CN103980357A - 一种合成胸腺法新的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固相合成胸腺法新的制备方法。本发明涉及Fmoc策略固相法制备胸腺法新的一种新型工艺。包括以下步骤：（1）由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的RinkAmideMBHA树脂开始合成Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu。（2）将Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联或是片段法偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，其中Glu18、Lys19两个氨基酸的偶联采用片段法一步接肽，其余的氨基酸采用逐一偶联；在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂进行去保护；在偶联Asp2之前对肽树脂进行特殊的酰化试剂进行封端。（3）对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。本发明提供了一种产品纯度高、易于纯化的胸腺法新固相合成方法。

Description

一种合成胸腺法新的方法
技术领域
本发明涉及一种胸腺法新的固相合成方法。 
背景技术
胸腺法新(Thymosin α1，也称胸腺肽α1)是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅导T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝***素的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加r-IFN、a-IFN、IL-2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。 
US4517119采用全液相法合成、纯化胸腺法新。氨基酸氮端采用苄基保护，每次去保护都采用Pd催化加氢进行，操作极其繁杂，未给出总收率。US4504415采用全液相法合成、反相HPLC纯化胸腺法新。以18肽片段（11-28肽段）为起始原料计算总收率为12%。US5856440以MBHA树脂为载体，采用氮端保护为Moz（4-甲氧基苄氧甲酰基）的氨基酸进行胸腺法新固相合成。相比Boc法合成，Moz比Boc更容易脱去。因此Moz法合成多肽过程中，可降低因多次去保护造成肽链从树脂上的流失。从而提高总合成收率。Moz法合成胸腺法新收率35%，比Boc法的25%高。CN101484467采用CTC树脂合成胸腺法新。合成时，在序列11-12处的Ile-Thr采用假脯氨酸二肽形式进行合成。最终合成收率40%。CN102199205采用Wang树脂合成胸腺法新，其采用逐步法合成胸腺法新，其粗肽纯度为69.6%，合成收率为56.6%。若采用PEG衍生后的Wang树脂进行合成，则粗肽纯度为57.2%，合成收率为64.4%。未报道总收率。CN1291031采用生物工程法合成胸腺法新，并与商品胸腺法新进行了活性对比。 
这些现有的合成方法存在的共有技术难点为：（1）液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；（2）现有固相合成法，多通过逐一偶联方式获得胸腺法新肽树脂。由于多个困难点（Leu16、Lys17、Glu18、Lys19等）的存在使粗肽纯度较低，容易包含与胸腺法新保留性质相近的杂质而造成HPLC纯化难度增大，总收率不高。 
发明内容
本发明的目的是提供一种胸腺法新的固相合成方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一条合适的工艺路线，解决以下技术问题：（1）液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；（2）现有固相合成法后期纯化难度大，产品纯度低、收率不高。 
本发明的制备方法如图1所示，首先由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化得到高纯度胸腺法新溶液、再经RP-HPLC转盐、冷冻干燥得到胸腺法新成品。 
本发明中一些常用的缩写具有以下含义； 
Ac2O：醋酸酐
Pyridine：吡啶
Boc：叔丁氧羰基
Fmoc ：9-芴甲氧羰基
tBu ：叔丁基
Fmoc-AA-OH ：9-芴甲氧羰基保护的氨基酸
Cl-HOBt ：6-氯-1-羟基苯并***
DIC ：N，N′- 二异丙基碳化二亚胺
Asp：天冬氨酸
Glu：谷氨酸
Ala：丙氨酸
Val：缬氨酸
Lys：赖氨酸
Leu：亮氨酸
Thr：苏氨酸
Ser：丝氨酸
Ile：异亮氨酸
DMF ：N，N′- 二甲基甲酰胺
Piperidine ：六氢吡啶
TFA ：三氟醋酸
TIS:三异丙基硅烷
MeOH ：甲醇
DCM：二氯甲烷
Kniser test 检测试剂为：茚三酮
HOAc：乙酸
ACN：乙腈
为此，本发明提供一种固环合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下：
步骤1，应用Fmoc/tBu方法，在树脂上以固相合成胸腺法新肽树脂；
步骤2，以二肽片段形式引入Glu18、Lys19两个氨基酸残基；
步骤3，在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂DBU /哌啶/DMF溶液进行2次去保护反应，且去保护反应时间为第一次15min，第二次去保护反应30min；
步骤4，在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂丙酰氯等进行封端操作。
步骤5，对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。 
其中，步骤1所述胸腺法新树脂，结构如下： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(NH-Resin)-OtBu
其中，步骤2所述二肽片段形式通过Fmoc-Glu(OtBu）-Lys(Boc)-OH进行偶联；
其中，步骤3所述混合去保护试剂为如哌啶/DMF溶液、DBU/DMF溶液或DBU /哌啶/DMF溶液等，优选DBU /哌啶/DMF=1/5/20(体积比)。且去保护采用2次进行，第一次反应15min，温度25℃；第二次反应30min，温度25℃；
其中，步骤4所述酰化试剂为丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯，优选丙酰氯。反应条件为酰氯采用10eq投料，20℃下反应15min。
其中，步骤5所述裂解采用裂解剂：TIS和TFA，其配置比例为TIS/TFA=5/95，且裂解剂的体积数为胸腺法新肽树脂质量数的10倍。反应时间为1小时，反应温度为25℃。裂解剂配制方法为：将5体积TIS加入到95体积的TFA中。 
本发明通过筛选得到特定合成方式的组合，即将片段法、加强去保护反应条件、特殊试剂封端等条件联合使用，得到一种高收率且易于纯化的胸腺法新合成方法。 
以下通过实验数据说明本发明的有益效果： 
逐步法与片段法筛选：由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到胸腺法新粗肽。对粗肽进行取样检测。其中在18、19两个位置残基偶联时分别采用了以下两种方式：先偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH，再偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH的逐步法；以及Fmoc- Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH片段法。
使用上述条件制备目的肽，分别得到不同收率和纯度的胸腺法新，结果数据如下： 
脱保护试剂(体积比) 粗肽纯度 合成肽收率
逐步法 42.36% 24%
片段法 51.22% 33%
通用去保护与加强去保护的筛选：
由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到胸腺法新粗肽。对粗肽进行取样检测。但是在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护分别采用通用去保护方法和加强去保护方法。通用去保护法为：采用去保护试剂哌啶/DMF=1/4（体积比）进行2次去保护反应，去保护反应时间为第一次5min，第二次去保护反应10min，反应温度都为25℃。加强去保护法为：采用混合去保护试剂DBU /哌啶/DMF=1/5/20(体积比)进行2次去保护反应，且去保护反应时间为第一次15min，第二次去保护反应30min，反应温度都为25℃。
使用上述条件制备目的肽，分别得到不同收率和纯度的胸腺法新，结果数据如下： 
去保护方式 粗肽纯度 合成肽收率
通用法 42.36% 24%
加强法 57.01% 37%
特殊封端试剂的筛选：由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到胸腺法新粗肽，经RP-HPLC纯化得到高纯度胸腺法新溶液、再经RP-HPLC转盐、冷冻干燥得到胸腺法新成品。在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行两种处理方法。分别为直接进行下一个氨基酸偶联；和采用酰化试剂封端后进行下一个氨基酸偶联。
使用上述条件制备目的肽，分别得到不同收率和纯度的胸腺法新，结果数据如下： 
去保护方式 粗肽纯度 合成收率 精肽纯度 总收率
未封端 42.36% 24% 96.35% 11%
丙酰氯封端 42.10% 24% 98.06% 17%
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下：
一、粗肽纯度、合成收率及总收率比较：
用本发明方法和现有技术的方法进行收率计算，结果如下：
其中的纯度测定方法如下：
HPLC检测方法如下：
色谱柱：Waters X-bridge 5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；流动相B：乙腈；洗脱流速：1ml/min；检测波长：210nm；洗脱梯度：
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 86 14
32 80 20
33 86 14
45 86 14
本发明的有益效果是：通过筛选得到特定合成方式的组合，即将片段法、加强去保护反应条件、特殊试剂封端等条件联合使用，得到一种高收率且易于纯化的胸腺法新合成方法。
附图说明
图1为本发明合成路线图； 
图2为实施例5胸腺法新粗肽HPLC色谱图；
图3为胸腺法新对照品的HPLC色谱图；
图4为实施例5胸腺法新精肽HPLC色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。 
实施例1：采用逐一偶联法合成胸腺法新 
步骤1
Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
称取Rink Amide MBHA 树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67 g，1.0 equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10 mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97 g，4 equiv），Cl-HOBt（0.82 g，4 equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89 mL，4.8 equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。
步骤2 
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4 equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8 equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。依次偶联完所有氨基酸后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。
步骤3 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5 equiv）、吡啶(0.48mL,5 equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.20g。
步骤4 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成
量取TFA（68 mL）、TIS（4.0 mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5 mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.12g。HPLC纯度（面积归一化法）42.36%。经外标法定量计算得粗肽中含胸腺法新0.90g，合成收率：24%。
步骤5 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化
将步骤4所得粗肽通过C18或C8柱3次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第三次纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA ；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。流速80mL/min。冷冻干燥条件为：-27℃ 16h；-5℃ 10h；5℃ 2h； 30℃ 16h。得到目标产物0.41g，HPLC纯度（面积归一化法）96.35%,总收率11%。
实施例2：采用片段偶联法合成胸腺法新 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备
步骤1 
Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
称取Rink Amide MBHA 树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67 g，1.0 equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10 mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97 g，4 equiv），Cl-HOBt（0.82 g，4 equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89 mL，4.8 equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。
步骤2 
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4 equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8 equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。在进行Glu18、Lys19两个氨基酸偶联时，以二肽片段Fmoc-Glu-Lys-OH为原料，一步偶联完成Glu18、Lys19氨基酸偶联，其余氨基酸偶联条件与实施例1相同。依次偶联完所有氨基酸后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。
步骤3 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5 equiv）、吡啶(0.48mL,5 equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.06g。
步骤4 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成
量取TFA（68 mL）、TIS（4.0 mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5 mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.23g。HPLC纯度（面积归一化法）51.22%。经外标法定量计算得粗肽中含胸腺法新1.22g，合成收率：33%。
步骤5 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化
将步骤4 所得粗肽通过C18或C8柱3次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第三次纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA ；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。流速80mL/min。冷冻干燥条件为：-27℃ 16h；-5℃ 10h；5℃ 2h； 30℃ 16h。得到目标产物0.75g，HPLC纯度（面积归一化法）97.34%,总收率20%。
实施例3：采用特殊试剂封端合成胸腺法新 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备
步骤1
Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
称取Rink Amide MBHA 树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67 g，1.0 equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10 mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97 g，4 equiv），Cl-HOBt（0.82 g，4 equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89 mL，4.8 equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。
步骤2 
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4 equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8 equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。但是在偶联完Asp2并用DMF洗涤3遍后，往固相合成管内加入含有丙酰氯（5 equiv）、DIEA（5 equiv）的DMF溶液（15mL），并控制温度15-20℃反应30min后，抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。再继续进行最后一个氨基酸Ser1的偶联，所有氨基酸偶联结束后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。
步骤3 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5 equiv）、吡啶(0.48mL,5 equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.25g。
步骤4 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成
量取TFA（68 mL）、TIS（4.0 mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5 mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.05g。HPLC纯度（面积归一化法）42.10%。经外标法定量计算得粗肽中含胸腺法新1.10g，合成收率：24%。
步骤5 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化
将步骤4 所得粗肽通过C18或C8柱3次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第三次纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA ；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。流速80mL/min。冷冻干燥条件为：-27℃ 16h；-5℃ 10h；5℃ 2h； 30℃ 16h。得到目标产物0.62g，HPLC纯度（面积归一化法）98.06%，总收率17%。
实施例4：采用加强去保护条件合成胸腺法新 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备
步骤1
Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
称取Rink Amide MBHA 树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67 g，1.0 equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10 mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97 g，4 equiv），Cl-HOBt（0.82 g，4 equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89 mL，4.8 equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。
步骤2 
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4 equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8 equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。但是在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18、Lys19等偶联之前的去Fmoc反应中，更换去保护试剂为DBU/哌啶/DMF=1/20/80（体积比）进行，去保护试剂所用体积不变，但去保护反应时间分别为15min和30min。所有氨基酸偶联结束后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。
步骤3 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5 equiv）、吡啶(0.48mL,5 equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.44g。
步骤4 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成
量取TFA（68 mL）、TIS（4.0 mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5 mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.39g。HPLC纯度（面积归一化法）57.01%。经外标法定量计算得粗肽中含胸腺法新1.38g，合成收率：37%。
步骤5 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化
将步骤4 所得粗肽通过C18或C8柱3次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第三次纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA ；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。流速80mL/min。冷冻干燥条件为：-27℃ 16h；-5℃ 10h；5℃ 2h； 30℃ 16h。得到目标产物0.73g，HPLC纯度（面积归一化法）97.89%，总收率20%。
实施例5：联合采用片段偶联法、加强去保护条件和丙酰氯封端等工艺合成胸腺法新。 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备 
步骤1
Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
称取Rink Amide MBHA 树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67 g，1.0 equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0 mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10 mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97 g，4 equiv），Cl-HOBt（0.82 g，4 equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89 mL，4.8 equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。
步骤2 
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4 equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5 mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8 equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。但是在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去Fmoc反应中，更换去保护试剂为DBU/哌啶/DMF=1/20/80（体积比）进行，去保护试剂所用体积不变，去保护反应时间分别为15min和30min。同时在进行Glu18、Lys19两个氨基酸偶联时，以二肽片段Fmoc-Glu-Lys-OH为原料，一步偶联完成Glu18、Lys19氨基酸偶联，其余氨基酸偶联条件与实施例1相同。并且在偶联完Asp2并用DMF洗涤3遍后，往固相合成管内加入含有丙酰氯（5 equiv）、DIEA（5 equiv）的DMF溶液（15mL），并控制温度15-20℃反应30min后，抽滤除去液体。量取DMF（12 mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。再继续进行最后一个氨基酸Ser1的偶联。在所有氨基酸偶联结束后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。
步骤3 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5 equiv）、吡啶(0.48mL,5 equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.83g。
步骤4 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成
量取TFA（68 mL）、TIS（4.0 mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5 mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.71g。HPLC纯度（面积归一化法）78.04%，经外标法定量计算得粗肽中含胸腺法新含量为53.32%，即含目的肽2.51g，目的肽合成收率：67%。
步骤5 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化
将步骤4 所得粗肽通过C18或C8柱3次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。第三次纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA ；B相：乙腈。检测波长220nm。流速80mL/min。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。流速80mL/min。冷冻干燥条件为：-27℃ 16h；-5℃ 10h；5℃ 2h； 30℃ 16h。得胸腺法新精肽2.03g，HPLC纯度（面积归一化法）为99.79%，以干品计胸腺法新含量为99.78%，总收率54%。
HPLC检测方法如下： 
色谱柱：Waters X-bridge 5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；
流动相B：乙腈；
洗脱流速：1ml/min；
检测波长：210nm；
洗脱梯度：
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 86 14
32 80 20
33 86 14
45 86 14
粗肽中目的肽收率计算公式=胸腺法新对照品浓度×胸腺法新对照品含量×胸腺法新粗肽峰面积×粗肽量/（胸腺法新对照品峰面积×胸腺法新粗肽浓度×合成物质的量×胸腺法新分子量）×100%=8.98×86.31%×922.469×4710/（854.044×15.78×1.2×3108）×100%=67%
注：胸腺法新对照品和胸腺法新粗肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。
胸腺法新对照品浓度：8.98 mg/ml 
胸腺法新对照品峰面积：854.044 mAU*min （图3）
胸腺法新对照品含量：86.31%
胸腺法新粗肽配制浓度：15.78 mg/ml  
胸腺法新粗肽主峰面积：922.469 mAU*min（图2）
胸腺法新精肽收率计算公式=胸腺法新对照品浓度×胸腺法新对照品含量×胸腺法新精肽峰面积×精肽量/（胸腺法新对照品峰面积×胸腺法新精肽浓度×合成物质的量×胸腺法新分子量）×100%=8.98×86.31%×1176.377×2030/（854.044×10.76×1.2×3108）×100%=54%
注：胸腺法新对照品和胸腺法新精肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。
胸腺法新对照品浓度：8.98 mg/ml 
胸腺法新对照品峰面积：854.044 mAU*min （图3）
胸腺法新对照品含量：86.31%
胸腺法新精肽配制浓度：10.76 mg/ml  
胸腺法新精肽峰面积：1176.377 mAU*min（图4）。

Claims (5)

1.一种合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下：
步骤1，由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu；
步骤2，根据胸腺法新肽序碳端到氮端的次序，在树脂Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu上采用逐一偶联方式或是片段法进行所有氨基酸的连接，得到胸腺法新肽树脂；
步骤3，对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征是：
其中，步骤1所述的合成，其特征是：
Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu是由Fmoc-Asp-OtBu与替代度0.40-0.50mmol/g的Rink Amide MBHA 树脂在DIC/Cl-HOBt作用下生成的
其中，步骤2所述胸腺法新肽树脂，结构如下：
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu
其中步骤2所述的偶联方式，其特征是：
在Glu18、Lys19两个氨基酸的偶联时，采用片段法一步偶联完成
其中步骤2所述的偶联方式，其特征是：
在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂如哌啶/DMF溶液、DBU/DMF溶液或DBU /哌啶/DMF溶液进行2次去保护反应，且去保护反应时间为第一次15min，第二次去保护反应30min；
其中步骤2所述的偶联方式，其特征是：
在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂如丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯等进行封端操作；
其中步骤2所述的偶联方式，其特征是：
偶联完所有氨基酸得到胸腺法新28肽树脂，采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化
其中，步骤3所述裂解方式，其特征是：
使用的裂解剂选自：三异丙基硅烷和三氟乙酸，其配置比例为三异丙基硅烷∶三氟乙酸=5∶95（体积比），反应时间为1小时，反应温度为25℃；
其中，步骤3所述RP-HPLC纯化、转盐操作，其特征是：
RP-HPLC纯化、转盐采用反相C18填料制备色谱柱，TFA/乙腈、HOAc/乙腈体系做为流动相进行。
3.根据权利要求1 所述的方法，其特征是：在Glu18、Lys19两个氨基酸的偶联时，采用二肽片段法一步偶联完成，可选用的二肽为：Fmoc-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-OH。
4.根据权利要求1 所述的方法，其特征是：在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂进行封端，其中酰化试剂为非乙酰化的其它酰化试剂，如：丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯等。
5.根据权利要求1 所述的方法，其特征是：将片段法、加强去保护反应条件、特殊试剂封端等条件联合使用后，显著提高了纯度和收率。
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