CN102199205A - 一种多肽胸腺法新的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽固相合成胸腺法新的制备方法，所述的方法包括步骤：(1)将Fmoc-Asn(Trt)-OH和羟基官能树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Asn(Trt)-树脂；(2)将Fmoc-Asn(Trt)-树脂和去保护剂混合，得到Asn(Trt)-树脂；(3)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Asn(Trt)-树脂缩合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-树脂；(4)按照固相合成的方法重复步骤(2)和(3)的脱Fmoc和将氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按照Glu至Ser的顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和(5)使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的胸腺法新。
Description
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及胸腺法新的固相合成方法。
背景技术
胸腺肽(又名胸腺素、胸腺五肽、Thymosin)是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽。能促进淋巴细胞转化，增强巨噬细胞吞噬活性，可用于治疗多种免疫缺陷病。
单用胸腺法新(Thymosin α1)治疗慢性乙肝中内外有研究表明，单用胸腺法新治疗慢性乙肝，持续应答率(ALT复常+DNA转阴+HBeAg转阴)在37％左右，与单用干扰素相近，不过没有干扰素的毒副作用。
在中国台湾应用胸腺法新治疗慢性乙肝的临床研究表明，胸腺法新具有延迟的治疗效应。当胸腺法新治疗结束后，ALT有一过性升高，同时伴有HBeAg的血清转换，HBV DNA消失。
HBV DNA转阴率及血清转换优越性的研究结果表明：单用胸腺法新治疗慢性乙肝有长期疗效，而没有明显不良反应。对于晚期肝纤维化患者，高剂量的胸腺法新治疗效果较好。
目前化学合成胸腺肽有主要有固相合成法，如第八届中国化学会分析化学年会暨第八届全国原子光谱学术会议上报道了化学合成胸腺法新的分离与纯化工艺研究，对Fmoc固相方法合成胸腺法新进行分析
虽然固相合成工艺已经非常成熟，但是很难合成的序列的氨基酸的最终产率可能会很低(30％-45％)，从经济的角度来看这可能会限制工艺的放大，从制药行业对多肽纯度的要求来看会导致多肽纯度不足。
胸腺肽的酸性残留位置、β氨基酸(Thr-Thr，Val-Val)的连续存在和需要大量的保护基来保护多肽(20个侧链保护基团)，此外，据报道，这个肽的两个片段(1-10和11-28)可以形成β-折叠结构，所有的这些特征表明用现有的固相合成多肽的方法来合成该多肽是非常困难的。
因此本领域迫切需要提供一种简便有效的合成胸腺法新的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽固相合成胸腺法新的制备方法。
本发明提供了一种如式I所示的胸腺法新的固相合成制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)将Fmoc-Asn(Trt)-OH和羟基官能树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Asn(Trt)-树脂；
(2)将Fmoc-Asn(Trt)-树脂和去保护剂混合，得到Asn(Trt)-树脂；
(3)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Asn(Trt)-树脂缩合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-树脂；
(4)按照固相合成的方法重复步骤(2)和(3)的脱Fmoc和将氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按照Glu至Ser的顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和
(5)使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的胸腺法新；
在上述制备方法中，所述的酯化反应是将Fmoc-Asn(Trt)-OH、羟基官能树脂和2，6-二氯苯甲酰氯在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中混合进行。
在上述制备方法中，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有3％-20％哌啶，0.5％-10％二环脒(DBU)，和01M-0.5M1-羟基苯并***(HOBt)；所述的另一种去保护剂，以其总体积计，其中含有1％-10％哌嗪和0.1M-0.5M1-羟基苯并***(HOBt)。
在上述制备方法中，所述的氨基酸和树脂的缩合在在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下进行：N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三羟甲基丙烷(TMP)、二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并***(HOBt)；较佳地，所述的缩合剂中含有N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并***(HOBt)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和三羟甲基丙烷TMP)；较佳地，所述的缩合剂中含有N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并***(HOBt)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)。
在上述制备方法中，步骤(5)在各物质配比为92-97三氟乙酸(TFA)∶1.5-4三异丙基硅烷(TIS)∶1.5-4水的切割剂存在下进行。
在上述制备方法中，所述的羟基官能树脂选自PEG-王树脂、200 PHB，
400 PHB，NovaPEG王树脂。
据此，本发明提供了一种简便有效的合成胸腺法新的方法。
附图说明
图1显示了本发明制备Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂的流程。
图2显示了本发明固相合成胸腺法新的流程。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了一个简单明了的固相合成胸腺法新的方法，一是对羟基官能树脂酯化，这样产率更高且保持了立体化学的完整性；二是选择了以PEG为固体载体和DIC/HOBT为主要活化剂、TBTU/TMP或TBTU/DIPEA为辅助活化剂，DMF/DCM作为溶剂，Piperidine/DBU/HOBt的DMF溶液或piperazine/HOBt/DMF作为脱保护剂；三是用TFA/TIS/H2O作为切割液。
本发明中所使用的缩写或英文全称的含义列于下表：
| PEG | 聚乙二醇 |
| Fmoc | 9芴甲氧羰基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| DBU | 1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯 |
| HOBt | 1-羟基苯并*** |
| DIC | N，N′-二异丙基碳二亚胺 |
| TBTU | 苯并***四甲基脲四氟硼酸 |
| DIPEA | 二异丙基乙胺 |
| TMP | 三羟甲基丙烷 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| Piperidine | 哌啶 |
| Piperazine | 哌嗪 |
| Pyridine | 吡啶 |
| Ac2O | 乙酸酐 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| MTBE | 甲基叔丁基醚 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| tBu | 叔丁基，-C(CH3)3 |
| OtBu | -O-C(CH3)3 |
| 2，6-dichlorobenzoylchloride | 2，6-二氯苯甲酰氯 |
如本文所用，“固相合成”或“多肽固相合成(solid phase peptide synthesis)”是一种本领域熟知的多肽合成技术，包括但不限于下述方法：将一个氨基被保护的氨基酸共价连接(键合)在固相载体上；在去保护剂存在下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸接到固相载体上；然后氨基被封闭(保护)的第二个氨基酸的羧基通过活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应(缩合)形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去氨基的保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键(切割)，得到合成好的肽。
如本文所用，“去保护剂”或“脱保护剂”可以互换使用，都是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc；优选地，本发明的去保护剂以其总体积计，含有3％-20％哌啶，0.5％-10％二环脒(DBU)，和0.1M-0.5M1-羟基苯并***(HOBt)，或是含有1％-10％哌嗪和0.1M-0.5M1-羟基苯并***(HOBt)。
如本文所用，“缩合剂”、“活化剂”、或“缩合活化剂”可以互换使用，都是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，碳二亚胺、ByPOB、HATU、TBTU、TMP、DIPEA。
如本文所用，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。
在本发明的一个实例中，本发明多肽固相合成胸腺法新的制备方法包括以下步骤：
第一步，将Fmoc-Asn(Trt)-OH和树脂键合，得到Fmoc-Asn(Trt)-树脂；优选使用羟基官能树脂，更优选PEG-Wang树脂，所述PEG-Wang树脂的替代率为0.2-0.8mmol/g；
第二步，将本发明的去保护剂和Fmoc-Asn(Trt)-树脂混合，脱除Fmoc基团，得到Asn(Trt)-树脂；
第三步，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Asn(Trt)-树脂缩合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-树脂；
第四步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团；
第五步，重复上述肽键形成步骤，使肽链从C端向N端生长，直至得到FmocSer(tBu)Asp(OtBu)AlaAlaValAsp(OtBu)Thr(tBu)Ser(tBu)Ser(tBu)Glu(OtBu)IleThr(tBu)Thr(tBu)Lys(Boc)Asp(OtBu)LeuLys(Boc)Glu(OtBu)Lys(Boc)Lys(Boc)Glu(OtBu)ValValGlu(OtBu)Glu(OtBu)AlaGlu(OtBu)Asn(Trt)-树脂；(OtBu/tBu是保护基，最后会被脱除)
第六步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团；
第七步，在切割剂存在下，使多肽树脂上的如式I所示多肽和树脂分离，得到胸腺法新；所述切割剂中含有TFA、TIS和水。
在本发明的一个优选例中，第一步中将Fmoc-Asn(Trt)-OH、树脂、2，6-二氯苯甲酰氯在DMF溶液中混合，进行酯化反应。
在本发明的一个优选例中，第三和/或第五步肽键形成的反应中，将1.0-4.5倍树脂当量的Fmoc-氨基酸(或多肽)，和2.0-6.0倍树脂当量的HOBt用3mL/g树脂量的DMF/DCM(体积比1∶1)溶解，再加入1.0-6.0倍树脂当量的的DIC反应45分钟后再加入1.0-6.0倍树脂当量的的DIC反应，在整个反应过程中用茚三酮显色法(Kaiser)测试(Kaiser test)监控。如果反应不完全，另外加入含有相应的Fmoc保护的氨基酸的DMF/DCM(体积比1∶1)溶液，然后再加入1.0-3.0倍树脂当量的TBTU和2.0-6.0倍树脂当量的TMP(或DIPEA)使反应完全。
有关茚三酮显色法(Kaiser)测试法，及其监控方法可以参见文献VIRENDER K.SARIN，et al.“Quantitative Monitoring of Solid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction”ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 117，147-157(1981)、E.KAISER，et al.“Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides”SHORT COMMUNICATIONS 595-598(Received October 28，1969)、和THORKILD CHRISTENSEN“ A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid Phase Peptide Synthesis Using Chlo
通过本发明提供的制备方法得到的胸腺法新，产率和纯度都较为理想。在本发明的一个优选例中，还可以将第七步得到的胸腺法新进行沉降，即将第七步得到的如式I的多肽和MTBE或***混合，形成多肽沉淀，得到纯化的胸腺法新。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、制备方法简便。
2、收率和纯度理想。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例中，胸腺法新粗品纯度的测定方法为：
仪器Agilent1200，色谱柱Kromasil 100-5C18
紫外波长：215nm
柱温：30℃
流动相流速：1.0ml/min
流动相A：0.1％TFA/水 流动相B：0.1％TFA/ACN
洗脱梯度：10％-30％B 洗脱40分钟
实施例中的PEG-王树脂(PEG grafted Wang resin(0.72mmol/g))购自Rapp Polymere GmbH(Tübingen Germany)
实施例1
制备Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂
将15g PEG-王树脂(取代度为0.5-0.7mmol/g)浸泡在150mlDMF中30分钟，抽干，将3.0当量(19.33g，32.4mmole)Fmoc-Asn(Trt)-OH，4.8当量(7.41mL，51.8mmol)2，6-dichlorobenzoylchloride和8.4当量(7.4mL，90.7mmol)DMF溶液混合，酯化反应3小时。然后树脂用DMF洗涤，用100mL10％pyridine/DMF和100mL 10％benzoyl chloride(苯甲酰氯)/DMF混合液对树脂进行封端，1小时。用DMF和甲醇洗涤树脂，真空烘干，测取代度(取代度0.43mmol/g)。见图1。
Fmoc脱保护
用0.2MHOBt/6％piperazine/DMF脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaiser test检测评估Fmoc脱除。
Fmoc氨基酸缩合
向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(1.5当量/2当量)的DMF/DCM(体积比为1∶1)溶液(3ml/g树脂)，随后加DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)，45分钟后再加入DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。增长的肽链树脂用甲醇洗涤后彻底抽干。如果反应不完全，那么另外加入Fmoc-AA-OH(0.5当量)的DMF溶液，反应10小时以上，用Kaiser test监控，如果反应不完全，抽干溶液，用甲醇/DMF洗涤，加入Fmoc-AA-OH(1.5当量)的DMF/DIC(体积比为1∶1)溶液(4ml/g树脂)，然后加入2.0当量TBTU，4.0当量TMP，反应完全后用甲醇洗涤树脂。
如果重新缩合后α-端氨基还没缩合完，则用乙酸酐进行封端，乙酸酐/吡啶/DMF(体积比为6∶5∶50)，用DMF和MTBE洗涤，干燥称重。
切割
切割液配置
在合适大小的容器中按体积比混合TFA∶TIS∶水(92v∶4v∶4v)，用制冷剂或冰水冷却切割液。
切割
向冷却的切割液中缓慢的加入多肽树。搅拌回温2-3小时至25℃±5℃。过滤或离心去除树脂并用三氟乙酸洗涤树脂两次。收集滤液包装树脂。
沉降
浓缩好的滤液(约每1ml滤液10ml MTBE)倒入冷却好的甲基叔丁醚(MTBE)，(0-8℃)里沉降。冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或离心得虑饼，用冷冻的MTBE彻底洗涤虑饼三次。
粗品干燥
将粗品多肽转移至干燥器，真空下干燥至少12小时。
合成粗品纯度为52.6％，合成得率为55.8％。
流程可参见图2。
实施例2
制备Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂
将15g PEG-王树脂(取代度为0.5-0.75mmol/g)浸泡在150mlDMF中30分钟，抽干，将3.0当量(19.33g，32.4mmole)Fmoc-Asn(Trt)-OH，4.8当量(7.41mL，51.8mmol)2，6-dichlorobenzoylchloride和8.4当量(7.4mL，90.7mmol)DMF溶液混合，酯化反应3小时。然后树脂用DMF洗涤，用100mL10％pyridine/DMF和100mL 10％benzoyl chloride/DMF混合液对树脂进行封端，1小时。用DMF和甲醇洗涤树脂，真空烘干，测取代度。
Fmoc脱保护
用0.1MHOBt/10％piperazine/DMF脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaiser test检测评估Fmoc脱除。
Fmoc氨基酸缩合
向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(2当量/3当量)的DMF/DCM(体积比为1∶1)溶液(3ml/g树脂)，随后加DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)，45分钟后再加入DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。增长的肽链树脂用甲醇洗涤后彻底抽干。如果反应不完全，那么另外加入Fmoc-AA-OH(0.5当量)的DMF溶液，反应10小时以上，用Kaiser test监控，如果反应不完全，抽干溶液，用甲醇/DMF洗涤，加入Fmoc-AA-OH(1.5当量)的DMF/DIC(体积比为1∶1)溶液(4ml/g树脂)，然后加入1.45当量TBTU，3.0当量DIPEA，反应完全后用甲醇洗涤树脂。
如果重新缩合后α-端氨基还没缩合完，则用乙酸酐进行封端，乙酸酐/吡啶/DMF(体积比为6∶5∶50)，用DMF和MTBE洗涤，干燥称重。
切割
切割液配置
在合适大小的容器中按体积比混合TFA∶TIS∶水(94v∶3v∶3v)，用制冷剂或冰水冷却切割液。
切割
向冷却的切割液中缓慢的加入多肽树。搅拌回温2-3小时至25℃±5℃。过滤或离心去除树脂并用三氟乙酸洗涤树脂两次。收集滤液包装树脂。
沉降
浓缩好的滤液(约每1ml滤液10ml MTBE)倒入冷却好的甲基叔丁醚(MTBE)，(0-8℃)里沉降。冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或离心得虑饼，用冷冻的MTBE彻底洗涤虑饼三次。
粗品干燥
将粗品多肽转移至干燥器，真空下干燥至少12小时。
合成粗品纯度为69.6％，合成得率为56.6％。
实施例3
制备Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂
将15g PEG-王树脂(取代度为0.4-0.8mmol/g)浸泡在150mlDMF中30分钟，抽干，将3.0当量(19.33g，32.4mmole)Fmoc-Asn(Trt)-OH，4.8当量(7.41mL，51.8mmol)2，6-dichlorobenzoylchloride和8.4当量(7.4mL，90.7mmol)DMF溶液混合，酯化反应3小时。然后树脂用DMF洗涤，用100mL10％pyridine/DMF和100mL 10％benzoyl chloride/DMF混合液对树脂进行封端，1小时。用DMF和甲醇洗涤树脂，真空烘干，测取代度。
Fmoc脱保护
用1％HOBt/3-20％piperidine/0.5-10％DBU/DMF脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaiser test检测评估Fmoc脱除。
Fmoc氨基酸缩合
向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(1.0当量/3当量)的DMF/DCM(体积比为1∶1)溶液(3ml/g树脂)，随后加DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)，45分钟后再加入DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。增长的肽链树脂用甲醇洗涤后彻底抽干。如果反应不完全，那么另外加入Fmoc-AA-OH(0.5当量)的DMF溶液，反应10小时以上，用Kaiser test监控，如果反应不完全，抽干溶液，用甲醇/DMF洗涤，加入Fmoc-AA-OH(1.5当量)的DMF/DIC(体积比为1∶1)溶液(4ml/g树脂)，然后加入1.45当量TBTU，3.0当量TMP，反应完全后用甲醇洗涤树脂。
如果重新缩合后α-端氨基还没缩合完，则用乙酸酐进行封端，乙酸酐/吡啶/DMF(体积比为6∶5∶50)，用DMF和MTBE洗涤，干燥称重。
切割
切割液配置
在合适大小的容器中按体积比混合TFA∶TIS∶水(96v∶2v∶2v)，用制冷剂或冰水冷却切割液。
切割
向冷却的切割液中缓慢的加入多肽树。搅拌回温2-3小时至25℃±5℃。过滤或离心去除树脂并用三氟乙酸洗涤树脂两次。收集滤液包装树脂。
沉降
浓缩好的滤液(约每1ml滤液10ml MTBE)倒入冷却好的甲基叔丁醚(MTBE)，(0-8℃)里沉降。冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或离心得虑饼，用冷冻的MTBE彻底洗涤虑饼三次。
粗品干燥
将粗品多肽转移至干燥器，真空下干燥至少12小时。
合成粗品纯度为65.4％，合成得率为63.7％。
实施例4
制备Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂
将15g PEG-王树脂(取代度为0.2-0.7mmol/g)浸泡在150mlDMF中30分钟，抽干，将3.0当量(19.33g，32.4mmole)Fmoc-Asn(Trt)-OH，4.8当量(7.41mL，51.8mmol)2，6-dichlorobenzoylchloride和8.4当量(7.4mL，90.7mmol)DMF溶液混合，酯化反应3小时。然后树脂用DMF洗涤，用100mL10％pyridine/DMF和100mL 10％benzoyl chloride/DMF混合液对树脂进行封端，1小时。用DMF和甲醇洗涤树脂，真空烘干，测取代度。
Fmoc脱保护
用0.1MHOBt/3％piperazine/DMF脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaisertest检测评估Fmoc脱除。
Fmoc氨基酸缩合
向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(1.5当量/3当量)的DMF/DCM(体积比为1∶1)溶液(3ml/g树脂)，随后加DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)，45分钟后再加入DIC(1.0-3.0当量相对于Fmoc-Asn(Trt)-PEG-王树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。增长的肽链树脂用甲醇洗涤后彻底抽干。如果反应不完全，那么另外加入Fmoc-AA-OH(0.5当量)的DMF溶液，反应10小时以上，用Kaiser test监控，如果反应不完全，抽干溶液，用甲醇/DMF洗涤，加入Fmoc-AA-OH(1.5当量)的DMF/DIC(体积比为1∶1)溶液(4ml/g树脂)，然后加入1.45当量TBTU，3.0当量TMP，反应完全后用甲醇洗涤树脂。
如果重新缩合后α-端氨基还没缩合完，则用乙酸酐进行封端，乙酸酐/吡啶/DMF(体积比为6∶5∶50)，用DMF和MTBE洗涤，干燥称重。
切割
切割液配置
在合适大小的容器中按体积比混合TFA∶TIS∶水(95v∶2.5v∶2.5v)，用制冷剂或冰水冷却切割液。
切割
向冷却的切割液中缓慢的加入多肽树。搅拌回温2-3小时至25℃±5℃。过滤或离心去除树脂并用三氟乙酸洗涤树脂两次。收集滤液包装树脂。
沉降
浓缩好的滤液(约每1ml滤液10ml MTBE)倒入冷却好的甲基叔丁醚(MTBE)，(0-8℃)里沉降。冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或离心得虑饼，用冷冻的MTBE彻底洗涤虑饼三次。
粗品干燥
将粗品多肽转移至干燥器，真空下干燥至少12小时。
合成粗品纯度为57.2％，合成得率为64.4％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (9)
1.一种如式I所示的胸腺法新的固相合成制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将Fmoc-Asn(Trt)-OH和羟基官能树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Asn(Trt)-树脂；
(2)将Fmoc-Asn(Trt)-树脂和去保护剂混合，得到Asn(Trt)-树脂；
(3)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Asn(Trt)-树脂缩合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-树脂；
(4)按照固相合成的方法重复步骤(2)和(3)的脱Fmoc和将氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按照Glu至Ser的顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和
(5)使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的胸腺法新；
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酯化反应是将Fmoc-Asn(Trt)-OH、羟基官能树脂和2，6-二氯苯甲酰氯在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中混合进行。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有3％-20％哌啶，0.5％-10％二环脒(DBU)，和01M-0.5M1-羟基苯并***(HOBt)。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有1％-10％哌嗪和0.1M-0.5M1-羟基苯并***(HOBt)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸和树脂的缩合在在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下进行：N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三羟甲基丙烷(TMP)、二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并***(HOBt)。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂中含有N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并***(HOBt)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和三羟甲基丙烷TMP)。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂中含有N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并***(HOBt)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)在各物质配比为92-97三氟乙酸(TFA)∶1.5-4三异丙基硅烷(TIS)∶1.5-4水的切割剂存在下进行。
9.如权利要求1-8人员所述的制备方法，其特征在于，所述的羟基官能树脂选自PEG-王树脂、
200PHB，
400PHB，NovaPEG王树脂。
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