CN102964464A - 一种具有调节血糖活性乌饭树多糖的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有调节血糖活性乌饭树多糖的提取纯化方法，属于功能性植物多糖精深加工技术领域。本发明工艺步骤是：以乌饭树树叶为原料，经过粉碎、水提、醇沉，再经过大孔树脂和凝胶色谱分离纯化，最后用胰岛β-细胞膜色谱柱验证活性，得到具有调节血糖活性的乌饭树多糖。本发明工艺设计科学合理，能有效的分离纯化具有调节血糖活性的多糖，提高了乌饭树资源的开发利用，为植物多糖的开发提供了依据。
Description
技术领域：一种具有调节血糖活性乌饭树多糖的提取纯化方法，属于功能性植物多糖提取技术领域。
背景技术：乌饭树是一种药食兼用的传统植物资源，在我国分布广泛。乌饭树树叶中含有如多糖、花色苷、黄酮、酚类、单宁等多种有效成分，具有改善血液微循环、抗溃疡、抗炎症、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等多种药理活性。
植物多糖是一类重要的大分子天然产物，具有多种生理功能，如抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、降血压、抗凝血、降血糖和降血脂等，尤其是对糖尿病的预防和治疗方面具有重要的作用。国内外对于多糖降血糖方面的研究从未间断，越来越多的活性多糖的降血糖功能被发掘。
糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，已经成为继心血管和肿瘤之后的第三位“健康杀手”。杨文英教授等2010年3月25日发表于《新英格兰医学杂志》——《中国人的糖尿病患病率》一文指出：在中国，9240万20岁以上的成年人(9.7％的成年人口)患有糖尿病，并且糖尿病患病率正快速升高，呈现发病年轻化的趋势。
以乌饭树树叶为原料，经过粉碎、热水水提、乙醇沉淀、大孔树脂、凝胶色谱分离纯化，最后用胰岛β-细胞膜色谱柱进行功能验证，得到具有调节血糖活性的乌饭树多糖。这将使乌饭树这一传统植物资源及我国丰富的功能性植物资源得到更大的开发利用。
发明内容：本发明的目的是提供一种具有调节血糖活性乌饭树多糖的提取纯化方法，该方法工艺设计科学合理，能有效的分离纯化具有调节血糖活性的多糖，提高了乌饭树资源的开发利用，为植物多糖的开发提供了依据。
本发明的技术方案：以乌饭树树叶为原料，经过粉碎、热水水提、乙醇沉淀，再经过大孔树脂和凝胶色谱分离纯化，最后用胰岛β-细胞膜色谱柱验证活性，得到具有调节血糖活性的乌饭树多糖。
(1)原料粉碎：乌饭树树叶干燥，粉碎，过60-80目筛网，得到树叶粉末；
(2)热水提取：乌饭树树叶粉末加水，料液比控制在1∶40-1∶50，pH调节至9.0-9.5，温度调节至60-65℃，浸提时间为2-3h，4000r/min离心15min，取上清液，旋转蒸发浓缩得到浓缩液A；
(3)乙醇沉淀：浓缩液A与适量乙醇混合，调节至混合液中乙醇纯度为75-85％，沉淀时间为6-7h，4000r/min离心15min，取沉淀，加水复溶，得到浓缩液B；
(4)大孔树脂纯化：浓缩液B上大孔吸附树脂，先用2-3倍柱体积的去离子水洗脱，弃去洗脱液，再用3-5倍柱体积的体积浓度为95％的酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩至酒精含量不超过5％，得到浓缩液C；
(5)凝胶色谱纯化：浓缩液上凝胶柱，收集分子量在80-100KDa范围内的洗脱液，浓缩得到浓缩液D；
(6)胰岛β-细胞膜色谱柱验证活性：以处理好的载体细胞膜作为胰岛β-细胞膜色谱柱的固定相，流速为0.2mL/min，柱温为37℃，流动相为硫酸铵缓冲液。
本发明的有益效果：本发明工艺设计科学合理，操作简便，能有效的分离纯化具有调节血糖活性的多糖，提高了乌饭树资源的开发利用。
具体实施方式
实施例1
取经过干燥粉碎、过60目筛的50g乌饭树树叶粉末，加入2.0L水，调节pH至9.0，60℃下恒温搅拌3h，提取液4000r/min离心15min，取上清液，旋转蒸发浓缩，得到浓缩液A；向浓缩液A中加入浓度为80％的乙醇调节最终乙醇浓度为75％，静置沉淀7h，沉淀后4000r/min离心15min，将沉淀加水复溶得到浓缩液B；浓缩液B上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积的去离子水洗脱，弃去洗脱液，再用3倍柱体积的浓度为95％的酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩至酒精含量不超过5％，得到浓缩液C；浓缩液C过ShodexOHPak SB-g03HQ型色谱柱，收集分子量在80-100KDa范围内的洗脱液，浓缩后得到浓缩液D；以处理好的载体细胞膜作为胰岛β-细胞膜色谱柱的固定相，用低压湿法装入色谱柱中，流速为0.2mL/min，柱温为37℃，用硫酸铵缓冲液为流动相平衡3h后，加入浓缩液D验证其具有调节血糖活性。
实施例2
取经过干燥粉碎、过80目筛的50g乌饭树树叶粉末，加入2.5L水，调节pH至9.5，65℃下恒温搅拌2h，水提后4000r/min离心15min，得到上清液，旋转蒸发浓缩，得到浓缩液A；向浓缩液A中加入加入浓度为95％的乙醇调节最终乙醇浓度为85％，静置沉淀6h，沉淀后4000r/min离心15min，将沉淀加水复溶得到浓缩液B；浓缩液B上D3520型大孔吸附树脂，先用3倍柱体积的去离子水洗脱，弃去洗脱液，再用5倍柱体积的体积浓度为95％的酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩至酒精含量不超过5％，得到浓缩液C；浓缩液C过ShodexOHPakSB-803HQ型色谱柱，收集分子量在80-100KDa范围内的洗脱液，浓缩得到浓缩液D；以处理好的载体细胞膜作为胰岛β-细胞膜色谱柱的固定相，用低压湿法装入色谱柱中，流速为0.2mL/min，柱温为37℃，用硫酸铵缓冲液为流动相平衡3h后，加入浓缩液D验证其具有调节血糖活性。
Claims (2)
1.一种具有调节血糖活性乌饭树多糖的提取纯化方法，其特征是以乌饭树树叶为原料，经过粉碎、热水水提、乙醇沉淀，再经过大孔树脂和凝胶色谱分离纯化，最后用胰岛β-细胞膜色谱柱验证活性，得到具有调节血糖活性的乌饭树多糖；
具体工艺如下：
(1)原料粉碎：乌饭树树叶干燥，粉碎，过60-80目筛网，得到树叶粉末；
(2)热水提取：乌饭树树叶粉末加水，料液比控制在1∶40-1∶50，pH调节至9.0-9.5，温度调节至60-65℃，浸提时间为2-3h，4000r/min离心15min，取上清液，旋转蒸发浓缩得到浓缩液A；
(3)乙醇沉淀：浓缩液A与适量乙醇混合，调节至混合液中乙醇纯度为75-85％，沉淀时间为6-7h，4000r/min离心15min，取沉淀，加水复溶，得到浓缩液B；
(4)大孔树脂纯化：浓缩液B上大孔吸附树脂，先用2-3倍柱体积的去离子水洗脱，弃去洗脱液，再用3-5倍柱体积的体积浓度为95％的酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩至酒精含量不超过5％，得到浓缩液C；
(5)凝胶色谱纯化：浓缩液上凝胶柱，收集分子量在80-100KDa范围内的洗脱液，浓缩得到浓缩液D；
(6)胰岛β-细胞膜色谱柱验证活性：以处理好的载体细胞膜作为胰岛β-细胞膜色谱柱的固定相，流速为0.2mL/min，柱温为37℃，流动相为硫酸铵缓冲液。
2.根据权利要求1所述的具有降血糖作用的乌饭树多糖的提取方法，其特征是：(1)大孔树脂是AB-8、D3520、D4020中的一种；(2)凝胶为Shodex OHPak SB-803HQ；(3)载体细胞膜的制备：在低温反应管中加入硅胶作为细胞膜的载体，加入细胞膜悬浮液适量，反应2h后，加入生理盐水，控制温度为25℃，使凝脂双层进行自身相互作用，最终在硅胶表面形成均匀的细胞膜，用Tris-HCl缓冲液洗涤。
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