CN110787298A - 可同时负载no和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备与应用 - Google Patents

可同时负载no和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备与应用。所述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料以空心聚多巴胺为核，以树枝状聚酰胺为臂；其制备方法包括以下步骤：(1)合成中空聚多巴胺纳米粒子；(2)叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子；(3)将步骤(2)制得的叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子与树枝状聚酰胺水溶液反应，制得所述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料。以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h‑PDA@PAMAM)可负载多种抗生素，从而极大地增加此纳米中空材料多样性，从而扩宽其在生物材料领域应用范围。

Description

可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的 制备与应用
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域，具体涉及一种可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备与应用。
背景技术
细菌感染所导致的疾病是致死原因之一。尽管在新型药物的开发方面付出了极大的努力，但是细菌感染所诱发的疾病仍然对人类的健康和经济产生重大的影响。近年来由于研究和诊断技术的进步，人们发现那些难治性细菌感染的病灶中大都存在着所谓细菌生物膜的感染源，它的形成和持久性对患者的健康存在着相当大的影响，例如许多顽固性感染难以根除，抗生素治疗难以起到显著效果，并且会导致慢性或复发性感染。事实上，与浮游状态下的单个细菌抵抗力相比较，生物膜状态下的细菌抵抗力则显著增强，能够抵抗诸如大自然中的噬菌体、阿米巴原虫、人类使用的杀菌剂和抗生素等不利因素的攻击。这是由于在细菌数量达到一定程度生物膜形成后，生物膜内的细菌分泌大量的粘性胞外基质，厚厚的粘性胞外基质如装甲一般将细菌包裹起来，从而对不同的抗生素或抗菌剂产生有着令人难以置信的抵抗力。所以生物膜感染所带来的一些列的临床挑战，包括涉及伤口愈合受损，慢性炎症，抗生素抵抗力和传染病传播等，因此迫切需要一种新的治疗理念和方法，能够有效的对抗生物膜和生物膜所引起的感染。
生物膜研究人员已经确认大多数细菌遵循以生物膜方式生长是细菌生长周期的主要阶段，细菌生长方式是通过基因的高度调控和特定表达来实现生物膜生长和浮游状态生长交替转换。近年来，生物信号分子-一氧化氮，一种双原子自由基，被认为是生物膜分散关键的调节剂，而且内源性NO被发现对成熟生物膜具有诱导分散的作用。分子学分析认为，NO能够触发细胞内第二信使环二鸟苷酸(di-GMP)，从而逆向激活一系列可导致生物膜分散的效应物。Nageshwar等发现使用低浓度，安全无毒副作用的NO供体材料能够诱导生物膜细菌恢复到对抗生素或抗菌制剂敏感的范围(Chem.Commun.,2013,49,4791-4793)。此外，最近的一次报道中，Louise等通过使用在特定条件下释放NO气体的供体材料，可以有效地清除动物感染模型的细菌而对宿主并未有太多伤害(Infection and Immunity p.2705–2713)。因此所有的这些综合结果揭开了抗生物膜策略即使用低浓度的NO供体化合物联合抗生素根除细菌生物膜感染。
然而，单一的NO供体在生物学应用上表现出抗菌效果较弱，杀菌效果不明显，特别是针对日益严重的细菌生物膜现象，这极大的限制了任何潜在的应用。为了克服这些问题，NO供体材料与多种抗菌手段相结合(例如抗菌药物)，从而实现NO对细菌生物膜形成过程这一动态过程的有效抑制和成型后的生物膜的消散从而显著提高了抗菌药物的杀菌效果等要求。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料，即以空心聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)。
本发明的另一目的在于提供上述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的应用。
本发明还提供了一种以空心聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂可同时释放一氧化氮(NO)和抗生素哌拉西林(PRL)星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料，其以空心聚多巴胺为核、以树枝状聚酰胺为臂，结构式如图6所示。
上述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)
准备二氧化硅纳米粒子(SiNP)，并将其分散于缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐搅拌反应24～48h，制得聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子(pDA@SiNP)；将pDA@SiNP分散到氢氟酸和氟化铵的混合溶液中继续反应24～48h，制得中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)；
(2)叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于有机溶剂中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化30min～4h；将步骤(1)制得的pDA HNP分散于纯水中，然后加入到活化结束后的叠氮乙酸混合溶液中，室温下反应12～24h，制得叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)；
(3)以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)的合成
参照专利：一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用(专利号为ZL201610356643.9)制备含炔基的三代树枝状聚酰胺(PAMAM)；
将步骤(2)制得的pDA-N3 HNP分散于有机溶剂中，通入保护气体后，加入树枝状聚酰胺(PAMAM)水溶液，然后加入一定质量的五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和抗坏血酸钠(NaVc)，继续通保护气体，于40℃～75℃反应24h～48h，制得以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)。
进一步的，步骤(1)中：
所述的二氧化硅纳米粒子通过以下步骤制备：将体积浓度为25％的氨水、无水乙醇和纯水混合均匀后，加入体积浓度为99％的正硅酸乙酯(TEOS)后体系溶液由透明变成白色，并继续搅拌5～10h，离心除去悬浮液后用乙醇和纯水交替洗涤，得到二氧化硅纳米粒子(SiNP)；所述氨水、无水乙醇、纯水和正硅酸乙酯体积比为1：10～30:2～5：0.5～2；
所述的缓冲液为pH＝7.5～9的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液；
所述二氧化硅纳米粒子与多巴胺盐酸盐的质量比为1：1～5；
所述pDA@SiNP与氢氟酸和氟化铵的混合溶液质量体积比为50～100mg：5～10mL；
所述氢氟酸和氟化铵的混合溶液中氢氟酸和氟化铵摩尔浓度比为1：2～5。
进一步的，步骤(2)中：
所述中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1:1～10：1～10:1～10；
所述的有机溶剂为N-N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜、甲醇等中的至少一种；有机溶剂以每10mL中加入1～5g叠氮乙酸计；
所述的纯水以每10mL中加入0.1g～5g叠氮乙酸计。
进一步的，步骤(3)中：
所述pDA-N3 HNP与树枝状聚酰胺的质量比为1:50～100；
所述PAMAM、CuSO4·5H2O和NaVc的摩尔比为1:7～14:1～3:3～9；
所述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、DMF、四氢呋喃等中的至少一种，所述DMSO以每10mL中加入50～100mg的pDA-N3 HNP计；所述纯水用量以每10mL中加入1～3g的PAMAM计；
所述保护气体为氮气，通入保护气体10～30min后加入树枝状聚酰胺(PAMAM)水溶液。
上述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料可用于负载一氧化氮和抗生素，作为抗菌药物。所述抗生素种类除了PRL之外，还可以负载万古霉素、头孢克肟、氨苄西林、四环素和诺氟沙星等其他类抗生素。
进一步的，上述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料用于负载一氧化氮和哌拉西林，制得一种可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料，具体步骤如下：
a、室温条件下，将上述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)分散于纯水中，然后加入一定质量的抗生素，持续搅拌24～48h，得到负载抗生素的星型中空纳米材料；所述哌拉西林、头孢克肟、万古霉素、氨苄西林、四环素或诺氟沙星；
b、将负载抗生素的星型中空纳米材料干燥后分散于无水甲醇、四氢呋喃或乙腈中，加入甲醇钠搅拌稳定10min～30min后放置于高压反应釜密封，通入高纯氮气排除高压反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应3天～7天，制得可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料。
进一步的，
所述负载抗生素的星型中空纳米材料和抗生素的质量比为1:1～10；所述纯水以每10mL中加入50～100mg的h-PDA@PAMAM计；
所述负载抗生素的星型中空纳米材料和甲醇钠的质量比为1:5～20；所述无水甲醇以每10mL中加入0.1～0.5g的甲醇钠计；
通入高纯氮气维持反应釜10psi～20psi 5min～15min排除反应釜内的空气；所述高纯氮气压力为10psi～20psi，所述NO气体压力为40psi～80psi。
本发明中，所述无水乙醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水乙醇，所述氢化钙的加入量以每500mL乙醇中加入1～2克计；
所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1～2克计；
所述室温为5～35℃。
上述可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料的合成路线如图7所示。
上述可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)可作为新型抗菌药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)采用高代树枝状聚酰胺作为NO供体，极大的提高了NO负载量，对于细菌生物膜的影响具有明显的抑制效果，且对带负电的细菌能够很好的吸附和一定的杀伤效果；
(2)以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)可负载多种抗生素，从而极大地增加此纳米中空材料多样性，从而扩宽其在生物材料领域应用范围；
(3)一种全新的抗耐药菌策略即相比较于单一的NO或是PRL而言，共同负载了NO和PRL的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)对抗浮游菌的效果更加显著；
(4)以星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)为NO供体的设计和构建实现了对NO的高效负载和对生物膜的快速消散，诱导生物膜内的顽固细菌恢复为对抗生素敏感的浮游菌，此时大量PRL从中空纳米粒子中释放出来快速提升局部浓度，从而实现两种释放药物在生物领域的协同作用用于对抗因生物膜存在而出现的耐药性细菌问题；
(5)以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂可同时释放一氧化氮和抗生素哌拉西林星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate))具备有效抑制细菌和真菌的生长和繁殖，对常见的致病菌、皮肤癣菌、伤口感染菌等具有显著的抑制效果，并具有促进伤口愈合和消炎等功能，为其在制备生物医药工程材料的应用提供支持。
附图说明
图1为中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)的TEM图；
图2为星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)合成过程电位变化；
图3为在模拟人体生理条件下，星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)释放NO和PRL动态过程；
图4为星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)相比较于其他材料而言在对浮游状态下大肠杆菌杀菌效果；
图5为h-PDA@PAMAM、h-PDA@PAMAM/PRL和h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate杀菌效果；
图6为本发明可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料结构式；
图7为本发明可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料的合成路线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1～2克计。
以下实施例所述无水***的制备方法按照以下操作步骤：将无水乙醇加入到***中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水乙醇，所述氢化钙的加入量以每500mL乙醇中加入1～2克计。
实施例1
合成中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)
a、将一定体积的浓度为25％的氨水、无水乙醇和纯水混合均匀后加入一定体积浓度为99％的正硅酸乙酯后体系溶液由透明变成白色，并继续搅拌10h，(8000rpm)离心除去悬浮液后并用乙醇和纯水交替洗涤4次，得到二氧化硅纳米粒子(SiNP)；所述氨水、乙醇、纯水和TEOS体积比为1：30：5：2；
b、使用10mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH9)洗涤步骤a所得SiNP 3次后重新分散50mL Tris缓冲液中，然后加入一定质量的多巴胺盐酸盐后搅拌反应48h，纯水离心(8000rpm)洗涤2～3次，最后得到聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子(pDA@SiNP)；所述二氧化硅纳米粒子(SiNP)和多巴胺盐酸盐的质量比为1：5；
c、将100mg步骤b得到的pDA@SiNP纳米粒子分散到10mL氢氟酸和氟化铵的混合溶液中继续反应48h后，离心(8000rpm)纯水洗涤3次，最终得到中空聚多巴胺纳米粒子(pDAHNP)。所述氢氟酸和氟化铵摩尔浓度比为1:5。
实施例2
合成中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)
d、将一定体积的浓度为25％的氨水、无水乙醇和纯水混合均匀后加入一定体积浓度为99％的正硅酸乙酯后体系溶液由透明变成白色，并继续搅拌5h，(5000rpm)离心除去悬浮液后并用乙醇和纯水交替洗涤2次，得到二氧化硅纳米粒子(SiNP)；所述氨水、乙醇、纯水和TEOS体积比为1：10：2：0.5；
e、使用10mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7.5)洗涤步骤a所得SiNP 2～3次后重新分散30mL Tris缓冲液中，然后加入一定质量的多巴胺盐酸盐后搅拌反应24h，纯水离心(5000rpm)洗涤2次，最后得到聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子(pDA@SiNP)；所述二氧化硅纳米粒子(SiNP)和多巴胺盐酸盐的质量比为1:1；
f、将50mg步骤b得到的pDA@SiNP纳米粒子分散到5mL氢氟酸和氟化铵的混合溶液中继续反应24h后，离心(5000rpm)纯水洗涤2次，最终得到中空聚多巴胺纳米粒子(pDAHNP)。所述氢氟酸和氟化铵摩尔浓度比为1:2。
实施例3
叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化30min(指加入EDC·HCl、NHS后总共活化30min。下同)；活化结束后将实施例1所得的中空聚多巴胺纳米粒子分散于纯水，然后缓慢加入到上述叠氮乙酸混合溶液中，室温下反应12h。离心(5000rpm)纯水洗涤2次(离心后纯水重新悬浮再离心去除纯水后再加入新的纯水分散后离心，重复多次，此步骤统称为纯水离心洗涤。下同)，最终得到中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)。所述中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1：1：1：1；所述的N,N-二甲基甲酰胺以每10毫升中加入1g叠氮乙酸计；所述的纯水以每10mL中加入0.1g叠氮乙酸计。
实施例4
叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化4h；活化结束后将实施例2所得的中空聚多巴胺纳米粒子分散于纯水，然后缓慢加入到上述叠氮乙酸混合溶液中，室温下反应24h。离心(8000rpm)纯水洗涤3次，最终得到中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)。所述中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1:10：10:10；所述的N,N-二甲基甲酰胺以每10毫升中加入5g叠氮乙酸计；所述的纯水以每10mL中加入5g叠氮乙酸计。
实施例5
含炔基的三代树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成
参照专利：一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用(专利号为ZL201610356643.9)中具体实施4所得。
实施例6
含炔基的三代树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成
参照专利：一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用(专利号为ZL201610356643.9)中具体实施5所得。
实施例7
以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)的合成
将50mg实施例3中所得pDA-N3 HNP分散于二甲基亚砜(DMSO)，通入氮气20min后，缓慢加入实施例5中所得树枝状聚酰胺(PAMAM)水溶液；pDA-N3 HNP与树枝状聚酰胺的质量比为1:50。然后再加入一定质量的五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和抗坏血酸钠(NaVc)，继续通氮气，于60℃反应24h。最后反应液离心(6000rpm)纯水洗涤2次，得到以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)。所述PAMAM、CuSO4·5H2O和NaVc的摩尔比为1:10:2:6；所述DMSO以每10mL中加入50mg的pDA-N3HNP计；所述纯水用量以每10mL中加入2g的PAMAM计。
实施例8
以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)的合成
将100mg实施例4中所得pDA-N3 HNP分散于二甲基亚砜(DMSO)，通入氮气30min后，缓慢加入实施例6中所得树枝状聚酰胺(PAMAM)水溶液；pDA-N3 HNP与树枝状聚酰胺的质量比为1：100。然后再加入一定质量的五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和抗坏血酸钠(NaVc)，继续通氮气，于75℃反应48h。最后反应液离心(8000rpm)纯水洗涤3次，得到以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)。所述PAMAM、CuSO4·5H2O和NaVc的摩尔比为1:14:3:9；所述DMSO以每10mL中加入100mg的pDA-N3HNP计；所述纯水用量以每10mL中加入3g的PAMAM计。
实施例9
抗生素万古霉素(NVA)、头孢克肟(CFM)和一氧化氮(NO)气体共负载即最终产物的合成
(1)a、室温25℃条件下，将一定质量实施例7所得的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)分散于一定体积纯水中，然后缓慢加入一定质量的PRL后，持续搅拌48h，最后离心(8000rpm)纯水洗涤3次，最终得到负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)。所述h-PDA@PAMAM和PRL的质量比为1:10；所述纯水以每10mL中加入100mg的h-PDA@PAMAM计；
b、室温25℃条件下，将一定质量实施例7所得的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)分散于一定体积纯水中，然后缓慢加入一定质量的万古霉素(NVA)后，持续搅拌48h，最后离心(8000rpm)纯水洗涤3次，最终得到负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/NVA)。所述h-PDA@PAMAM和NVA的质量比为1:10；所述纯水以每10mL中加入100mg的h-PDA@PAMAM计；
c、室温25℃条件下，将一定质量实施例7所得的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)分散于一定体积纯水中，然后缓慢加入一定质量的头孢克肟(CFM)后，持续搅拌48h，最后离心(8000rpm)纯水洗涤3次，最终得到负载CFM的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/CFM)。所述h-PDA@PAMAM和PRL的质量比为1:10；所述纯水以每10mL中加入100mg的h-PDA@PAMAM计；
(2)将步骤(1)所得的负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)干燥后分散于无水甲醇后，加入甲醇钠搅拌稳定30min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(20psi)15min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(80psi)室温下反应7天。反应结束后，NO被20psi的高纯氮气排出并继续维持20min后打开反应釜，取出反应产物。用无水甲醇离心(8000rpm)洗涤3次，真空干燥低温保存最终产物即以中空聚多巴胺为核和3代树枝状聚酰胺为臂共负载抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)。所述h-PDA@PAMAM/PRL和甲醇钠的质量比为1:10；所述无水甲醇以每10mL中加入0.5g的甲醇钠计。
实施例10
抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)气体共负载即最终产物h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate的合成
(1)室温35℃条件下，将一定质量实施例8所得的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)分散于一定体积纯水中，然后缓慢加入一定质量的PRL后，持续搅拌24h，最后离心(5000rpm)纯水洗涤2次，最终得到负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)。所述h-PDA@PAMAM和PRL的质量比为1:5；所述纯水以每10mL中加入50mg的h-PDA@PAMAM计；
(2)将步骤(1)所得的负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)干燥后分散于无水甲醇后，加入甲醇钠搅拌稳定10min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(10psi)15min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(40psi)室温下反应3天～7天。反应结束后，NO被10psi的高纯氮气排出并继续维持20min后打开反应釜，取出反应产物。用无水甲醇离心(5000rpm)洗涤2次，真空干燥低温保存最终产物即以中空聚多巴胺为核和3代树枝状聚酰胺为臂共负载抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)。所述h-PDA@PAMAM/PRL和甲醇钠的质量比为1:5；所述无水甲醇以每10mL中加入0.1g的甲醇钠计。
实施例11
取5mg实施例1所得中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)分散到10mL乙醇溶液中，超声分散均匀后滴加到铜网上进行观察，结果如图1所示，聚多巴胺纳米粒子pDA HNP粒径均一，中空结构明显，证明我们已经成功制备中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)。
实施例12
分别取1mg实施例2所得中空聚多巴胺纳米粒子(pDAHNP)、实施例3所得叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子(pDA-N3 HNP)、实施例7所得以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)、实施例9所得负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)和最终产物中空聚多巴胺为核和3代树枝状聚酰胺为臂共负载抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)分散于1mL纯水后测定不同纳米粒子表面电位变化，结果如图2所示，我们发现经叠氮化修饰后的纳米粒子电位相比于中空聚多巴胺纳米粒子(pDAHNP)更低了，这是由于叠氮基团的成功修饰造成电位的负变化。然而将树枝状PAMAM点击到中空聚多巴胺纳米粒子后得到的h-PDA@PAMAM的电位发生了很大的变化，由原来的负电位变成了正电位，这表明PAMAM的成功修饰到了中空聚多巴胺纳米粒子表面。将PRL和NO继续负载到h-PDA@PAMAM后，纳米粒子表面的电位相比较于PRL而言，负载完NO后的纳米粒子电位下降幅度较大，这是因为NO的负载导致仲胺基团的占用，从而使其纳米粒子表面电位下降较为明显，这也更加证明了最终产物即星型空心纳米粒子h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate的成功制备。
实施例13
将实施例1所得中空聚多巴胺纳米粒子(pDAHNP)、实施例7得到的中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)、实施例9得到的单负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)和双负载抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)通过溴化钾压片法进行红外光谱表征。结果如图3所示，对于h-PDA@PAMAM而言，在3265cm-1为N-H的吸收峰；2940cm-1和2840cm-1为-CH2-的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰；1650cm-1和1560cm-1是酰胺基的特征谱带，分别称为酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ谱带，前者为羧基伸缩振动引起的，后者是-CONH-中的N-H键弯曲变形振动和C-N键的伸缩振动引起的；1120cm-1和1035cm-1分别为伯胺和叔胺的伸缩振动峰，这两个吸收峰均较弱。红外光谱的分析结果表明，该样品中含有-NH2、-CH2-、-CONH-等特征基团，与PAMAM结构特征相符，结果证明中空聚多巴胺纳米粒子(pDA HNP)表面成功修饰三代树枝状聚酰胺，也就是说中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)的成功制备。同样的在h-PDA@PAMAM/PRL光谱图中，发现3046cm-1、1607cm-1和1500cm-1为抗生物PRL内酰胺键特征吸收峰，1374cm-1和2970cm-1为PCR上-C(CH3)2-特征吸收峰，所以证明抗生素PRL的成功负载。同样在3265cm-1处N-H特征峰的减弱，以及1300cm-1处为NONOate特征吸收峰出现，证明NO已成功修饰负载，证明双负载抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)成功制备。
实施例14
分别取10mg实施例9所得抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)气体共负载的最终产物h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate、单负载其他类抗生素(万古霉素(NVA)和头孢克肟(CFM))所得的h-PDA@PAMAM/NVA和h-PDA@PAMAM/CFM分散于10mL PBS(pH7.4)缓冲液中，并置于37℃恒温摇床中，每隔一段时间将纳米粒子震荡均匀后取1mL溶液离心取上清，使用格里斯测定纳米粒子h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate释放液在OD＝540nm处的吸光度，并使用NO标准曲线(Y＝0.0052X-0.0118,R2＝0.999；其中X代表NO摩尔浓度，Y代表使用OD540的吸光度)计算出最终h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate纳米粒子在每个时间点的NO释放量。同时，使用HPLC测定上清液在OD＝206nm、288nm和281nm处吸收值并计算PRL、CFM和NVA释放量。实验结果如图4所示，我们发现NO释放速度相对较快，且释放半衰期在1.5h左右，释放周期为20h，然而PRL、CFM和NVA的释放速率相对较慢，我们推测可能是由于树枝状PAMAM内部结构，从而使小分子药物释放速率变慢，具有一定缓释效果，且由于多种抗生素负载特性，这也间接证明此h-PDA@PAMAM纳米粒子在药物递送方面的潜在优势。
实施例15
分别取相同质量的实施例8所得以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM)、实施例10所得负载PRL的星型中空纳米材料(h-PDA@PAMAM/PRL)和最终产物中空聚多巴胺为核和3代树枝状聚酰胺为臂共负载抗生素哌拉西林(PRL)和一氧化氮(NO)的星型空心纳米粒子(h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate)与相同浓度且处于生长对数期的大肠杆菌培养4h，离心去除材料将细菌液进行铺板并置于培养箱中12h后计算琼脂板上细菌数量，结果如图5所示，我们发现相较于h-PDA@PAMAM而言，负载了抗生素的h-PDA@PAMAM/PRL在抗菌效果上要明显的增强，但是杀菌效果依然不明显，然而将NO负载后的h-PDA@PAMAM/PRL/NONOate杀菌效果有了明显的提升，这说明相较于单一的抗菌方式而言，将NO和PRL一起作用于细菌所表现出的协同效果较为显著，这也直观的证明了我们材料设计合理性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成中空聚多巴胺纳米粒子
准备二氧化硅纳米粒子，并将其分散于缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐搅拌反应24～48h，制得聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子；将聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子分散到氢氟酸和氟化铵的混合溶液中继续反应24～48h，制得中空聚多巴胺纳米粒子；
(2)叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子
将叠氮乙酸溶于有机溶剂中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化30min～4h；将步骤(1)制得的中空聚多巴胺纳米粒子分散于纯水中，然后加入到活化结束后的叠氮乙酸混合溶液中，室温下反应12～24h，制得叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子；
(3)以中空聚多巴胺为核和树枝状聚酰胺为臂星型中空纳米材料的合成
将步骤(2)制得的叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子分散于有机溶剂中，通入保护气体后，加入树枝状聚酰胺水溶液，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠，继续通保护气体，于40℃～75℃反应24h～48h，制得所述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料。
2.根据权利要求1所述的可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：
所述的二氧化硅纳米粒子通过以下步骤制备：将体积浓度为25％的氨水、无水乙醇和纯水混合均匀后，加入体积浓度为99％的正硅酸乙酯后体系溶液由透明变成白色，并继续搅拌5～10h，离心除去悬浮液后用乙醇和纯水交替洗涤，得到二氧化硅纳米粒子；所述氨水、无水乙醇、纯水和正硅酸乙酯体积比为1：10～30:2～5：0.5～2；
所述的缓冲液为pH＝7.5～9的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
所述二氧化硅纳米粒子与多巴胺盐酸盐的质量比为1：1～5；
所述聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子与氢氟酸和氟化铵的混合溶液质量体积比为50～100mg：5～10mL；
所述氢氟酸和氟化铵的混合溶液中氢氟酸和氟化铵摩尔浓度比为1：2～5。
3.根据权利要求1所述的可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：
所述中空聚多巴胺纳米粒子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和叠氮乙酸的摩尔比为1:1～10：1～10:1～10；
所述的有机溶剂为N-N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇中的至少一种；有机溶剂以每10mL中加入1～5g叠氮乙酸计；
所述的纯水以每10mL中加入0.1g～5g叠氮乙酸计。
4.根据权利要求1所述的可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中：
所述叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子与树枝状聚酰胺的质量比为1:50～100；
树枝状聚酰胺、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:7～14:1～3:3～9；
所述有机溶剂为二甲基亚砜、DMF、四氢呋喃中的至少一种，所述有机溶剂以每10mL中加入50～100mg的叠氮基团修饰的中空聚多巴胺纳米粒子计；所述纯水用量以每10mL中加入1～3g的树枝状聚酰胺计；
所述保护气体为氮气，通入保护气体10～30min后加入树枝状聚酰胺水溶液。
5.一种可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料，其特征在于，其以空心聚多巴胺为核、以树枝状聚酰胺为臂，由权利要求1-4任一项所述的制备方法制得。
6.权利要求5所述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料的应用，其特征在于，该星型中空纳米材料在负载一氧化氮和抗生素后作为抗菌药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗生素为哌拉西林、万古霉素、头孢克肟、氨苄西林、四环素或诺氟沙星。
8.一种可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料，其特征在于，所述星型纳米材料具体制备步骤如下：
a、室温条件下，将权利要求5所述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料分散于纯水中，然后加入一定质量的抗生素，持续搅拌24～48h，得到负载抗生素的星型中空纳米材料；
b、将负载抗生素的星型中空纳米材料干燥后分散于无水甲醇、四氢呋喃或乙腈中，加入甲醇钠搅拌稳定10min～30min后放置于高压反应釜密封，通入高纯氮气排除高压反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应3天～7天，制得可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料。
9.根据权利要求8所述的可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料，其特征在于，
所述可同时负载NO和抗生素用于协同抗菌的星型中空纳米材料和抗生素的质量比为1:1～10；
所述负载抗生素的星型中空纳米材料和甲醇钠的质量比为1:5～20；
通入高纯氮气维持反应釜10psi～20psi 5min～15min排除反应釜内的空气；所述高纯氮气压力为10psi～20psi，所述NO气体压力为40psi～80psi。
10.权利要求8或9所述可释放NO和抗生素用于协同抗菌的星型纳米材料在制备***药物中的应用。
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