CN113604485B

CN113604485B - 拟南芥AtGSNOR基因、蛋白及应用

Info

Publication number: CN113604485B
Application number: CN202110798577.1A
Authority: CN
Inventors: 许盛宝; 王君哲; 郭效龙; 王晓明; 路田
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113604485A

Abstract

本发明公开了一种拟南芥AtGSNOR基因、蛋白及应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将该基因导入目的植物，得到转基因植物，发现通过特异提高AtGSNOR基因在植物雌配子体周围细胞中的表达量，可以提高植物雌配子体在高温胁迫下的发育速度，使植物的开花期耐热性与高温胁迫下的育性得到提高。这说明AtGSNOR基因可用于调节植物耐热性，并且本发明对于植物育种具有重大的应用价值。

Description

拟南芥AtGSNOR基因、蛋白及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及拟南芥AtGSNOR基因、蛋白及应用。

背景技术

植物生长发育的各个阶段都有其特定的温度要求，温度过高会对其造成热胁迫，影响植物的生长发育。其中植物开花期对高温最敏感，高温会造成植物的雌配子体发育迟缓，导致植物育性降低，这是高温导致作物减产的重要原因。当前，随着全球变暖逐渐加剧，有效的提高植物开花期耐热性，是保障未来作物高产稳产的必要准备。

在植物中，一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种内源产生的信号分子，受到一系列环境胁迫的显著诱导，并参与植物的育性调控。高温胁迫下，植物体内产生NO的爆发，而NO在胚珠中的累积是导致雌配子体发育迟缓进而造成育性降低的重要原因。亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR)是植物体内代谢NO的主要蛋白，hot5-2是一种以野生型拟南芥Col-0为背景的T-DNA***得到的AtGSNOR缺失突变体，其中NO大量积累，相较于野生型而言hot5-2表现为叶色变黄、扭曲，多分枝、植株变矮、不育率高，主根变短、侧根明显减少。AtGSNOR的缺失会影响植物代谢胁迫引起的NO积累，但是目前关于该酶的应用较少，还没有关于其在抵抗热胁迫与提高植物育性相关的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种拟南芥AtGSNOR基因。

本发明的第二个目的是提供一种上述基因编码的蛋白。

本发明的第三个目的是提供含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明的最主要的一个目的在于提供该AtGSNOR基因或蛋白的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

一种AtGSNOR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的核苷酸序列由2339个碱基组成，或在严格条件下与SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的DNA分子。

上述基因编码的蛋白质(1)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述的序列由379个氨基酸残基组成。

上述AtGSNOR基因编码的蛋白还可以包括将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个((如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个))氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或与(1)限定的蛋白序列有80％((较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高))以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白。

也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述AtGSNOR基因，还包括与SEQID NO.1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

含有上述基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞及其构建方法也落入本发明的保护范围之内。

所述重组表达载体具体可为在载体pC1300s的多克隆位点***AtGSNOR基因得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将载体pC1300s的Hind和attB2两个酶切位点之间的小片段取代为AtGSNOR基因得到的重组质粒。

本发明最重要的一个发明点在于公开了AtGSNOR基因的功能，也就是AtGSNOR基因或蛋白能够提高植物开花期耐热性，具体包括高温胁迫下改善雌配子体发育且提高结实率。

本发明还公开了一种培育转基因植物的方法，将AtGSNOR基因特异的导入目的植物胚珠细胞中，得到转基因植物，所述转基因植物满足如下(1)～(2)中的至少一种表型：

(1)在高温胁迫下的雌配子体发育迟缓现象较目的植物相比得到改善；

(2)在高温胁迫下的结实率优于目的植物；

具体地，AtGSNOR基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

具体地，为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：

将AtGSNOR基因与胚珠中特异表达基因SPL的启动子连接导入目的植物，通过促进胚珠中特异表达基因SPL启动子启动AtGSNOR基因在胚珠中特异表达，进而提高AtGSNOR在雌配子体周围细胞中的表达量，获得具有如下性状的植物：

(1)耐热性强于所述目的植物，具体表现为在高温胁迫下的雌配子体发育迟缓现象较目的植物相比得到改善；

(2)在高温胁迫下的结实率优于目的植物；

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种实施方式，所述的“植物”包括但不限于：拟南芥，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。尤其适用于需要提高开花期耐热性的植物，在实际的应用过程中，对于需要提高开花期耐热性的植物，均可以通过转基因的方式培育转入该基因的株系。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

本发明的AtGSNOR从拟南芥中发现，利用在胚珠中特异表达的启动子提高GSNOR基因在野生型胚珠中的表达量，从而提高雌配子体在高温胁迫下的发育速度，提高了植物在高温胁迫下的结实率，具有更高的开花期耐热性，为高温胁迫下减少田间作物的产量损失提供参考。

本方法与传统避热方法(改变植物生育期)相比，实现了基因的特异表达，减少了工作量，并且消除了对产量和品质的不利影响。本发明方法将为提高植物开花期耐热性提供另一途径，通过AtGSNOR基因的特异表达，实现了在不影响植物自身生长发育的同时开花期耐热性的提高，这为植物在高温胁迫下繁衍奠定了基础，也为改善高温胁迫下的作物产量提供了新的思路。

附图说明

图1A是AtGSNOR入门载体克隆图谱；

图1B是特异启动子pSPL入门载体克隆图谱；

图2是表达载体图谱；

图3是转基因拟南芥AtGSNOR基因及pSPL特异启动子PCR检测图；

图4是Col、热处理Col与热处理后转基因株系表型统计结果；

图中，A：14期花的雌蕊中，不同处理胚珠的发育阶段；B：不同处理结实率统计结果。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、***发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：

“组织特异性基因”是一类可以在细胞中进行特异性表达的基因，其产物可以赋予各种类型细胞特异的形态结构特征与特异的生理功能。这些基因在植物中通常可以大量表达，并且可以编码具有特殊功能的基因。

“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列区段表达的调控元件，调控序列是组织特异性启动子。组织特异性启动子其在植物发育期间的特定时间仅在特定细胞或组织中有活性，避免了基因的过量表达。“农杆菌介导转化法”，Agrobacterium-mediatedtransformation，指将目的基因***到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。

目的植物：target plant，本发明所述目的植物是拟南芥。

目的基因：target gene，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

实施例

一、目的片段扩增

利用转录组和代谢组等多种技术手段筛选得到一个AtGSNOR基因，该基因全长编码框核苷酸序列长度为2339bp，由379个氨基酸组成，经过测序得到其核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

利用多种技术手段筛选得到一个在胚珠中特异表达的基因SPL，克隆该基因启动子，该启动子序列如SEQ ID No.3所示，核苷酸序列长度为3901bp。具体如下：

1.总RNA的提取：

(1)匀浆处理。将拟南芥样品在液氮中快速研磨至粉末状，加入450μL裂解液(提前将β-巯基乙醇加入裂解液中)，用涡旋仪剧烈震荡1min，使样品呈现匀浆状。

(2)将溶液转移至过滤柱CS上，12000r离心5min，吸取收集管中的上清液RNase-Free离心管中。

(3)加入0.5倍上清液体积的无水乙醇，混匀后将所有液体转入吸附柱CR3，12000r离心1min。倒掉废液，将CR3放回收集管中。

(4)加入350μL去蛋白液RW1到CR3中，12000r离心1min。倒掉废液，将CR3放回收集管中。

(5)配制Dnase 1工作液。吸取10μL Dnase 1储存液于RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。

(6)加入80μL Dnase 1工作液到CR3中后室温放置15min。

(7)加入350μL去蛋白液RW1到CR3中，12000r离心1min。倒掉废液，将CR3放回收集管中。

(8)加入500μL漂洗液RW1(使用前加入无水乙醇)到CR3中，12000r离心1min。倒掉废液，将CR3放回收集管中。重复一次

(9)12000r离心2min，倒掉废液。将CR3放置在室温10min以晾干其膜上残留乙醇。

(10)将CR3放置到新的RNase-Free离心管中，悬空向膜滴加50μL RNase-Free水，室温放置2min，12000r离心2min。重复一次，收集管中即为RNA溶液。

2、GSNOR基因及特异启动子的克隆及序列分析

(1)将拟南芥野生型RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用。

(2)设计全长cDNA扩增引物与SPL启动子序列扩增引物：

设计引物GSNOR-HSacF与GSNOR-BamHR利用PCR扩增目的片段GSNOR；设计引物pSPL-F与pSPL-R利用PCR扩增目的片段pSPL，引物序列如表1所示。

表1 cDNA扩增引物与SPL启动子序列扩增引物

PCR反应体系与反应程序如下：

目的片段扩增PCR体系

程序

二.表达载体的构建

(1)入门载体的构建。

将AtGSNOR基因与入门载体18-T连接，克隆载体图谱如图1A所示，将SPL基因的启动子与入门载体19-T连接，克隆载体图谱如图1B所示，得到入门克隆后验证。

(2)表达载体的构建。

表达载体pC1300s用HindIII与BamHI双酶切处理并回收载体片段，与AtGSNOR扩增产物进行重组，加入1μL重组反应产物转化至大肠杆菌DH5α中，LB抗性平板上生长过夜。挑选克隆子摇菌，提取阳性质粒用BamHI与HindIII双酶切验证阳性克隆，其表达载体图谱如图2所示，然后进行测序验证。

AtGSNOR用SacI酶切处理并去磷酸化，pSPL扩增产物用SacI酶切处理并纯化，两者进行T4连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂抗性平板。挑选克隆子摇菌，提取阳性质粒，使用引物pSPL-SF与GSNOR-SR进行菌落PCR验证阳性克隆，引物序列表2，然后进行测序验证。

表2 pSPL-SF与GSNOR-SR引物

菌落PCR反应体系与反应程序如下：

菌落PCR体系

程序

三、转化农杆菌

电击转化农杆菌G3101。在农杆菌中加入2μL质粒，轻轻混匀，加入1mL空白培养基。在28℃、180r条件下摇菌3h。涂抗性平板，挑取单克隆农杆菌菌落，利用菌落PCR验证阳性克隆，菌落PCR反应体系与反应程序同上，挑选出具有抗性的阳性性的阳性菌株，摇菌培养后与甘油混合置于-80℃保存。

将目的载体转化到野生型拟南芥Col-0中得到GSNOR特异表达的材料pSPL-1、pSPL-2和pSPL-3。

四、AtGSNOR基因的功能鉴定

(1)拟南芥种子消毒：

若干种子(一批一百粒左右，挑选干净完整的种子)放置于1.5ml离心管(灭过菌)；

倒入1000μL 75％的乙醇摇晃1分钟倒去废液；

倒入1000μL 0.1％的次氯酸钠，摇晃7min倒去废液；

倒入1000μL无菌水洗1分钟倒去废液，重复3-5次；

倒入1000μL无菌水放4℃冰箱中春化三天。

(2)种子萌发：

a.拌土。将有机质与蛭石混匀加入适量水，装入灭过菌的干净POT中；

b.用枪头将种子点在POT中，POT放在干净托盘上；

c.贴标签，盖盖子，放入培养箱中，22℃/19℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。

(3)农杆菌扩大培养。

取出农杆菌菌种20μL，加入到50mL含kana、gen和Rif的LB液体培养基中，28℃、200r摇菌，OD值达0.8，停止培养；菌液倒入50mL离心管中，室温、5000r离心10min，保留沉淀，重悬菌体。

(4)侵染。

拟南芥培养至花苞最多时期，花序浸入农杆菌菌液中30s。一周后，重复侵染一次。

(5)继续培养。

侵染后的拟南芥植株用塑料袋包裹后，黑暗环境培养过夜。取下塑料袋，将拟南芥放入培养箱正常培养。

(6)筛选阳性株系

利用CTAB法提取T0代DNA。根据PCR检测AtGSNOR基因是否成功转入拟南芥中，PCR体系及反应程序同上。

对转基因拟南芥不同株系中进行PCR检测，均可检测到目的基因AtGSNOR，表明外源基因在转基因拟南芥后代中能够稳定遗传(图3)。通过植株PCR检测表明，目的基因在转基因拟南芥中以有性生殖方式传递给后代，纯合后，可以获得目的基因能够稳定遗传给后代的纯合体。

(7)耐热实验

将野生型和AtGSNOR特异表达材料pSPL-1、pSPL-2、pSPL-3在22℃/19℃，16h光照/8h黑暗条件下培养直至抽薹开花，开花后一周实验组进行高温处理，标记处于12期的花苞，在35℃光照下处理6h，第二天上午对处于14期的花人工授粉，一部分取样进行雌配子发育观察，另一部分一周后统计结实率。对照组正常处理，14期进行人工授粉，一部分取样进行雌配子发育观察，另一部分一周后统计结实率。

(8)结果分析

利用共聚焦显微镜对雌配子体观察发现，在十四期花的雌蕊中，Col中94％以上的胚珠生长至雌配子体发育晚期，经过热处理后的Col仅有64％以上的胚珠处于雌配子体晚期，而三种转基因材料pSPL-1、pSPL-2和pSPL-3中分别有78％、77％、76％的胚珠生长至雌配子体晚期，相较于热处理Col同一时期花的雌蕊中雌配子体发育延迟现象得到恢复(图4A)。因此，AtGSNOR的特异表达可以提高热胁迫造成的雌配子体发育迟缓，从而提高植物开花期耐热性。

统计热处理后野生型Col、AtGSNOR特异表达材料的结实率发现，热处理后Col的结实率显著降低，相较于热处理Col转基因株系pSPL-1、pSPL-2和pSPL-3中，结实率显著上升，植株育性得到了恢复(图4B)。结果表明，AtGSNOR在雌配子体周围组织中的特异表达可以恢复雌配子体的发育迟缓，改善植物育性，从而提高植物开花期耐热性。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 拟南芥AtGSNOR基因、蛋白及应用

<130> 2021

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2339

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

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<211> 379

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

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<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

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ctccttgttc catatctaac tttatacttg taagtttgat caagaataat gttaattgtt 420

actatactaa ctaaacttaa aattaaacaa tattgagcac attttcatat cttgtttatt 480

ggttttggtg agattgagaa ttgaagaatc tagagacaaa ggcaaagctg tagtatagtt 540

gttgaatagg gggtctacaa ctgtactgag tgaggggagg gagagaatct cagttggaga 600

ttgagagatc taaagtaatg ataatagaaa atcttggaaa attaaattct tagaaaagaa 660

gaaagaaaaa ataagatgag agagggaaag agagaggtgg tccaaaagga ggtttaagga 720

agggtttgca agtttgtatg aaaatagata gataaggaag atgatgtata aagccaaaac 780

taacagttac tatcttttct tctttttctt atattttcat tttctcagaa ttctttttta 840

cacttcccaa aaactcactc atttattcac ctactctgcc tccttttgtc ctctatatag 900

tctcttgtct acatttattt tacttcacag tgtgcatata ctatcaattt gtattagaga 960

gatctcaaag agaaatcaaa atggagtgat aggttgtatt atgaggattc gcagagcttt 1020

taaaatggca gccaacaaca ttctatgaac taagttaaac agtgttatga aacataaata 1080

atttcatttg caataaccaa agagaataat atttatttat tttctttggc tctatcatct 1140

aataggagga gaagtaaaaa aaacagaaga gaaagatcca atcattctag aaaggaacac 1200

aatatgcttc acggatccca agaatctttc tatgcctgcc taaacccagc aatataaatc 1260

aaaccttcac acgcttcggt tcttctttac acgtgccgga aaaaaaaccc tagtagtagc 1320

cgcccaatga ccatctaaag tggtccccgt gatgacacgt gtcagttgga ccactatccg 1380

taacttaaca tgaaagcaca tgtggggtcc cctctttcgt cctttgccct accagttcct 1440

tgtcctagcc cacaatacaa tctacgcggt atctatatca aagtttatct agctattttc 1500

cgaaatagaa agcatatact tccatttatt tttgaacaaa ttaaacttgg tagaaataaa 1560

atctttcgat attgatttat ttcgatttag tgtaattcta ttatcatctc gcgtgtcatt 1620

ctaggcttat agcaacagtg taggtatgtt gcaatgttgg gttggtcatg ccgtttggat 1680

ttatttccag tgattaattc agattttatt tttcttctta attatctacg tataacaaaa 1740

tctcgctaac cgcagagtga atttgcatgt cactcatgaa tgttttgagt ataagaagtg 1800

agtaatttgt tttataaata tatgaactta tgaagataca tattgaagtt gttttgtttg 1860

ggggtaaaaa aggttatttg agtgttatat gataacttta ctcagaaaac gtacttagca 1920

aaggtaattc gaagtacctt tggaatcgag taaatactga taactagaaa aaataagata 1980

cataatggag aaataattaa atatatttgt atttcttttt tgtttaacaa cgtacgtttt 2040

attattagct agtatacatt tacaacggtt acgtagatca tataatagcc atttaagatg 2100

tacaacatct catctggtta cttcatttat ataaaaaaaa aacgaaatct caacacatag 2160

taatgtataa ttacttcagt ggggcttctc ttaagacttg tattgagaat atccatataa 2220

aacaaacttt gtattaagat aattaaaatt ttctaatagt aggtattggg ctgaagccaa 2280

gattaacatg gaggcagctt taaaatgttt ccttatatga tgcagccatc atttctactc 2340

tactccgtag ctccaaaccc ttctcgtaat tcacgtctct catgctattc tttttgcttt 2400

cgtcctcctc tcatgtgaag caataactat ctctcgattt tttttttcaa ataccgaaag 2460

ctaacttttt caaataaatg tcaaatatat taattttcgt tttgtattta gtattttatt 2520

tgtcagctaa gtatagtgag tttttaagct tactcgtcgt atttatcata tattcatata 2580

catatcacat tagtcaaagt aaataaaaat ttgtttttga agaaaaaaaa aatacatata 2640

actgcgagtc tgcgactgta actggacttg cttattttag ttgatatgag ctgagtaaaa 2700

tcacgttgtc ccagaccttg ctcgctacaa tcggcgaatg gtctaacgtc ccgacacctg 2760

tcctcgatcc gcgggtacta tattctttgc aatgtgatgc acgcgctgtt actattggac 2820

agtgtttctc acctcacgac tgagcctatg cgagtagcga caatctccga tttgctgtct 2880

ccatggtagg gattatcaca atctctgatt ttttttatca ggaacaagta aataaatagc 2940

tttgagtttt tgtttttttt ctacattctt cgcccaaaag atgtaagaaa ataaaggatt 3000

tgaaaccttg ttctgttgtt actcctttaa attcttaaaa actataaatc attatatctt 3060

tgatctgttt cacaaactaa tcatattcgt tgcaaagtga gaattcgtcc cactttactc 3120

tttacaccga tactagtatt atagatgtac agcatagtat tccatatcta gttatttagt 3180

caaaactcta tatattaaga ggtaggttaa ttaattaagg agtaattgaa gattatagaa 3240

agaataaaaa ataccattta atggacagaa ccaaagataa ctaactatca tactataatg 3300

ttgaatttct tccacgatcc aatgcatgga taacaacatc aatcaaatca tacattcatg 3360

ctatataaca tagttttcag ttacaaactc tcttttttat ttatttcagt tgttcctttt 3420

catgaccata ttaacatcaa ataatgcatt tttttcaacg tctcttgact tacacccact 3480

aatattgaca aattgaacat ctatacgact atacacacat aagttaaaaa tgcatgcaag 3540

tgctaaggga atttataaca tctaaggtta ataagactaa gaaagtataa aataagaata 3600

cgtattatga atttatgata tactttacta atctttttga aaaatacttt aatttaatct 3660

actatagggg gtaaaaagta aaaaagaaat aaagatacgt ttatccgcat atagtacctg 3720

gaaataacag aaaataaaaa cacaggtaag tactttgcct gagctagtat atgaacacta 3780

aagagataca cacacacaaa aagagagcag aaacaaaaca cacacactta aagctttcgt 3840

ctttacctct tcccttctct ctctctatct aaaaagagtt ccgagaagaa gatcatcatc 3900

a 3901

Claims

1.拟南芥AtGSNOR基因或AtGSNOR基因编码的蛋白在提高拟南芥开花期耐热性中的应用，其特征在于，所述AtGSNOR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示，所述耐热性为在高温胁迫下改善雌配子体发育且提高结实率；所述应用为在胚珠中过表达拟南芥AtGSNOR基因。

2.一种植物育种方法，其特征在于，将权利要求1中所述AtGSNOR基因与胚珠中特异表达基因SPL的启动子连接导入目的植物，利用植物胚珠特异表达的SPL基因的启动子启动AtGSNOR在雌配子体周围组织中的特异表达，从而提高AtGSNOR在雌配子体周围细胞中的表达量，获得具有如下性状的植物：耐热性强于所述目的植物，具体表现为在高温胁迫下的雌配子体发育迟缓现象较目的植物相比得到改善和/或在高温胁迫下的结实率优于目的植物。

3.根据权利要求2所述的植物育种方法，其特征在于，所述特异表达基因SPL的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。