CN101250532B - 蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 - Google Patents
蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101250532B CN101250532B CN2007100471832A CN200710047183A CN101250532B CN 101250532 B CN101250532 B CN 101250532B CN 2007100471832 A CN2007100471832 A CN 2007100471832A CN 200710047183 A CN200710047183 A CN 200710047183A CN 101250532 B CN101250532 B CN 101250532B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- phagcu
- butterfly orchid
- sequence
- orchid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域,具体为一种在蝴蝶兰中表达的AGAMOUS-like基因家族的PhAGCu基因的核苷酸编码序列及其在改变花发育,成花转变和形态构建方面的应用。本发明涉及的蝴蝶兰PhAGCu基因具有特定序列的DNA分子,全长950bp,包括一个717bp开放读框,其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明还包含上述基因的重组表达载体,转基因植株,获得此基因的核苷酸引物系列,用于检测内源表达模式的寡核苷酸探针序列,以及对蝴蝶兰此内源基因的表达模式进行分析鉴定的方法。将本发明所说基因转入烟草,所获得的转基因植株的花的形状及结的种子都发生明显变化,表明该基因可影响植株有性器官的发育。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域,具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的PhAGCu基因的核苷酸编码序列,包含上述基因的重组表达载体,转基因植株,以及对蝴蝶兰此基因的表达模式进行分析鉴定的所使用的方法。
背景技术
兰科属于世界性四个特大科之一,起源古老,进化速率极其不同步,是种子植物***发育在单子叶植物中的一个高峰,具有典型性和代表性(吴征镒,2003)。
兰花结构高度特化,其花被的高度变异(如似花瓣的萼片和唇瓣)及合蕊柱的出现为研究ABC功能基因提供了新的平台和视角,并可能会拓展经典ABC功能基因概念的外延。
1990年以来,越来越多不同种属植物中的A、B、C类基因相继被克隆。这些花器官特性基因中的绝大多数属于一个古老的基因家族,MADS-box家族。MADS-box基因家族得名于最先鉴定出来的四个成员的首字母:酵母的MCM1基因、拟南芥的AGAMOUS基因、金鱼草的DEFICIENS基因和人的SRF基因。这一基因家族编码包括动、植物、真菌在内的几乎所有真核生物中的转录因子,在生物体的发育控制以及信号转导过程中均发挥作用。其在植物发育中的重要作用尤为引人注目,参与了植物根、叶、花和果实的发育,以及营养生长向生殖生长转变过程的调节。
其中首先在拟南芥中分离得到的AGAMOUS基因,其功能不仅限于轮III、轮IV的原基发育,还具有和A类基因相互拮抗,并使花芽发育具有确定性的作用。虽然单子叶植物中分离得到的第一个MADS基因来自兰花(Lu et al.,1993),但十几年来大部分的研究都集中在水稻、玉米上,有关兰科花发育的分子研究仍比较初步,主要集中在蝴蝶兰和石斛兰上。目前,有关蝴蝶兰的A、B、C和D族基因均有报道,而尤以B族基因的研究最为详细。
本研究通过分离蝴蝶兰C类基因,即AGAMOUS-like基因家族的PhAGCu基因,对其时空表达模式进行了确定,同时还进行了部分转基因的工作,希望为确立兰科植物花发育的遗传机制提供一定的依据,并对经典的ABC模型作出进一步的补充。另一方面,通过转基因技术,为蝴蝶兰的分子育种提供一定的思路,为蝴蝶兰的观赏园艺方面作出有益的贡献,从而又具有一定的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提出一种从蝴蝶兰中克隆出的PhAGCu基因,其编码序列和应用。
本发明的一方面提供一种新的蝴蝶兰基因,记为PhAGCu,已注册于GenBank/EMBL/DDBJ,登陆号为:DQ534013。为具有特定序列的DNA分子,全长950bp,包括一个717bp的开放读框(ORF),其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供上述基因编码翻译出的蛋白质分子,有239个氨基酸残基,其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了用于调取获得蝴蝶兰样品中PhAGCu基因的一对核苷酸引物PAGF和B25。该引物根据PhAGCu基因保守区域设计。使用此对引物对蝴蝶兰样品cDNA进行PCR扩增可获得长950bp的基因片段。具体的引物序列信息参见SEQ ID NO.3。
本发明还提供了一种用于检测样品中蝴蝶兰PhAGCu基因拷贝数的方法,其使用前述核苷酸序列SEQ ID NO.1,其中的特异区段3’UTR约250bp作为探针,对蝴蝶兰基因组DNA样品进行Southern杂交,然后检测目的片段的有无。样品为蝴蝶兰的基因组DNA,经限制性内切酶酶切后的核苷酸片段。
本发明还提供了一种用于检测PhAGCu基因在蝴蝶兰原植株组织中表达分布状况的方法。取小块组织材料,经多聚甲醛处理和梯度脱水,包埋于石蜡组织中。实验检测时取复水和蛋白酶K处理过的切片与事先制备的DNA探针分子在杂交液中混合杂交,显色后观察拍照。而杂交使用的DNA探针分子为包含于PhAGCu基因的某特异区段(3’UTR,约25bp)的DNA序列。
本发明还提供了一种将上述的编码具有蝴蝶兰PhAGCu基因转入烟草以改变成花过程和形态建成的方法,具体步骤如下:
(1)将编码蝴蝶兰PhAGCu基因的核苷酸序列可操作的连接植物表达载体,形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体;
(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌,并将菌液与烟草叶片混合培养。
(3)通过抗生素筛选,PCR鉴定,获得转化细胞并再生转基因植株。
附图说明
图1 PhAGCu基因和其它AG-like基因的***进化分析。利用PAUP软件,依据这些基因保守区的核苷酸序列,构建最大简约树。PhAGCu属于C族基因,并且与单子叶植物类群具有更近的亲缘关系。其他的C类基因如PLE、pMADS3、FBP6等构成了双子叶类群。其余AG-like基因则形成D族基因,同样的,也聚类为单子叶植物以及双子叶植物两大类。
图2蝴蝶兰中PhAGCu基因的Southern blot分析。B、D分别为消化基因组DNA用的两种市售的酶BglII和DraI,右边数字代表分子量大小(kb,千碱基对)。
图3 RT-PCR显示PhAGCu在蝴蝶兰各器官中的表达模式。图中各字母简写分别代表如下:0,负对照;PLB,原球茎;R,根;St,茎;Le,叶;B,花蕾;P,花瓣;L,唇瓣;C,合蕊柱;Pe,花梗;Ov,胚珠;M,marker。
图4蝴蝶兰PhAGCu基因的原位杂交结果。A,花器官原基都开始发育的花蕾;B,第一个花原基开始萌出的花序分生组织群;C,其中一个花序分生组织;D,花器官都具备的花蕾;F,受精的子房(×40);E,正义探针杂交结果,为负对照。b,苞片;im,花序分生组织;fm,花芽分生组织;fp,花原基;se,萼片;pe,花瓣;c,合蕊柱;p,花粉块;1,唇瓣;lpj,唇瓣突起;r,蕊喙;o,胚珠;ow,子房壁。
图5转基因植株的潮霉素抗性基因(HYG)和目的基因(AG)的PCR鉴定。AG(4),AG(8)为PhAGCu转基因烟草株系编号。
图6转基因烟草的部分表型。A为转基因烟草的花序;B为转基因烟草叶片褶皱;C转基因烟草正常结实;D转基因烟草的花瓣正常;E对照烟草花序;FG转基因烟草柱头外露;H对照烟草的花瓣。
具体实施方式
下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解,这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法,均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆:实验手册(New York:Cold Spring Harbor Labortary Press,1989)中所述条件,或按照制造生产厂商的使用说明。
实施例1
蝴蝶兰PhAGCu基因的克隆
1蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)品种Formosa rosa来自上海农业科学院蔬菜园艺研究所;生长条件为光周期16h/8h(L/D),25℃。
2 RNA提取。取100毫克左右新鲜的材料,液氮充分研磨。加1mL TriBlue试剂,用力摇15s,室温放置5min。加0.2mL氯仿,去蛋白,上清转移至新的离心管,加等体积异丙醇,充分混匀,室温放置10min。用DEPC配制的75%乙醇1mL洗涤沉淀,重复一次。室温干燥5~10min,溶于20μL DEPC水中,测OD值,电泳检测。
3基因的克隆。以逆转录的蝴蝶兰花芽cDNA第一链为模板,利用正向引物PAGF和反向引物B25进行PCR,获得基因全长。具体序列信息参见SEQ ID NO.3。
实施例2
蝴蝶兰PhAGCu基因的拷贝数分析
用CTAB法抽取蝴蝶兰基因组,取10μgDNA分别用BglII(B)和DraI(D)两种市售的酶消化,37℃酶切过夜。以0.8%琼脂糖凝胶将酶切产物进行电泳分离,结果如图2所示。转移DNA并固定于尼龙膜上。探针杂交(由于MADS-box基因家族MADS盒的高度保守性,因此我们选择蝴蝶兰PhAGCu基因的特异区段3’UTR,约250bp)作为探针。确定其为单拷贝。
实施例3
蝴蝶兰PhAGCu基因表达模式分析
分别提取蝴蝶兰植株的根、叶片、花梗、花蕾以及花器官(花萼、翼瓣、唇瓣和蕊柱)的总RNA。测定OD260后定量取出1μg RNA,反转录.以特异引物进行PCR。反应产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离,电泳结果如图3所示。从电泳图中可以看出,基因PhAGCu只在植物生长的生殖器官表达,而在营养器官中没有表达。进一步对花蕾的各个器官分别检测,发现其在子房与合蕊柱中有表达。推测该基因与生殖器官的发育有着密切的关系,而不参与营养器官生长的调控。
实施例4
原位杂交
1取得较小的组织材料,以4%的多聚甲醛固定12小时。再以乙醇梯度脱水,包埋于石蜡块当中。
2将载玻片和盖玻片浸于铬酸洗液中2天,然后蒸馏水漂洗。再以多聚赖氨酸(PLL,1mg/ml)浸泡或涂片,7℃或42℃烘干备用。
3特异性探针分子为基因3’末端非转录区域一段特异的长约250bp的DNA序列。
4石蜡样品切片后脱腊,复水并以蛋白酶消化组织蛋白。经预杂交后与事先变性处理的探针分子在杂交液中50℃共浴16h。
5杂交后,以血清封闭探针,利用特异性抗体与杂交上的探针分子结合,并予染色。
6水溶性封片剂封片,显微观察并照相。
结果显示,在花发育的初期,PhAGCu在所有花器官原基中均有表达,不仅在合蕊柱中,在花瓣、唇瓣甚至萼片中也有表达(图4-A,B)。在花发育的稍后阶段,PhAGCu继续在合蕊柱和唇瓣中表达,其在胚珠中也有信号产生(图4-D,F),而在萼片和花瓣中消失。
实施例5
蝴蝶兰PhAGCu基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定
1含目的基因(蝴蝶兰PhAGCu基因)表达载体的构建
根据以蝴蝶兰PhAGCu基因全长编码序列,设计扩增出完整编码阅读框的引物,并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定),以便构建表达载体。
以实施例1中获得的扩增产物为模板,在5’端和3’端分别加入PstI和XbaI酶切位点。经XbaI和PstI双酶切的PCR产物与经过同样双酶切的pHB植物表达载体连接,转化,测序,确保开放读框正确。将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。
2利用叶盘法转化烟草
●用灭菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性克隆,接种于2mlYEB液体(利福平40mg/L,卡那霉素50mg/L,庆大霉素100mg/L),28℃200rpm振荡培养24-36h;
●室温下4000g离心10min;
●弃上清,菌体用1/2MS液体培养基重悬,稀释到原体积的5-20倍,使OD600=0.5左右;
●取生长两周左右的烟草的无菌叶片,去其叶主脉,将其剪成约1平方厘米见方的小叶片;
●将叶片放入制备好的菌液中,浸泡2-5min,在无菌滤纸上吸干菌液;
●将侵染的叶片放于MS培养基上,28℃暗培养48h;
●将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+潮霉素50mg/L+cef250mg/L)上,25-28℃光照下培养,7-15天见愈伤组织形成;
●约20天后可见分化芽长出,待芽长大后,切下,置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+潮霉素50mg/L+cef 250mg/L);
●待根系发达后,将植株取出,用无菌水洗净附着的固体培养基,移入土壤中,温室中培养。
3转基因植株的分子鉴定
以SDS方法小量抽提部分转基因植株的基因组DNA,根据载体上潮霉素抗性基因和目的基因序列设计引物,进行PCR检测(部分结果),检测结果如图5所示。PCR结果都表明携带有外源蝴蝶兰PhAGCu基因的表达质粒已经***到烟草基因组中。
4转基因植株进行表型鉴定
与转空载的烟草花相比转基因烟草的花序多且小,叶片多褶皱。柱头长,伸出花筒之外。花瓣形状正常,能够正常结实,但种子少。相比下,转空载烟草花序正常,大,花型与结实均正常。转基因烟草的部分表型如图6所示。根据结果推测外源PhAGCu基因在宿主烟草中实现了超量表达,影响了转基因植株柱头、雄蕊等的发育。试验结果表明,实施例1中得到的蝴蝶兰PhAGCu基因为有功能的基因,可以影响植株有性器官的发育。
序列表
SEQ ID NO.1:
ATGGACTCTTCAAGCATGGAGCCGAAGGAGAAGATGGGGAGGGGGAAGATAGAGATCAAGAGAATAGAGAACA
CAACAAACAGACAAGTCACCTTTTGCAAGCGCCGTAATGGCCTCCTGAAGAAGGCTTATGAGCTCTCTGTTCTGTGT
GATGCTGAGGTTGCCCTAATCATCTTCTCTACCCGTGGCCGCCTCTATGAATATGCAAACAACAGCGTGAAAGGAAC
CATTGAACGATACAAAAAGGCAAGCACTGATAATTCCAACACTGGATCAATATCTGAAGCAAATTCGCAGTATTACC
AACAAGAGGCCACAAAACTGCGTCAGCAAATTACAAACTTACAGAATTCCAACAGGAATTTGCTGGGTGATGCTCTC
ACCACCATGAGCCTGAGGGACCTGAAGCAACTGGAAACAAGATTGGAGAAAGGCATCAACAAAATAAGAGCTAAGAA
GAATGAACTGCTGCATGCTGAGATTGACTACATGCAGAAAAGGGAAATGGAACTCCAAACTGACAACATGTTTCTGC
GCAATAAGATATCTGATAATGAAAGAGCACAGCAGCAGCATCAGCATATGAGCATATTGCCATCAACAAGCACAGAG
TATGAAGTGATGCCTCCATTTGATTCCAGAAGCTTTCTTCATGTCAATCTAATGGATCCCAATGACCGTTATTCCCA
CCAGCAGCAAACAGCTCTGCAACTTGGGTGATGGGGAGGTTGCTGCAACTATAGTAGTTGTGATGGCATTCTGAAGT
ATGAGAAGGAAATATATTTGGTATGTTTTGTAAGAAGATGTGTAATAGAGTTTTATATGTATTATTATATGGAACAT
TGATCAGTTGGAAGCTGTGGTGTTTTAGGGTTGTTGGATGTTGAGACTTTATATATTGTTAAGCATATTAATATATA
AACATAACCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO.2:
MDSSSMEPKEKMGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSTRGRLYEYANNSV
KGTIERYKKASTDNSNTGSISEANSQYYQQEATKLRQQITNLQNSNRNLLGDALTTMSLRDLKQLETRLEKGINKIR
AKKNELLHAEIDYMQKREMELQTDNMFLRNKISDNERAQQQHQHMSILPSTSTEYEVMPPFDSRSFLHVNLMDPNDR
YSHQQQTALQLG
SEQ ID NO.3:
正向引物PAGF:5’-ATGGACTCTTCAAGCATGGAGCCGA-3’;
反向引物为依B26设计的B25:5’-GACTCGAGTCGACATCGA-3’
Claims (1)
1.一种将编码具有蝴蝶兰PhAGCu基因转入烟草以改变花发育的方法,具体步骤如下:
(1)将编码蝴蝶兰PhAGCu基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1可操作的连接于植物表达载体,形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体;
(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌,并将菌液与烟草叶片混合培养;
(3)通过抗生素筛选,PCR鉴定,获得转化细胞并再生转基因植株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2007100471832A CN101250532B (zh) | 2007-10-18 | 2007-10-18 | 蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2007100471832A CN101250532B (zh) | 2007-10-18 | 2007-10-18 | 蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101250532A CN101250532A (zh) | 2008-08-27 |
CN101250532B true CN101250532B (zh) | 2011-04-06 |
Family
ID=39954131
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2007100471832A Expired - Fee Related CN101250532B (zh) | 2007-10-18 | 2007-10-18 | 蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101250532B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101492742B (zh) * | 2009-02-04 | 2011-06-22 | 中国科学院植物研究所 | 获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物 |
CN113684298A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-23 | 中山大学 | 一种用于鉴定墨兰蝶瓣相关性状的引物、试剂盒及方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1769457A (zh) * | 2005-09-15 | 2006-05-10 | 复旦大学 | 蝴蝶兰pPI15编码序列及其应用 |
-
2007
- 2007-10-18 CN CN2007100471832A patent/CN101250532B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1769457A (zh) * | 2005-09-15 | 2006-05-10 | 复旦大学 | 蝴蝶兰pPI15编码序列及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Song IJ 等.BAE80120.1.GenBank:BAE80120.1.2006, |
Song IJ等.BAE80120.1.GenBank:BAE80120.1.2006, * |
Zhang T 等.ABF61451.1.GenBank:ABF61451.1.2007, |
Zhang T 等.DQ534013.1.GenBank:DQ534013.1.2007, |
Zhang T等.ABF61451.1.GenBank:ABF61451.1.2007, * |
Zhang T等.DQ534013.1.GenBank:DQ534013.1.2007, * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101250532A (zh) | 2008-08-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107602681B (zh) | 水稻粒宽基因gw5l及其应用 | |
CN102485897B (zh) | 利用棉花基因GbF3H改变花瓣颜色 | |
CN109456982B (zh) | 水稻OsMYB6基因及其编码蛋白在抗旱和抗盐中的应用 | |
CN112626080B (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
CN109797157B (zh) | 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用 | |
CN104004768B (zh) | 一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用 | |
CN101123870A (zh) | 用于产生具有增加的角质层水透过性的植物的分离多肽以及编码该多肽的多核苷酸 | |
CN109081865B (zh) | 毛竹PeVQ28蛋白及其编码基因与应用 | |
CN108948169B (zh) | 一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用 | |
CN112322633B (zh) | 一种水稻根结线虫抗性基因OsBetvI及其应用 | |
CN101935342B (zh) | 蝴蝶兰花发育B族基因-PhAP3编码序列及其应用 | |
CN106749580B (zh) | 植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用 | |
CN111171127B (zh) | 紫云英lhy基因及其应用 | |
CN110452917B (zh) | 野葡萄VyGOLS基因及其编码蛋白在干旱胁迫中的应用 | |
CN101250532B (zh) | 蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 | |
CN101200722A (zh) | 蝴蝶兰orap11基因编码序列及其应用 | |
CN102477435A (zh) | 利用枳转录因子基因PtrABF提高植物抗旱能力 | |
CN104178498B (zh) | 棉花GhMYC1转录因子及其编码基因和应用 | |
CN107312077B (zh) | 蜡梅CpSOC1基因及其编码的蛋白和应用 | |
CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
CN105175522B (zh) | 百脉根ap2/erf转录因子及其编码基因和应用 | |
CN101883572A (zh) | 高粱铝耐受基因SbMATE | |
CN111500604A (zh) | 铁皮石斛DcCSLA8基因及其在促进植物多糖的合成中的应用 | |
CN102533788B (zh) | 可提高水稻生殖期抗旱性的eadt1基因,编码序列和应用 | |
CN110358774A (zh) | 控制水稻开花时间的基因、蛋白质、基因表达盒、表达载体、宿主细胞、方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110406 Termination date: 20131018 |