳腺癌分子水平的精准治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测Linc00426表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌试剂盒中的用途。

进一步，所述Linc00426在乳腺癌患者中表达上调。

进一步，所述试剂盒包括可以检测Linc00426表达水平的PCR反应试剂。

进一步，所述PCR反应试剂包括可扩增Linc00426cDNA的引物，所述扩增Linc00426cDNA的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明提供了一种Linc00426的用途，用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括Linc00426功能性表达的抑制剂，所述抑制剂能够抑制Linc00426或涉及Linc00426上游或下游途径的物质表达。。

进一步，所述抑制剂是针对Linc00426的RNAi。

进一步，所述RNAi，其shRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括Linc00426功能性表达的抑制剂。

进一步，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

Linc00426位于13号染色体，RNA长度为1045bp，seqname为 ENST00000417079，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明技术人员通过荧光定量PCR检测检测正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞 MDA-MB-231，T47D，MCF-7中Linc00426的表达情况，结果显示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，Linc00426在乳腺癌细胞中的表达明显上调，因此，检测Linc00426表达水平的可用于诊断乳腺癌。

本发明技术人员通过进一步研究，发现转入抑制剂RNAi可以有效抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。

附图说明

图1为荧光定量PCR检测Linc00426在正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，T47D，MCF-7中的表达情况。

图2为GV248慢病毒感染细胞效率图。

图3为伤口愈合实验检测感染前后细胞的迁移能力。

图4为Transwell细胞迁移实验检测感染前后细胞的侵袭能力。

图5为CCK-8检测感染前后细胞的增殖能力。

图6为动物实验结果显示转移到肺的肿瘤结节数。

图7为动物实验结果显示肿瘤的重量的改变。

图注：感染RNAi慢病毒的MDA-MB-231细胞称为SiLinc00426/MDA-MB-231，感染对照慢病毒MDA-MB-231细胞称为Scr/MDA-MB-231。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1、用Invitrogen的TRIzol提取细胞中的总RNA。

1.1吸尽6孔板中正常乳腺上皮细胞MCF-10A或乳腺癌细胞MDA-MB-231， T47D，MCF-7细胞的培养液，每孔加入1ml TRIzol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中。

1.2在装有裂解物的离心管中加入0.2mL的氯仿(1mL TRIzol加入0.2mL 氯仿)，振荡器上充分振荡混匀20秒，室温放置5分钟。12000g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升TRIzol约可吸取 0.6mL上层水相。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。

1.3加入和上层水相等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5分钟。 12000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀。弃上清，按每毫升TRIzol加入1mL 75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀。12000g 4℃离心2分钟，弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀。室温倒置晾干5-10分钟。

1.4溶解：加入适量DEPC处理水使RNA沉淀溶解。存放于-80℃。

2、应用M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA。合成用试剂及条件如下表1 和表2所示：

表1

表2

3、用Bio-Rad的SYBR Green荧光定量PCR试剂盒检测细胞中 Linc00426的表达量。用2^–△△CT法计算Linc00426的相对表达量。Linc00426引物序列如SEQ ID NO.2～3所示，具体如下：forward primer：

5’-GTAAATGCCGGCAGAGCAAG-3’，reverseprimer：

5’-CAGGCAACACCCTCCATTCT-3’。GAPDH作为内参照，结果如图1所示。

由图1可知，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，Linc00426在乳腺癌细胞中的表达明显上调，而且在高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达量最高，在低侵袭性细胞MCF-7中的表达量最低。

实施例2

通过shRNA慢病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，成功敲除细胞中的 Linc00426，并筛选出稳转细胞株，感染RNAi慢病毒的MDA-MB-231细胞称为 SiLinc00426/MDA-MB-231，感染对照慢病毒MDA-MB-231细胞称为 Scr/MDA-MB-231。

Linc00426shRNA慢病毒为上海吉凯基因公司定制，载体名称为GV248。序列为：5’-AAGGATGGAAATACAGAACAA-3’，如SEQ ID NO.4所示。

实施例3

伤口愈合实验检测感染前后细胞的迁移能力：将SiLinc00426/MDA-MB-231 细胞及Scr/MDA-MB-231细胞铺在35mm的培养皿中，生长两天后，去除常规培养液，换成含1％胎牛血清的培养液。用10μL枪头在培养皿底部划出均匀的划痕，在光学显微镜下随机选取三个固定位置记录划痕的宽度。根据划痕宽度的变化判断细胞迁移能力的改变。实验重复三次，用ImageJ统计细胞划痕的面积。

实验结果如图3所示，敲除Linc00426可明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力。

实施例4

Transwell细胞迁移实验检测感染前后细胞的侵袭能力，具体步骤如下：Transwell培养板准备均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel 2-8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μL的Matrigel加入冰预冷的450μL无血清培养基中，混合均匀。取上述稀释的Matrigel 25μL加入Transwell板上室，覆盖整个聚碳酯膜，37℃放置30分钟，使Matrigel聚合成胶。各组细胞用PBS洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液。Transwell培养板上室中加入 2×10⁴细胞悬液并加入无血清培养基200μL。37℃，5％CO₂培养24小时。用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。用4％多聚甲醛固定细胞20分钟。吉姆萨染色35分钟，PBS清洗三遍，于镜下随机选取三个视野拍照取平均值。实验结果如图4所示。结果表明，敲除Linc00426可明显抑制 MDA-MB-231细胞的侵袭能力。

实施例5

CCK-8检测感染前后细胞的增殖能力，细胞增殖实验步骤：

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO₂的条件下)。

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。在培养箱孵育一段适当的时间。

3、向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD值的读数)。在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)。

4、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

5、用酶标仪测定在450nm处的吸光度，得出OD值。

实验结果如图5所示，敲除Linc00426可抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力。

实施例6

SCID鼠皮下成瘤实验：取感染后稳转SiLinc00426/MDA-MB-231和 Scr/MDA-MB-231细胞分别于SCID鼠腋下注射0.2mL(1×10⁶)个细胞，建立 SCID鼠皮下移植瘤模型，定期观察裸鼠皮下肿瘤生长变化情况，并于8周后处死SCID鼠，切除皮下肿瘤及肺组织计数肿瘤的个数重量及肺部的结节并做HE 切片观察肺腺癌的转移情况。

实验结果如图6、图7所示。结果显示注射敲除SiLinc00426/MDA-MB-231 细胞的小鼠皮下肿瘤的大小及数量及肺转移结节数量明显少于注射对照细胞的小鼠。

Claims

1.检测Linc00426表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌试剂盒中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Linc00426在乳腺癌患者中表达上调。

3.一种诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括可以检测Linc00426表达水平的PCR反应试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括可扩增Linc00426cDNA的引物，所述扩增Linc00426cDNA的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

5.一种Linc00426的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括Linc00426功能性表达的抑制剂。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抑制剂是针对Linc00426的RNAi。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述RNAi，其shRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括Linc00426功能性表达的抑制剂。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。